Un metodo rapido per quantificare l’acetato libero e legato basato su alchilazione e analisi GC-MS

Descrizione del metodo

Abbiamo sviluppato un metodo robusto e high-throughput per la quantificazione assoluta dell’acetato in campioni biologici. Il metodo si basa sulla derivatizzazione utilizzando una reazione consolidata con cloroformiato di metile (MCF). Dopo aver aggiunto sequenzialmente standard interno, 1-propanolo, piridina e idrossido di sodio, la reazione di derivatizzazione viene avviata aggiungendo MCF appena possibile. La modifica chimica avviene in condizioni di base a causa della presenza di idrossido di sodio, mentre la piridina mantiene il sistema di reazione omogeneo come MCF non si dissolve in acqua da solo (Fig. 1). 1-Propanolo è usato come reagente di accoppiamento per produrre propil-acetato (Fig. 2). Quando l’idrossido di sodio viene aggiunto al campione raffreddato immediatamente prima dell’aggiunta di MCF, non si verifica alcuna idrolisi (vedi sotto). L’alchilazione dell’acetato con MCF facilita una rapida ulteriore modifica dell’acetato in condizioni di acqua. In questo caso, l’intermedio acetato-MCF (I) viene attaccato dall’alcol (1-propanolo), e l’intermedio risultante (II) subisce ulteriori riarrangiamenti, portando alla formazione di propil-acetato. Tali approcci di derivatizzazione utilizzando la famiglia di reagenti del cloroformiato sono ben descritti. Per quantificare la resa della derivatizzazione e successiva estrazione in MTBE, abbiamo confrontato l’intensità del segnale MS di 1 mM di acetato alchilato al propil-acetato ad una concentrazione equimolare di propil-acetato ottenuto commercialmente in MTBE. Su questa base, abbiamo trovato il recupero di essere 95,5 ± 1,57 % (Additional file 1: Tabella S1).

La reazione di derivatizzazione con MCF è vigorosa ed esotermica, produce gas (gas cloridrico, anidride carbonica) che fanno aumentare la pressione all’interno del tubo. Si consiglia quindi di seguire le regole generali di salute e sicurezza quando si esegue la derivatizzazione chimica, vale a dire, indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi, mentre si esegue la reazione in una cappa aspirante. Per ridurre al minimo il vigore della reazione e quindi la pressurizzazione, è importante incubare il campione in ghiaccio (5 min) prima della derivatizzazione. Si consiglia di tenere il coperchio chiuso con un dito durante il vortexing e di aprire accuratamente la provetta dopo (si può sentire un suono “popping”). In alternativa, il tubo può essere tenuto aperto durante il vortexing, a seconda delle preferenze del ricercatore (troviamo che il contenuto del tubo non si rovescia quando maneggiato con cura). In seguito, l’acetato derivatizzato (propil-acetato) può essere facilmente estratto in solvente organico (MTBE) seguito dall’analisi GC-MS (Fig. 1).

Altri alcoli primari (ad esempio, metanolo ed etanolo producendo acetato di metile ed etile, rispettivamente) può anche essere utilizzato per derivatizzazione. Tuttavia, abbiamo trovato che con la nostra colonna GC medio-polare (che troviamo per essere molto adatto per l’analisi di una vasta gamma di metaboliti), propil-acetato fornisce la forma di picco ottimale e tempo di ritenzione per analisi rapida. Il protocollo di preparazione del campione qui descritto è molto rapido con un tempo di derivatizzazione totale di meno di 1 min per campione. Insieme con il breve programma GC-MS con un tempo di esecuzione totale di 4 min per campione, questo facilita l’analisi high-throughput. Mentre gli isotopologi acetato 12C-acetato, U-13C-acetato, e 2H3-acetato hanno tempi di ritenzione quasi identici, i loro picchi possono essere facilmente deconvoluti utilizzando ioni specifici (Fig. 3). Come si osserva generalmente nell’analisi GC di analiti deuterati, il derivato 2H3-acetato ha un tempo di ritenzione leggermente più breve a causa dell’effetto isotopo inverso. Gli ioni m/z 61, 63 e 64 per 12C2-acetato, U-13C2-acetato e 2H3-acetato, rispettivamente, sono stati utilizzati per la quantificazione assoluta e hanno mostrato una risposta lineare ottimale.

Convalida del metodo

Per valutare la ripetibilità della preparazione del campione e la procedura di analisi, abbiamo determinato la deviazione standard relativa (RSD) per 12C- e U-13C-acetato in standard appena preparati a 50, 200, e 1000 μM per i rispettivi isotopologi acetato. Il metodo ha mostrato un’eccellente ripetibilità con una RSD < 5 % per gli standard e < 10 % per i campioni biologici (Additional file 1: tabella S2). L’intervallo lineare di quantificazione è stato valutato mediante l’analisi di standard diluiti in serie di entrambi 12C- e U-13C-acetato entro l’intervallo 2-2000 μM. Non siamo stati in grado di determinare il limite di rilevazione (LOD) per 12C-acetato come un segnale di fondo acetato di circa 15 μM era sempre presente nei nostri campioni, anche se solo reagenti di massima purezza sono stati utilizzati. Sembra che l’acetato sia un contaminante in tracce comune nell’atmosfera e nei reagenti, nonché nella plastica e nella vetreria, simile a quello che è stato osservato per gli acidi grassi a catena più lunga. Per indagare ulteriormente su questo, abbiamo cercato di determinare le fonti esatte di acetato di fondo (file aggiuntivo 1: Figura S1). Come analizziamo acetato nella sua forma derivatizzata propil-acetato, il segnale di fondo che comunemente osserviamo potrebbe essere sia da propil-acetato direttamente o da acetato sfondo che è derivatizzato a propil-acetato durante la preparazione del campione. Per esaminare la presenza di propil-acetato di fondo, abbiamo eseguito un esperimento sia in plastica che in vetro dove abbiamo analizzato il livello di propil-acetato nei reagenti utilizzati per la derivatizzazione chimica. Abbiamo osservato che l’1-propanolo ha il più alto propil-acetato di fondo, ma che rappresenta solo il ~10% dell’acetato di fondo osservato nei bianchi di procedura (PB, cioè campioni bianchi che sono stati sottoposti all’intera preparazione del campione e alla procedura di analisi dello spettro di massa), indicando che l’acetato libero, piuttosto che il propil-acetato è il contaminante principale. Purtroppo, tutti i reagenti sono necessari per la derivatizzazione, quindi non siamo in grado di determinare quale reagente contiene la maggior parte dell’acetato di fondo. Tuttavia, abbiamo eseguito l’intera procedura di derivatizzazione ed estrazione su campioni bianchi in provette di vetro e di plastica. Abbiamo scoperto che nella plastica, il fondo di acetato risultante è ~50% più alto che nel vetro. A causa della sua convenienza, preferiamo ancora lavorare con tubi di plastica e lasciamo questa decisione al ricercatore individuale.

A prescindere dal fondo acetato, come la risposta ha dimostrato altamente lineare, siamo stati in grado di sottrarre il segnale di fondo (quantifichiamo fondo acetato utilizzando campioni bianchi che sono stati sottoposti alla preparazione del campione intero e la procedura di analisi spec. di massa, cioè, i bianchi di procedura), con conseguente gamma dinamica lineare da 2 a 2000 μM sia per 12C-acetato e U-13C-acetato. Il limite determinato di quantificazione (LOQ) per U-13C-acetato era 0,1 μM. Per mantenere la contaminazione 12C-acetato al minimo, si consiglia di preparare reagenti freschi regolarmente (settimanale), e si consiglia anche di includere i blanks procedura di routine. Da notare, suggeriamo agli utenti di quantificare il proprio segnale di fondo acetato come dipende dai materiali e reagenti utilizzati e, quindi, è molto probabile che sia laboratorio-specifico.

Consideriamo il nostro approccio per essere un’alternativa ottimizzata ad altri metodi di derivatizzazione pubblicati, per la misurazione rapida di acetato. Un approccio basato sulla sililazione dell’acetato con N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) ha mostrato un ampio intervallo lineare per la quantificazione dell’acetato (0-3500 μM), alta ripetibilità e bassa deviazione standard relativa (RSD < 5 %). Tuttavia, non è adatto per l’elaborazione di campioni a base di acqua, le molteplici fasi di estrazione possono portare ad alti livelli di acetato di fondo, e il tempo di esecuzione della MS è lungo per l’analisi del solo acetato. Un approccio basato sull’alchilazione con cloroformiato di propile (PCF) è simile al nostro per quanto riguarda la metodologia e le prestazioni analitiche, ma utilizza volumi di reagenti più grandi (che aumenta il rischio di alti livelli di fondo di acetato) e tempi di esecuzione MS più lunghi in quanto non è stato ottimizzato per l’acetato specificamente, e non menziona il formiato. Il limite inferiore di quantificazione pubblicato era paragonabile al nostro metodo (15 μM per il metodo attuale contro 16 μM riportato da Zheng et al.) Zheng et al. riportato gamma più ampia di risposta lineare, cioè, 16 μM-8 mM. Non abbiamo testato oltre 2 mM come non abbiamo osservato tali livelli elevati in un contesto fisiologico. La ripetibilità riportato è stato osservato per essere molto simile con 0,54% RSD (n = 6) riportato da Zheng et al. , e ~ 0,7% RSD (n = 3) a seconda della concentrazione di acetato, riportato nel metodo corrente per i campioni standard (deviazioni standard relative riassunte nel file aggiuntivo 1: Tabella S2). Infine, un altro metodo basato su GC-MS per l’analisi degli acidi grassi a catena corta utilizzato 2,4-difluoroanilina e 1,3-diclocarbodiimide come reagenti di condensazione, che ha richiesto 1-h fase di incubazione. Nel complesso, il lavoro presentato qui contribuisce a quanto segue, oltre ai metodi già pubblicati: (1) un metodo ottimizzato per l’acetato così come un metodo adattato per misurare il formiato, (2) una discussione approfondita su acetato di fondo, le sue fonti potenziali, e come trattare con esso in modo pratico, e (3) un approccio per non solo misurare acetato libero ma anche legato acetato.

Il protocollo di preparazione del campione comprende l’aggiunta di idrossido di sodio per facilitare la reazione di alchilazione. Mentre questo accade immediatamente prima della reazione di derivatizzazione e i campioni sono raffreddati, questo potrebbe potenzialmente portare a idrolisi indesiderata di bio-molecole acetilate, portando a livelli aumentati di acetato libero. Per testare se questo si verifica, abbiamo eseguito la preparazione del campione e l’analisi su soluzioni da 10 mM di acido N-acetil-l-aspartico (NAA) e N-acetil-l-cisteina (NAC), 1 g/L di BSA così come i bianchi di procedura. Poiché l’acetilazione degli aminoacidi è la fonte più abbondante di acetato legato, e non abbiamo osservato un aumento significativo del segnale, concludiamo che il contributo dell’acetato legato idrolizzato è trascurabile (Fig. 4).

Quantificazione dell’acetato in campioni biologici

Avendo stabilito che il nostro metodo può quantificare accuratamente e riproducibilmente l’acetato, abbiamo voluto determinare se può riprodurre i risultati precedentemente stabiliti. Abbiamo quindi quantificato l’acetato nel plasma di otto individui sani. Le concentrazioni di acetato nel plasma variavano da 20 a 51 μM con una concentrazione mediana di 34,1 ± 9,0 μM (dati non mostrati). Questo rientra nei valori precedentemente pubblicati di 41.9 ± 15.1 μM e 30.4 ± 9.0 μM (Human Metabolome Database ).

Di recente, molteplici studi hanno identificato un ruolo importante per l’enzima acetil-CoA sintetasi 2 (ACSS2) nel mediare la crescita tumorale durante le condizioni ipossiche e nutrienti limitati. ACSS2 “attiva” l’acetato in AcCoA in modo che possa essere utilizzato per reazioni metaboliche a valle, compresa la lipogenesi. Infatti, l’aggiunta di U-13C-acetato al mezzo di cellule tumorali coltivate ha rivelato un aumento dell’etichettatura dell’AcCoA lipogenico, e di conseguenza degli acidi grassi, in condizioni ipossiche rispetto a quelle normossiche. Tuttavia, in che misura questo aumento di etichettatura è causato da un aumento dell’assorbimento dell’acetato rimane sconosciuto. Per affrontare questo problema, abbiamo coltivato cellule di carcinoma polmonare A549 in condizioni normossiche o ipossiche (1 % O2) in mezzo contenente 500 μM U-13C-acetato, e seguito la sua concentrazione nel tempo utilizzando il nostro nuovo metodo (Fig. 5). Coerentemente con l’etichettatura osservata di AcCoA lipogenico da U-13C-acetato, è stato osservato un robusto consumo di U-13C-acetato da parte delle cellule ipossiche, come evidenziato da una chiara riduzione nel mezzo. Sorprendentemente, mentre l’etichettatura dell’AcCoA lipogenico in condizioni di normoxia è notevolmente inferiore a quella dell’ipossia, le cellule normoxiche hanno anche mostrato un consumo avido di U-13C-acetato. I tassi di assorbimento dell’acetato per le cellule ipossiche erano con 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL cellule (PCV) modestamente superiori a quelli delle cellule normossiche (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL cellule). Questi risultati suggeriscono che l’aumento dell’etichettatura dell’AcCoA lipogenica da U-13C-acetato in ipossia (aumento di ~ 3 volte, dati non mostrati) non può essere completamente spiegato da un aumento dell’assorbimento dell’acetato. Invece, l’etichettatura aumentata è probabilmente in parte causata da un calo della produzione di AcCoA lipogenica dal glucosio nelle cellule ipossiche, portando all’inflazione del contributo relativo da acetato. Stiamo indagando ulteriormente su questo aspetto.

Concentrazione di acetato libero nei tessuti e nei fluidi del topo

Esperimenti di tracciatura isotopica in vivo hanno dimostrato l’utilizzo di acetato esogeno da parte dei tumori, confermando un ruolo critico per ACSS2 nel mediare la crescita in vari tumori. Tuttavia, la disponibilità di acetato per i tumori solidi e come questo varia tra gli organi ospiti rimane in gran parte sconosciuto. Nel tentativo di affrontare questo, abbiamo analizzato i tessuti da più organi del mouse (C57BL/6) (cuore, rene, fegato, polmone, pancreas, milza, timo) così come il plasma e le urine (Fig. 6). Di tutti gli organi analizzati, il fegato conteneva la più alta concentrazione di acetato libero con una concentrazione media di 1,0 ± 0,1 nmole di acetato per mg di tessuto (cioè, ~ 1 mM), più del doppio di qualsiasi altro tessuto. I nutrienti assorbiti dall’intestino passano prima nel fegato attraverso la vena porta. Alte concentrazioni millimolari di acetato e altri acidi grassi a catena corta sono stati segnalati per essere generati dal microbiota intestinale, e questo fornisce un motivo per l’alta concentrazione di acetato nel fegato. Poiché la concentrazione di acetato nel fegato è molto più alta che nella circolazione sistemica (cioè nel plasma) e nei polmoni, che contengono il primo sistema capillare ad essere perfuso dal sangue dopo il passaggio del fegato, il fegato sembra catturare notevoli quantità di acetato per uso metabolico. L’acetato era anche notevolmente arricchito nel pancreas e nei reni rispetto al plasma, con concentrazioni di 0,5 ± 0,04 e 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 e 0,4 mM), rispettivamente. La ragione dell’alto acetato nel pancreas rimane da chiarire. Una funzione dei reni è quella di eliminare dal sangue gli eccessi idrosolubili o i metaboliti tossici e, considerando che la concentrazione di acetato nelle urine è sostanzialmente più alta di quella nel plasma, l’acetato potrebbe essere attivamente espulso dal corpo come “rifiuto” metabolico. I livelli di acetato erano notevolmente inferiori in altri tessuti, con il valore più basso trovato nella milza ad una concentrazione simile a quella del plasma. Insieme, queste osservazioni evidenziano che la disponibilità di acetato può variare considerevolmente tra gli organi, il che ha implicazioni per il metabolismo tumorale.

Analisi dell’acetato legato nelle frazioni (sub)cellulari e istoniche

L’AcCoA occupa un nodo centrale nel metabolismo ed è coinvolto nella sintesi della biomassa, nei percorsi catabolici e nella produzione di energia. Per questo motivo, l’AcCoA gioca un ruolo importante nella regolazione metabolica. Questo avviene in parte attraverso l’acetilazione delle biomolecole, compresa una varietà di proteine. Per esempio, l’acetilazione degli istoni promuove la trascrizione dei geni ed è stata osservata una correlazione tra il grado di acetilazione degli istoni e l’aggressività dei tumori. Un’ulteriore prova dell’importanza dell’omeostasi dell’acetilazione nella progressione del cancro proviene dall’osservazione che l’interruzione delle dinamiche di acetilazione attraverso l’inibizione delle deacetilasi (cioè, HDACs, sirtuine) porta ad una potente induzione della morte delle cellule tumorali. Mentre diversi aspetti dell’acetilazione sono stati ampiamente studiati, molto rimane sconosciuto sulle dimensioni assolute del pool e sul turnover dell’acetato legato alle biomolecole nei vari compartimenti cellulari, per non parlare di come sono influenzati dalle condizioni rilevanti per il tumore. Per affrontare questo, abbiamo combinato il nostro approccio con l’idrolisi in condizioni di base. Riscaldando i campioni e incubandoli durante la notte con idrossido di sodio, i legami esteri si idrolizzano, rilasciando acetato libero, che può quindi essere derivatizzato e analizzato come prima. Utilizzando questo approccio su un estratto di cellule intere ci ha permesso di quantificare totale (legato + libero) acetato in cellule A549 a 0,38 μmole/mg di proteina cellulare totale. Abbiamo poi chiesto se sarebbe stato possibile quantificare l’acetato legato in compartimenti cellulari separati. Abbiamo ottenuto una separazione quasi completa delle frazioni cellulari nucleari e residue (combinazione di citosol e organelli diversi dal nucleo) utilizzando un kit commerciale di isolamento nucleare (vedi sezione “Metodi”) (Fig. 7b). Abbiamo trovato che il contenuto di acetato legato era approssimativamente uguale per le frazioni nucleare e residuo (Fig. 7c). La somma di entrambe le frazioni uguale ~ 80 % della misura della cellula intera, che è molto probabilmente causata da un recupero ridotto durante il frazionamento, ma può anche essere causato dalla perdita di acetato libero. Esprimere il contenuto di acetato per mg di proteine in ogni frazione ha rivelato che la densità di acetilazione nel nucleo è circa tre volte superiore a quella della frazione di cellule residue (Fig. 7d). Gli istoni sono noti per essere pesantemente acetilati, e per determinare quanto dell’acetato nucleare era legato agli istoni, abbiamo confrontato i risultati dell’approccio di isolamento nucleare con un protocollo pubblicato di estrazione degli istoni acidi (Fig. 7e-g). Entrambi gli approcci hanno dato valori molto simili, indicando che quasi tutto l’acetato legato nella frazione nucleare è dovuto all’acetilazione dell’istone. Così, acetilazione istone da solo rappresenta la metà del totale acetato cellulare.

Questo approccio alla quantificazione dell’acetato legato agli istoni può aiutare a comprendere meglio l’effetto dell’acetilazione degli istoni in vari studi sul cancro. Per dimostrare l’utilità dell’approccio, abbiamo trattato le cellule A549 con panobinostat, un inibitore della pan-istone deacetilasi (HDAC). Un breve, 4 ore di incubazione con panobinostat ha causato un quasi raddoppio della quantità di acetato legato all’istone, dimostrando che il fatturato acetilazione istone è abbastanza veloce (Fig. 7h).

Misurazione formiato e altri acidi grassi a catena corta

Modificando l’agente di derivatizzazione, il metodo è facilmente adattabile ad altri acidi grassi a catena corta, tra cui formiato. Accoppiamento formiato con alcool benzilico genera derivato formiato (benzil formiato), che può essere facilmente analizzato da GC-MS (vedi procedure sperimentali supplementari file aggiuntivo 1: S1). Abbiamo accennato prima che il metodo GC-MS per l’analisi dell’acetato richiede solo 4 min, con rivelatore di massa operativo tra 2.2 e 2.7 min. Lo stesso metodo è in grado di analizzare e quantificare propionato e butirrato in forma di propil-propionato e propil-butirrato utilizzando la stessa impostazione del metodo di derivatizzazione del campione come per l’acetato. Estendendo il tempo di funzionamento del rivelatore di massa da 2,2 a 4 min, siamo stati in grado di rilevare i picchi di propionato e butirrato che eluiscono a 2,92 e 3,30 min, rispettivamente. Utilizzando gli ioni m/z 75 e 89 per propionato e butirrato, rispettivamente, è possibile quantificare assolutamente questi acidi grassi a catena corta.