En hurtig metode til kvantificering af fri og bundet acetat baseret på alkylering og GC-MS analyse

Metodebeskrivelse

Vi har udviklet en robust og højhastighedsmetode til absolut acetatkvantificering i biologiske prøver. Metoden er baseret på derivatisering ved hjælp af en etableret reaktion med methylchloroformiat (MCF) . Efter sekventielt at have tilsat intern standard, 1-propanol, pyridin og natriumhydroxid, initieres derivatiseringsreaktionen ved at tilsætte MCF så hurtigt som muligt. Den kemiske modifikation sker under basiske forhold på grund af tilstedeværelsen af natriumhydroxid, mens pyridin holder reaktionssystemet homogent, da MCF ikke opløses i vand alene (fig. 1). 1-Propanol anvendes som et koblingsreagens til fremstilling af propylacetat (fig. 2). Når natriumhydroxid tilsættes til den afkølede prøve umiddelbart før tilsætning af MCF, sker der ingen hydrolyse (se nedenfor). Alkylering af acetat med MCF muliggør en hurtig yderligere modifikation af acetat under vandbaserede forhold. I dette tilfælde angribes acetat-MCF-mellemproduktet (I) af alkoholen (1-propanol), og det resulterende mellemprodukt (II) undergår yderligere omlejringer, hvilket fører til dannelse af propylacetat. Sådanne derivatiseringsmetoder ved hjælp af chloroformatfamilien af reagenser er velbeskrevet . For at kvantificere udbyttet af derivatiseringen og den efterfølgende ekstraktion i MTBE sammenlignede vi MS-signalintensiteten af 1 mM acetat, der er alkyleret til propylacetat, med en ækvimolær koncentration af kommercielt fremstillet propylacetat i MTBE. På grundlag heraf fandt vi, at genfindingen var 95,5 ± 1,57 % (Additional file 1: Table S1).

Derivatiseringsreaktionen med MCF er kraftig og eksotermisk og producerer gasser (saltsyregas, kuldioxid), som får trykket til at stige i røret. Vi anbefaler derfor, at man følger de generelle sundheds- og sikkerhedsregler, når man udfører kemisk derivatisering, dvs. at man bærer en laboratoriekittel, handsker og beskyttelsesbriller, mens man udfører reaktionen i en emhætte. For at minimere reaktionens styrke og dermed trykforøgelsen er det vigtigt at inkubere prøven på is (5 min) før derivatisering. Vi anbefaler at holde låget lukket med en finger under vortexing og at åbne røret forsigtigt bagefter (der kan høres en “popping”-lyd). Alternativt kan røret holdes åbent under vortexningen, afhængigt af forskerens præference (vi finder, at rørets indhold ikke spildes, når det håndteres forsigtigt). Herefter kan det derivatiserede acetat (propylacetat) let ekstraheres i organisk opløsningsmiddel (MTBE) efterfulgt af GC-MS analyse (fig. 1).

Andre primære alkoholer (f.eks. methanol og ethanol, der producerer henholdsvis methyl- og ethylacetat) kan også anvendes til derivatisering. Vi fandt imidlertid, at med vores midtpolære GC-kolonne (som vi finder meget velegnet til analyse af en bred vifte af metabolitter) giver propylacetat den optimale topform og retentionstid for hurtig analyse. Den her beskrevne prøveforberedelsesprotokol er meget hurtig med en samlet derivatiseringstid på mindre end 1 min pr. prøve. Sammen med det korte GC-MS-program med en samlet kørselstid på 4 min pr. prøve muliggør dette en analyse med høj gennemstrømning. Selv om acetat-isotopologerne 12C-acetat, U-13C-acetat og 2H3-acetat har næsten identiske retentionstider, kan deres toppe let dekonvoluteres ved hjælp af specifikke ioner (fig. 3). Som det generelt observeres ved GC-analyse af deutererede analytter, har 2H3-acetatderivatet en lidt kortere retentionstid på grund af den omvendte isotopvirkning . Ionerne m/z 61, 63 og 64 for henholdsvis 12C2-acetat, U-13C2-acetat og 2H3-acetat blev anvendt til absolut kvantificering og viste optimal lineær respons.

Metodevalidering

For at vurdere gentageligheden af prøveforberedelsen og analyseproceduren bestemte vi den relative standardafvigelse (RSD) for 12C- og U-13C-acetat i friskfremstillede standarder ved 50, 200 og 1000 μM for de respektive acetatisotopologer. Metoden viste fremragende repeterbarhed med en RSD < 5 % for standarder og < 10 % for biologiske prøver (Additional file 1: Tabel S2). Det lineære kvantificeringsområde blev vurderet ved analyse af serielt fortyndede standarder af både 12C- og U-13C-acetat inden for området 2-2000 μM. Vi var ikke i stand til at bestemme detektionsgrænsen (LOD) for 12C-acetat, da der altid var et baggrundssignal af acetat på ca. 15 μM i vores prøver, selv om der kun blev anvendt reagenser af den højeste renhed. Det ser ud til, at acetat er en almindelig sporforurening i atmosfæren og reagenserne samt i plastik og glasvarer, i lighed med det, der er blevet observeret for længere kæde fedtsyrer . For at undersøge dette yderligere forsøgte vi at bestemme de nøjagtige kilder til baggrundsacetat (Additional file 1: Figur S1). Da vi analyserer acetat i dets derivatiserede propylacetatform, kan det baggrundssignal, som vi almindeligvis observerer, enten stamme fra propylacetat direkte eller fra baggrundsacetat, der er derivatiseret til propylacetat under prøveforberedelsen. For at undersøge tilstedeværelsen af baggrunds-propyl-acetat udførte vi et eksperiment i både plastik- og glasvarer, hvor vi analyserede niveauet af propyl-acetat i reagenser, der anvendes til kemisk derivatisering. Vi observerede, at 1-propanol har den højeste baggrunds-propyl-acetat, men at det kun tegner sig for ~10 % af den baggrundsacetat, der er observeret i procedureblindprøver (PB, dvs. blindprøver, der har været underkastet hele prøveforberedelses- og massespektrometrianalyseproceduren), hvilket indikerer, at fri acetat snarere end propyl-acetat er det vigtigste forurenende stof. Desværre er alle reagenser nødvendige for derivatiseringen, så vi er ikke i stand til at bestemme, hvilken reagens der indeholder mest baggrundsacetat. Vi har dog udført hele derivatiserings- og ekstraktionsproceduren på blindprøver i både glas- og plastrør. Vi fandt, at i plast er den resulterende acetatbaggrund ~50 % højere end i glas. På grund af dens bekvemmelighed foretrækker vi stadig at arbejde med plastikrør, og vi overlader denne beslutning til den enkelte undersøger.

Uanset baggrundsacetat, da responsen viste sig at være meget lineær, var vi i stand til at trække baggrundssignalet fra (vi kvantificerer acetatbaggrund ved hjælp af blanke prøver, der har været underkastet hele prøveforberedelses- og massespektrometrianalyseproceduren, dvs. procedureblanke prøver), hvilket resulterede i et lineært dynamisk område fra 2 til 2000 μM for både 12C-acetat og U-13C-acetat. Den bestemte bestemmelsesgrænse for kvantificering (LOQ) for U-13C-acetat var 0,1 μM. For at holde kontaminering med 12C-acetat på et minimum anbefaler vi, at der regelmæssigt (ugentligt) fremstilles nye reagenser, og vi anbefaler også, at der rutinemæssigt medtages procedureblindprøver. Det skal bemærkes, at vi anbefaler brugerne at kvantificere deres eget baggrundssignal for acetat, da det afhænger af de anvendte materialer og reagenser, og det er derfor meget sandsynligt, at det er laboratoriespecifikt.

Vi anser vores fremgangsmåde for at være et optimeret alternativ til andre offentliggjorte derivatiseringsmetoder, til hurtig måling af acetat . En fremgangsmåde baseret på silylering af acetat med N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamid (MTBSTFA) viste et bredt lineært område for acetatkvantificering (0-3500 μM), høj repeterbarhed og lav relativ standardafvigelse (RSD < 5 %) . Den er dog ikke egnet til behandling af vandbaserede prøver, de mange ekstraktionstrin kan føre til høje baggrundsacetatniveauer, og MS-køringstiden er lang ved analyse af acetat alene. En metode baseret på alkylering ved hjælp af propylchlorformiat (PCF) ligner vores metode og analysepræstationer, men der anvendes større reagensmængder (hvilket øger risikoen for høje acetatbaggrundsniveauer) og længere MS-køretider, da den ikke er optimeret specifikt til acetat, og den nævner ikke formiat . Den offentliggjorte nedre grænse for kvantificering var sammenlignelig med vores metode (15 μM for den nuværende metode mod 16 μM rapporteret af Zheng et al. ). Zheng et al. rapporterede et bredere lineært responsområde, dvs. 16 μM-8 mM. Vi testede ikke mere end 2 mM, da vi ikke har observeret så høje niveauer i en fysiologisk sammenhæng. Den rapporterede repeterbarhed blev observeret som værende meget ens med 0,54 % RSD (n = 6) rapporteret af Zheng et al. og ~0,7 % RSD (n = 3) afhængigt af acetatkoncentrationen, rapporteret i den nuværende metode for standardprøver (relative standardafvigelser opsummeret i Additional file 1: Tabel S2). Endelig blev der ved en anden GC-MS-baseret metode til analyse af kortkædede fedtsyrer anvendt 2,4-difluoroanilin og 1,3-dicyclocarbodiimid som kondensationsreagenser, hvilket krævede 1 times inkubationstrin . Samlet set bidrager det arbejde, der præsenteres her, til følgende, ud over de allerede offentliggjorte metoder: (1) en optimeret metode for acetat samt en tilpasset metode til måling af formiat, (2) en dybtgående diskussion af baggrundsacetat, dets potentielle kilder, og hvordan man håndterer det på en praktisk måde, og (3) en tilgang til ikke kun at måle frit acetat, men også bundet acetat.

Proveforberedelsesprotokollen omfatter tilsætning af natriumhydroxid for at lette alkyleringsreaktionen. Selv om dette sker umiddelbart før derivatiseringsreaktionen, og prøverne afkøles, kan dette potentielt resultere i uønsket hydrolyse af acetylerede biomolekyler, hvilket kan føre til øgede niveauer af fri acetat. For at teste, om dette sker, udførte vi prøveforberedelse og analyse på 10 mM opløsninger af N-acetyl-l-asparaginsyre (NAA) og N-acetyl-l-cystein (NAC), 1 g/L BSA samt procedureblankoer. Da aminosyreacetylering er den hyppigste kilde til bundet acetat, og vi ikke observerede en signifikant stigning i signalet, konkluderer vi, at bidraget fra hydrolyseret bundet acetat er ubetydeligt (Fig. 4).

Acetatkvantificering i biologiske prøver

Når vi har fastslået, at vores metode kan kvantificere acetat nøjagtigt og reproducerbart, ønskede vi dernæst at afgøre, om den kan reproducere tidligere etablerede resultater. Vi kvantificerede derfor acetat i plasma fra otte raske personer. Plasmaacetatkoncentrationerne varierede fra 20 til 51 μM med en mediankoncentration på 34,1 ± 9,0 μM (data ikke vist). Dette falder inden for de tidligere offentliggjorte værdier på 41.9 ± 15.1 μM og 30.4 ± 9.0 μM (Human Metabolome Database ).

For nylig identificerede flere undersøgelser en vigtig rolle for enzymet acetyl-CoA-syntetase 2 (ACSS2) i formidling af tumorvækst under hypoxiske og næringsbegrænsede forhold . ACSS2 “aktiverer” acetat til AcCoA, således at det kan anvendes til nedstrøms metaboliske reaktioner, herunder lipogenese. Tilføjelse af U-13C-acetat til mediet af dyrkede kræftceller afslørede faktisk en øget mærkning af lipogen AcCoA og dermed fedtsyrer under hypoxiske forhold i forhold til normoxiske forhold . Det er dog stadig uvist, i hvilket omfang denne øgede mærkning skyldes en øget acetatoptagelse. For at løse dette spørgsmål dyrkede vi A549 lungekarcinomceller i normoxiske eller hypoxiske (1 % O2) forhold i et medium, der indeholdt 500 μM U-13C-acetat, og fulgte dets koncentration over tid ved hjælp af vores nye metode (Fig. 5). I overensstemmelse med den observerede mærkning af lipogen AcCoA fra U-13C-acetat blev der observeret et robust forbrug af U-13C-acetat af hypoxiske celler, som det fremgik af en klar reduktion i mediet. Det er overraskende, at mens mærkning af lipogen AcCoA under normoxiske forhold er betydeligt mindre end under hypoxi , udviste normoxiske celler også et stærkt forbrug af U-13C-acetat. Acetatoptagelseshastighederne for hypoxiske celler var med 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL celler (PCV) beskedent højere end for normoxiske celler (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL celler). Disse resultater tyder på, at den øgede mærkning af lipogen AcCoA fra U-13C-acetat ved hypoxi (~3-dobbelt stigning, data ikke vist) ikke fuldt ud kan forklares af øget acetatoptagelse. I stedet er den øgede mærkning sandsynligvis delvis forårsaget af et fald i produktionen af lipogen AcCoA fra glukose i hypoxiske celler, hvilket fører til en inflation af det relative bidrag fra acetat. Vi er i gang med at undersøge dette yderligere.

Fri acetatkoncentration i væv og væsker fra mus

In vivo isotopsporingsforsøg viste udnyttelse af eksogent acetat af tumorer , hvilket bekræfter en kritisk rolle for ACSS2 i formidling af vækst i forskellige kræftformer. Imidlertid er tilgængeligheden af acetat for solide tumorer, og hvordan dette varierer mellem værtsorganer, fortsat stort set ukendt. I et forsøg på at løse dette analyserede vi væv fra flere mus (C57BL/6) organer (hjerte, nyre, lever, lunge, bugspytkirtel, milt, thymus) såvel som plasma og urin (Fig. 6). Af alle de analyserede organer indeholdt leveren den højeste koncentration af frit acetat med en gennemsnitlig koncentration på 1,0 ± 0,1 nmole acetat pr. mg væv (dvs. ~1 mM), hvilket er mere end dobbelt så meget som i alle andre væv. Næringsstoffer, der absorberes af tarmen, passerer først gennem leveren via portvenen. Det er blevet rapporteret, at høje millimolære koncentrationer af acetat og andre kortkædede fedtsyrer dannes af tarmmikrobiotaen , og dette er en begrundelse for den høje acetatkoncentration i leveren. Da acetatkoncentrationen i leveren er meget højere end i den systemiske cirkulation (dvs. plasma) og i lungerne, som indeholder det første kapillarsystem, der perfunderes med blod efter leverpassagen, synes leveren at opsamle betydelige mængder acetat til metabolisk brug. Acetat var også betydeligt beriget i bugspytkirtlen og nyrerne i forhold til plasma, med koncentrationer på henholdsvis 0,5 ± 0,04 og 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 og 0,4 mM). Årsagen til den høje acetatkoncentration i bugspytkirtlen er endnu ikke klarlagt. En af nyrernes funktioner er at fjerne vandopløselige overskydende eller giftige metabolitter fra blodet, og da acetatkoncentrationen i urinen er betydeligt højere end i plasma, kan acetat faktisk være aktivt udskilt fra kroppen som metabolisk “affald”. Acetatniveauerne var betydeligt lavere i andre væv, idet den laveste værdi blev fundet i milten med en koncentration svarende til plasmakoncentrationen. Tilsammen understreger disse observationer, at tilgængeligheden af acetat kan variere betydeligt mellem organerne, hvilket har betydning for tumormetabolismen.

Analyse af bundet acetat i (sub)cellulære og histonfraktioner

AcCoA indtager et centralt knudepunkt i metabolismen og er involveret i biomassesyntese, kataboliske veje og energiproduktion. På grund af dette spiller AcCoA en vigtig rolle i metabolisk regulering . Dette sker til dels gennem acetylering af biomolekyler, herunder en række proteiner . F.eks. fremmer acetylering af histoner gentranskription, og der er blevet observeret en sammenhæng mellem graden af histonacetylering og tumoraggressivitet . Yderligere beviser for betydningen af acetyleringshomøostase i kræftprogressionen kommer fra observationen af, at forstyrrelse af acetyleringsdynamikken ved at hæmme deacetylaser (dvs. HDAC’er, sirtuiner) fører til kraftig induktion af kræftcelledød . Selv om flere aspekter af acetylering undersøges indgående, er der stadig meget uvist om de absolutte poolstørrelser og omsætningen af acetat bundet til biomolekyler i de forskellige cellekompartmenter, for slet ikke at tale om, hvordan de påvirkes af tumorrelevante forhold. For at løse dette kombinerede vi vores tilgang med hydrolyse under basiske forhold. Ved at opvarme prøverne og inkubere dem natten over med natriumhydroxid hydrolyseres esterbindinger, hvorved der frigives frit acetat, som derefter kan derivatiseres og analyseres som før. Ved at anvende denne fremgangsmåde på et helcelleekstrakt kunne vi kvantificere det samlede (bundne + frie) acetat i A549-celler ved 0,38 μmole/mg samlet celleprotein. Vi spurgte dernæst, om det ville være muligt at kvantificere bundet acetat i separate cellekompartmenter. Vi opnåede en næsten fuldstændig adskillelse af de nukleare og resterende cellulære fraktioner (kombination af cytosol og andre organeller end kernen) ved hjælp af et kommercielt kerneisoleringssæt (se afsnittet “Metoder”) (Fig. 7b). Vi fandt, at det bundne acetatindhold var omtrent lige stort for kerne- og restfraktionerne (fig. 7c). Summen af begge fraktioner svarede til ~80 % af helcellemålingen, hvilket højst sandsynligt skyldes reduceret genvinding under fraktionering, men kan også skyldes tab af frit acetat. Ved at udtrykke acetatindholdet pr. mg protein i hver fraktion viste det sig, at acetyleringstætheden i kernen er ca. tre gange højere end i den resterende cellefraktion (fig. 7d). Histoner er kendt for at være stærkt acetylerede, og for at bestemme, hvor meget af kerneacetatetaten der var histonbundet, sammenlignede vi resultaterne af kerneisolationsmetoden med en offentliggjort sur histonextraktionsprotokol (Fig. 7e-g) . Begge fremgangsmåder gav meget ensartede værdier, hvilket indikerer, at næsten al bundet acetat i kernefraktionen skyldes histonacetylering. Histonacetylering tegner sig således alene for halvdelen af den samlede cellulære acetat.

Denne tilgang til kvantificering af histonbundet acetat kan bidrage til bedre at forstå virkningen af histonacetylering i forskellige kræftrelaterede undersøgelser. For at demonstrere nytten af denne fremgangsmåde behandlede vi A549-celler med panobinostat, en pan-histon deacetylase (HDAC)-hæmmer. En kort inkubation på 4 timer med panobinostat forårsagede en næsten fordobling af mængden af histonbundet acetat, hvilket viser, at histonacetyleringsomsætningen er ret hurtig (Fig. 7h).

Måling af formiat og andre kortkædede fedtsyrer

Gennem ændring af derivatiseringsmidlet kan metoden let tilpasses til andre kortkædede fedtsyrer, herunder formiat. Ved kobling af format med benzylalkohol dannes formatderivat (benzylformiat), som let kan analyseres ved GC-MS (se supplerende eksperimentelle procedurer Additional file 1: S1). Vi har tidligere nævnt, at GC-MS-metoden til acetatanalyse kun tager 4 min. med en massedetektor, der arbejder mellem 2,2 og 2,7 min. Den samme metode er i stand til at analysere og kvantificere propionat og butyrat i form af propylpropionat og propylbutyrat ved hjælp af den samme opsætning af prøveafledningsmetoden som for acetat. Ved at forlænge massedetektorens driftstid fra 2,2 til 4 minutter var vi i stand til at detektere propionat- og butyrattoppene, der eluerer ved henholdsvis 2,92 og 3,30 minutter. Ved hjælp af ioner m/z 75 og 89 for henholdsvis propionat og butyrat er det muligt at kvantificere disse kortkædede fedtsyrer fuldstændigt.