Alkylointiin ja GC-MS-analyysiin perustuva nopea menetelmä vapaan ja sidotun asetaatin kvantifioimiseksi

Menetelmän kuvaus

Kehitimme robustin ja tehokkaan menetelmän absoluuttisen asetaatin kvantifioimiseksi biologisista näytteistä. Menetelmä perustuu derivatisointiin käyttäen vakiintunutta reaktiota metyylikloroformiaatin (MCF) kanssa . Kun sisäinen standardi, 1-propanoli, pyridiini ja natriumhydroksidi on lisätty peräkkäin, derivatisointireaktio aloitetaan lisäämällä MCF mahdollisimman pian. Kemiallinen muunnos tapahtuu emäksisissä olosuhteissa natriumhydroksidin läsnäolon vuoksi, kun taas pyridiini pitää reaktiojärjestelmän homogeenisena, koska MCF ei liukene pelkkään veteen (kuva 1). 1-Propanolia käytetään kytkentäreagenssina propyyliasetaatin tuottamiseksi (kuva 2). Kun jäähdytettyyn näytteeseen lisätään natriumhydroksidia välittömästi ennen MCF:n lisäämistä, hydrolyysiä ei tapahdu (ks. jäljempänä). Asetaatin alkylointi MCF:llä helpottaa asetaatin nopeaa jatkomodifiointia vesipohjaisissa olosuhteissa. Tällöin alkoholi (1-propanoli) hyökkää asetaatti-MCF-välikappaleen (I) kimppuun, ja syntyvästä välikappaleesta (II) tapahtuu uusia uudelleenjärjestelyjä, jotka johtavat propyyliasetaatin muodostumiseen. Tällaiset kloroformiaattiperheen reagensseja käyttävät derivatisointimenetelmät on kuvattu hyvin. Kvantifioidaksemme derivatisoinnin ja sitä seuraavan MTBE:hen uuttamisen tuoton vertasimme 1 mM propyyliasetaatiksi alkyloidun asetaatin MS-signaalin intensiteettiä 1 mM:n propyyliasetaattialkyloidun asetaatin ekvimolaariseen konsentraatioon kaupallisessa MTBE:ssä olevaa propyyliasetaattia. Tämän perusteella saannon todettiin olevan 95,5 ± 1,57 % (Additional file 1: Table S1).

Kuva 1

Kuva 1

Skeemaattinen esitys nopean asetaattimäärityksen työnkulusta. Näyteannos sekoitettiin sisäiseen standardiin natrium-2H3-asetaattiin, pyridiiniin (Py) ja 1-propanoliin (1-PrOH), minkä jälkeen se derivatisoitiin lisäämällä natriumhydroksidia ja metyylikloroformiaattia (MCF). Derivoimisen jälkeen näyte sekoitettiin metyyli-tert-butyylieetteriin (MTBE) ja vorteksoitiin asetaattijohdannaisen (propyyliasetaatti) uuttamiseksi. Tämän jälkeen näyte pyöräytettiin ja ylin MTBE-kerros siirrettiin GC-pulloon GC-MS-analyysiä varten

Kuva 2

Asetaatin kemiallinen derivointi. Metyylikloroformiaatin (MCF) avulla asetaatin karboksyyliryhmä muutetaan propyyliesteriksi: Asetaatti hyökkää ensin MCF:n kimppuun, ja syntyvään välituotteeseen (I) hyökkää sitten alkoholi (1-propanoli), jolloin syntyy toinen välituote (II), joka käy läpi muita uudelleenjärjestelyjä muodostaen propyyliasetaattia

Derativointireaktio MCF:n kanssa on voimakas ja eksoterminen, ja siinä syntyy kaasuja (kloorivetyhappokaasua, hiilidioksidia), jotka aiheuttavat paineen kohoamisen putken sisällä. Siksi suosittelemme noudattamaan yleisiä terveys- ja turvallisuussääntöjä, kun suoritetaan kemiallista derivatisointia, eli käyttämään laboratoriotakkia, käsineitä ja suojalaseja, ja suorittamaan reaktio huurresuojassa. Reaktion voimakkuuden ja siten paineen nousun minimoimiseksi on tärkeää inkuboida näyte jäällä (5 min) ennen derivatisointia. Suosittelemme pitämään kantta kiinni yhdellä sormella vortexin aikana ja avaamaan putken varovasti sen jälkeen (voi kuulua ”poksahtava” ääni). Vaihtoehtoisesti putki voidaan pitää auki vorteksoinnin aikana tutkijan mieltymyksen mukaan (mielestämme putken sisältö ei vuoda, kun sitä käsitellään varovasti). Sen jälkeen derivatisoitu asetaatti (propyyliasetaatti) voidaan helposti uuttaa orgaaniseen liuottimeen (MTBE), jota seuraa GC-MS-analyysi (kuva 1).

Derativointiin voidaan käyttää myös muita primaarialkoholeja (esim. metanolia ja etanolia, jotka tuottavat vastaavasti metyyli- ja etyyliasetaattia). Huomasimme kuitenkin, että keskipolaarisella GC-kolonnillamme (joka soveltuu mielestämme hyvin monenlaisten metaboliittien analysointiin) propyyliasetaatti tarjoaa optimaalisen piikin muodon ja retentioajan nopeaa analyysia varten. Tässä kuvattu näytteenvalmistusprotokolla on hyvin nopea, ja derivatisointiin kuluu alle 1 minuutti näytettä kohti. Yhdessä lyhyen GC-MS-ohjelman kanssa, jonka kokonaisajoaika on 4 minuuttia näytettä kohti, tämä helpottaa korkean läpimenon analyysiä. Vaikka asetaatin isotoopologeilla 12C-asetaatti, U-13C-asetaatti ja 2H3-asetaatti on lähes identtiset retentioajat, niiden piikit voidaan helposti purkaa käyttämällä spesifisiä ioneja (kuva 3). Kuten deuteroitujen analyyttien GC-analyysissä yleensä havaitaan, 2H3-asetaattijohdannaisen retentioaika on hieman lyhyempi käänteisen isotooppivaikutuksen vuoksi. Ioneja m/z 61, 63 ja 64 12C2-asetaatille, U-13C2-asetaatille ja 2H3-asetaatille käytettiin absoluuttiseen kvantifiointiin, ja ne osoittivat optimaalista lineaarista vastetta.

Kuva. 3

GC-kromatogrammi asetaattijohdannaiselle (propyyliasetaatti). a Kokonaisionikromatogrammi. b-d Ulosotetut ionikromatogrammit 12C-, U-13C- ja 2H3-asetaatille. Ioneja m/z 61, 63 ja 64 (ionien rakenne on merkitty) käytettiin absoluuttiseen kvantifiointiin

Menetelmän validointi

Näytteen valmistuksen ja analyysimenettelyn toistettavuuden arvioimiseksi määrittelimme suhteellisen standardipoikkeaman (RSD, relative standard deviation) vastaaville asetaatin isotoopologeille 12C- ja U-13C-asetaatille vastavalmistetuissa standardeissa, jotka olivat pitoisuuksiltaan 50, 200 ja 1000 μM. Menetelmä osoitti erinomaista toistettavuutta RSD:n ollessa < 5 % standardeille ja < 10 % biologisille näytteille (lisätiedosto 1: taulukko S2). Määrityksen lineaarinen alue arvioitiin analysoimalla sekä 12C- että U-13C-asetaatin sarjalaimennettuja standardeja alueella 2-2000 μM. Emme pystyneet määrittämään 12C-asetaatin havaitsemisrajaa (LOD), koska näytteissämme oli aina noin 15 μM:n suuruinen asetaattia sisältävä taustasignaali, vaikka käytimme vain erittäin puhtaita reagensseja. Näyttää siltä, että asetaatti on yleinen hivenaine ilmakehässä ja reagensseissa sekä muovissa ja lasitavaroissa, kuten on havaittu pidempiketjuisten rasvahappojen osalta. Tutkiaksemme asiaa tarkemmin pyrimme määrittämään tausta-asetaatin tarkat lähteet (lisätiedosto 1: kuva S1). Koska analysoimme asetaattia sen derivatisoidussa propyyliasetaattimuodossa, yleisesti havaitsemamme taustasignaali voi olla peräisin joko suoraan propyyliasetaatista tai näytteen valmistuksen aikana propyyliasetaatiksi derivatisoidusta tausta-asetaatista. Tarkastellaksemme taustapropyyliasetaatin esiintymistä teimme kokeen sekä muovi- että lasiastioissa, joissa analysoimme propyyliasetaatin määrää kemialliseen derivatisointiin käytetyissä reagensseissa. Havaitsimme, että 1-propanolilla on korkein propyyliasetaatin taustapitoisuus, mutta sen osuus on vain ~10 prosenttia tausta-asetaatista, joka havaittiin menettelytapojen nollanäytteissä (PB, eli nollanäytteet, joille on tehty koko näytteenvalmistus- ja massaspektrometrinen analyysimenettely), mikä viittaa siihen, että vapaa asetaatti, ei niinkään propyyliasetaatti, on pääasiallinen kontaminaattori. Valitettavasti kaikki reagenssit tarvitaan derivatisointiin, joten emme pysty määrittämään, mikä reagenssi sisältää eniten tausta-asetaattia. Suoritimme kuitenkin koko derivatisointi- ja uuttomenettelyn nollanäytteille sekä lasi- että muoviputkissa. Havaitsimme, että muoviputkissa syntyvä asetaattitausta on ~50 % suurempi kuin lasiputkissa. Käytännöllisyytensä vuoksi työskentelemme edelleen mieluummin muoviputkissa, ja jätämme tämän päätöksen yksittäisen tutkijan tehtäväksi.

Tausta-asetaatista riippumatta, koska vaste osoittautui erittäin lineaariseksi, pystyimme vähentämään taustasignaalin (kvantifioimme asetaattitaustan käyttämällä nollanäytteitä, joille on tehty koko näytteen valmistelu- ja massaspektrometrinen analyysimenettely, toisin sanoen menettelytapojen nollanäytteitä), ja saimme tulokseksi lineaarisen dynamiikka-alueen, joka ulottuu 2:n ja 2000:n μM:n välille, sekä 12C-asetaatille että U-13C- asetaatille. U-13C-asetaatin määritetty määritysraja (LOQ) oli 0,1 μM. Jotta 12C-asetaatti-kontaminaatio pysyisi mahdollisimman vähäisenä, suosittelemme, että uudet reagenssit valmistetaan säännöllisesti (viikoittain), ja suosittelemme myös, että menettelyyn sisällytetään rutiininomaisesti nollakokeita. Huomattakoon, että suosittelemme käyttäjiä kvantifioimaan oman asetaattitaustasignaalinsa, koska se riippuu käytetyistä materiaaleista ja reagensseista ja on siksi hyvin todennäköisesti laboratoriokohtainen.

Katsomme, että lähestymistapamme on optimoitu vaihtoehto muille julkaistuille derivatisointimenetelmille asetaatin nopeaa mittausta varten. Lähestymistapa, joka perustuu asetaatin silylointiin N-tert-butyylidimetyylisilyyli-N-metyylitrifluoroasetamidilla (MTBSTFA), osoitti laajan lineaarisen alueen asetaatin kvantifioinnissa (0-3500 μM), korkean toistettavuuden ja alhaisen suhteellisen keskihajonnan (RSD < 5 %) . Se ei kuitenkaan sovellu vesipohjaisten näytteiden käsittelyyn, useat uuttovaiheet voivat johtaa korkeisiin asetaatin taustapitoisuuksiin, ja MS-ajoaika on pitkä pelkän asetaatin analysointiin. Propyylikloroformiaattia (PCF) käyttävään alkylointiin perustuva lähestymistapa on menetelmältään ja analyyttiseltä suorituskyvyltään samankaltainen kuin meidän menetelmämme, mutta siinä käytetään suurempia reagenssimääriä (mikä lisää korkeiden asetaattitaustapitoisuuksien riskiä) ja pidempiä MS-ajoaikoja, koska sitä ei ole optimoitu erityisesti asetaattia varten, eikä siinä mainita formiaattia. Julkaistu kvantifioinnin alaraja oli vertailukelpoinen menetelmämme kanssa (15 μM nykyisessä menetelmässä verrattuna Zhengin ym. raportoimaan 16 μM:iin). Zheng et al. raportoivat laajemman lineaarisen vasteen alueen eli 16 μM-8 mM. Emme testanneet yli 2 mM:n tasoja, koska emme ole havainneet niin korkeita tasoja fysiologisessa yhteydessä. Raportoidun toistettavuuden havaittiin olevan hyvin samankaltainen kuin Zheng et al. raportoima 0,54 % RSD (n = 6) ja ~0,7 % RSD (n = 3) asetaattikonsentraatiosta riippuen, joka raportoitiin nykyisessä menetelmässä vakionäytteille (suhteelliset keskihajonnat on esitetty yhteenvetona lisätiedostossa 1: taulukossa S2). Toisessa GC-MS-pohjaisessa menetelmässä lyhytketjuisten rasvahappojen analysointiin käytettiin kondensaatioreagensseina 2,4-difluoroaniliinia ja 1,3-disyklokarbodiimidiä, mikä edellytti 1 tunnin inkubaatiovaihetta . Kaiken kaikkiaan tässä esitetyllä työllä on jo julkaistujen menetelmien lisäksi seuraavat lisäykset: (1) optimoitu menetelmä asetaattia varten sekä mukautettu menetelmä formiaatin mittaamiseksi, (2) perusteellinen keskustelu tausta-asetaatista, sen mahdollisista lähteistä ja siitä, miten sitä käsitellään käytännöllisellä tavalla, ja (3) lähestymistapa, jonka avulla voidaan mitata vapaan asetaatin lisäksi myös sitoutunutta asetaattia.

Näytteenvalmistusprotokollaan sisältyy natriumhydroksidin lisääminen alkylointireaktion helpottamiseksi. Vaikka tämä tapahtuu välittömästi ennen derivatisointireaktiota ja näytteet jäähdytetään, tämä voi mahdollisesti johtaa asetyloitujen biomolekyylien ei-toivottuun hydrolyysiin, mikä johtaa vapaan asetaatin määrän lisääntymiseen. Testataksemme, tapahtuuko näin, suoritimme näytteiden valmistuksen ja analysoinnin 10 mM:n liuoksilla N-asetyyli-l-asparagiinihappoa (NAA) ja N-asetyyli-l-kysteiiniä (NAC), 1 g/l BSA:ta sekä menettelytapojen nollakappaleilla. Koska aminohappoasetylaatio on sidotun asetaatin runsain lähde, emmekä havainneet signaalin merkittävää lisääntymistä, päättelemme, että hydrolysoituneen sidotun asetaatin osuus on vähäinen (kuva 4).

Kuva 4

Derativisoinnin aikana lisätyn natriumhydroksidin vaikutus sidotun asetaatin hydrolyysiin. Whisker-diagrammi suhteelliselle asetaattitaustalle, joka on johdettu menettelyn tyhjästä ja N-asetyloiduista biomolekyyleistä-BSA, N-asetyyli-l-aspartaatista (NAA) ja N-asetyyli-l-kysteiinistä (NAC). Derivointiprosessin aikana ei tapahdu merkittävää deasetylaatiota. Tiedot ovat n = 5:n keskiarvoja ± SD kaikissa olosuhteissa. Vaakaviiva ja piste laatikkokaaviossa vastaavat mediaaniarvoa ja poikkeamaa. Laatikkokaavion pystysuoran viivan ylä- ja alapää vastaavat suurinta ja pienintä määritettyä arvoa

Asetaatin kvantifiointi biologisissa näytteissä

Valmistettuamme, että menetelmämme kykenee kvantifioimaan asetaattia tarkasti ja toistettavasti, halusimme seuraavaksi selvittää, pystyykö se toistamaan aiemmin todetut tulokset. Siksi määrittelimme asetaattia kahdeksan terveen henkilön plasmasta. Plasman asetaattipitoisuudet vaihtelivat 20-51 μM:n välillä mediaanipitoisuuden ollessa 34,1 ± 9,0 μM (tietoja ei ole esitetty). Tämä kuuluu aiemmin julkaistuihin arvoihin 41,9 ± 15,1 μM ja 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

Viime aikoina useissa tutkimuksissa tunnistettiin asetyyli-CoA-syntetaasi 2 -entsyymin (ACSS2) tärkeä rooli kasvainten kasvun välittämisessä hypoksisissa ja ravinnepuutteellisissa olosuhteissa . ACSS2 ”aktivoi” asetaatin AcCoA:ksi, jotta sitä voidaan käyttää myöhemmissä aineenvaihduntareaktioissa, mukaan lukien lipogeneesi. U-13C-asetaatin lisääminen viljeltyjen syöpäsolujen elatusaineeseen osoitti, että lipogeenisen AcCoA:n ja siten rasvahappojen merkitseminen on lisääntynyt hypoksisissa olosuhteissa verrattuna normoksisiin olosuhteisiin . Ei kuitenkaan tiedetä, missä määrin tämä lisääntynyt leimautuminen johtuu asetaatin ottamisen lisääntymisestä. Tämän kysymyksen selvittämiseksi viljelimme A549-keuhkokarsinoomasoluja normoksisissa tai hypoksisissa (1 % O2) olosuhteissa väliaineessa, joka sisälsi 500 μM U-13C-asetaattia, ja seurasimme sen pitoisuutta ajan mittaan uudella menetelmällämme (kuva 5). Yhdenmukaisesti lipogeenisen AcCoA:n havaitun merkitsemisen kanssa U-13C-asetaatista havaittiin, että hypoksiset solut kuluttivat voimakkaasti U-13C-asetaattia, mikä näkyi selvänä vähenemisenä väliaineessa. Yllättävää kyllä, vaikka lipogeenisen AcCoA:n leimautuminen normoksisissa olosuhteissa on huomattavasti vähäisempää kuin hypoksiassa, myös normoksiset solut kuluttivat innokkaasti U-13C-asetaattia. Asetaatin ottonopeus hypoksisissa soluissa oli 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL soluja (PCV) hieman korkeampi kuin normoksisissa soluissa (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL soluja). Nämä tulokset viittaavat siihen, että lipogeenisen AcCoA:n lisääntynyttä merkitsemistä U-13C-asetaatista hypoksiassa (~3-kertainen lisäys, tietoja ei ole esitetty) ei voida täysin selittää lisääntyneellä asetaatin ottamisella. Sen sijaan lisääntynyt merkintä johtuu todennäköisesti osittain lipogeenisen AcCoA:n tuotannon vähenemisestä glukoosista hypoksisissa soluissa, mikä johtaa asetaatin suhteellisen osuuden inflaatioon. Tutkimme tätä parhaillaan tarkemmin.

Kuva 5

Normoksisten ja hypoksisten syöpäsolujen asetaatin otto. U-13C-asetaatin pitoisuusprofiili A549-solujen elatusaineessa a normoksisissa ja b hypoksisissa (1 % O2) olosuhteissa ja c (a, b)-arvojen perusteella lasketut imeytymisnopeudet. Arvot ovat keskiarvoja ± SD (n = 3)

Vapaan asetaatin pitoisuus hiiren kudoksissa ja nesteissä

In vivo isotooppijäljityskokeet osoittivat, että kasvaimet käyttävät eksogeenista asetaattia, mikä vahvistaa ACSS2:n kriittisen roolin kasvun välittämisessä eri syövissä. Asetaatin saatavuus kiinteille kasvaimille ja se, miten se vaihtelee isäntäelinten välillä, on kuitenkin edelleen suurelta osin tuntematon. Tämän kysymyksen ratkaisemiseksi analysoimme kudoksia useista hiiren (C57BL/6) elimistä (sydän, munuaiset, maksa, keuhkot, haima, perna, kateenkorva) sekä plasmasta ja virtsasta (kuva 6). Kaikista analysoiduista elimistä maksassa oli suurin vapaan asetaatin pitoisuus, keskimäärin 1,0 ± 0,1 nmoolia asetaattia milligrammaa kudosta kohti (eli ~1 mM), mikä on yli kaksi kertaa enemmän kuin muissa kudoksissa. Suolistosta imeytyvät ravintoaineet kulkevat ensin maksan läpi porttilaskimon kautta. Suoliston mikrobiston on raportoitu tuottavan suuria millimolaarisia pitoisuuksia asetaattia ja muita lyhytketjuisia rasvahappoja, mikä selittää maksan suuren asetaattipitoisuuden. Koska asetaatin pitoisuus maksassa on paljon suurempi kuin systeemisessä verenkierrossa (eli plasmassa) ja keuhkoissa, joissa on ensimmäinen kapillaarijärjestelmä, jota veri perfusoi maksan läpikulun jälkeen, maksa näyttää vangitsevan huomattavia määriä asetaattia metaboliseen käyttöön. Asetaattia oli myös huomattavasti enemmän haimassa ja munuaisissa kuin plasmassa, ja niiden pitoisuudet olivat 0,5 ± 0,04 ja 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 ja 0,4 mM). Syytä haiman korkeaan asetaattitasoon ei ole vielä selvitetty. Yksi munuaisten tehtävistä on poistaa verestä vesiliukoisia ylimääräisiä tai myrkyllisiä aineenvaihduntatuotteita, ja kun otetaan huomioon, että virtsan asetaattipitoisuus on huomattavasti korkeampi kuin plasman, asetaattia saattaa itse asiassa erittyä elimistöstä aktiivisesti aineenvaihdunnan ”jätteenä”. Asetaattipitoisuudet olivat huomattavasti pienemmät muissa kudoksissa, ja alhaisin arvo todettiin pernassa, jossa pitoisuus oli samanlainen kuin plasmassa. Yhdessä nämä havainnot korostavat, että asetaatin saatavuus voi vaihdella huomattavasti elinten välillä, millä on vaikutuksia kasvainten aineenvaihduntaan.

Kuva 6

Vapaan asetaatin pitoisuus hiirinäytteissä. Whiskerplotit (a) sydämen, munuaisten, maksan, keuhkojen, haiman, pernan ja kateenkorvan kudoksista sekä (b) plasmasta ja virtsasta, jotka on saatu C57BL/6-hiiriltä. Jäädytetyt kudokset jauhettiin, ja kudosnäytteitä käytettiin vapaan asetaatin kvantifiointiin. Tiedot ovat kudosnäytteiden (n = 7) ja nestenäytteiden (n = 5) keskiarvoja ± SD. Laatikkokuvion vaakasuora viiva ja piste vastaavat mediaaniarvoa ja poikkeamaa. Laatikkokaavion pystysuoran viivan ylä- ja alapää on suurin ja pienin määritetty arvo. Laatikon ylempi ja alempi vaakasuora viiva ovat vastaavasti 3. ja 1. kvartiili

Sidotun asetaatin analyysi (sub)solu- ja histonifraktioissa

AcCoA:lla on keskeinen asema aineenvaihdunnassa, ja se on osallisena biomassan synteesissä, katabolisissa reiteissä ja energian tuotannossa. Tämän vuoksi AcCoA:lla on tärkeä rooli aineenvaihdunnan säätelyssä . Tämä tapahtuu osittain biomolekyylien, kuten useiden proteiinien, asetylaation kautta . Esimerkiksi histonien asetylaatio edistää geenien transkriptiota, ja histonien asetylaatioasteen ja kasvainten aggressiivisuuden välillä on havaittu korrelaatio . Lisänäyttöä asetylaation homeostaasin merkityksestä syövän etenemisessä saadaan havainnosta, jonka mukaan asetylaation dynamiikan häiritseminen estämällä deasetylaaseja (esim. HDAC:t, sirtuiinit) johtaa voimakkaaseen syöpäsolujen kuoleman induktioon . Vaikka useita asetylaation näkökohtia tutkitaan laajalti, paljon on edelleen tuntematonta biomolekyyleihin sitoutuneen asetaatin absoluuttisesta poolin koosta ja vaihtuvuudesta eri solukompartmenteissa, puhumattakaan siitä, miten kasvaimen kannalta merkitykselliset olosuhteet vaikuttavat niihin. Tämän selvittämiseksi yhdistimme lähestymistapamme hydrolyysiin perusolosuhteissa. Kuumentamalla näytteitä ja inkuboimalla niitä yön yli natriumhydroksidin kanssa esterisidokset hydrolysoituvat, jolloin vapautuu vapaata asetaattia, joka voidaan sitten derivatisoida ja analysoida kuten aiemmin. Käyttämällä tätä lähestymistapaa kokosoluuutteeseen pystyimme määrittämään A549-solujen kokonaisasetaatin (sitoutunut + vapaa) määrän 0,38 μmol/mg solujen kokonaisproteiinia. Seuraavaksi kysyimme, olisiko mahdollista kvantifioida sidottua asetaattia erillisissä solukompartimenteissa. Saavutimme lähes täydellisen erottelun ydin- ja jäännössolufraktioiden (sytosolin ja muiden organellien kuin ytimen yhdistelmä) välillä käyttämällä kaupallista ytimen eristyssarjaa (ks. kohta ”Menetelmät”) (kuva 7b). Havaitsimme, että sitoutuneen asetaatin pitoisuus oli suunnilleen sama ydin- ja jäännösfraktioissa (kuva 7c). Molempien fraktioiden summa oli ~80 % koko solun mittauksesta, mikä johtuu todennäköisesti heikentyneestä talteenotosta fraktioinnin aikana, mutta voi johtua myös vapaan asetaatin häviämisestä. Asetaattipitoisuuden ilmaiseminen mg:aa proteiinia kohti kummassakin fraktiossa osoitti, että asetylaatiotiheys ytimessä on noin kolme kertaa suurempi kuin jäännössolufraktiossa (kuva 7d). Histonien tiedetään olevan voimakkaasti asetyloidut, ja määrittääksemme, kuinka suuri osa ytimen asetaatista oli histoniin sitoutunutta, vertasimme ytimen eristysmenetelmän tuloksia julkaistuun happaman histoniuuton protokollaan (kuva 7e-g) . Molemmat lähestymistavat antoivat hyvin samankaltaisia arvoja, mikä osoittaa, että lähes kaikki sidottu asetaatti ydinfraktiossa johtuu histoniasetylaatiosta. Näin ollen histoniasetylaatio yksinään muodostaa puolet solun kokonaisasetaatista.

Kuva 7

(Sub)solun kokonaisasetaatin kvantitointi. a Kaavio, josta käy ilmi, mitä fraktioita analysoitiin. b Western-blot, joka osoittaa ydin- (TBP) ja jäännössolufraktioiden (tubuliini) erottelun laadun. c Kokonaisasetaatti kokosoluuutteessa tai ydin- ja jäännössolufraktioissa. d Sama kuin (c), mutta ilmaistuna suhteessa proteiinimäärään kussakin fraktiossa. e Histonit (punaiset pallot) ovat voimakkaasti asetyloidut ja asetylaatio kontrolloi geeniekspressiota. f Western blot histoneista happouuton jälkeen, värjätty Ponceau S:llä. g Happouuton histoneista tai ydinfraktiosta saadun asetaatin kokonaismäärä. h HDAC:n inhibiittorin panobinostaatin vaikutus histoneihin sitoutuneen asetaatin määrään. Arvot ovat keskiarvoja ± SD (n = 3)

Tämä lähestymistapa histoneihin sitoutuneen asetaatin kvantifiointiin voi auttaa ymmärtämään paremmin histoniasetylaation vaikutusta erilaisissa syöpään liittyvissä tutkimuksissa. Osoittaaksemme lähestymistavan hyödyllisyyden käsittelimme A549-soluja panobinostaatilla, joka on pan-histoni-deasetylaasin (HDAC) estäjä. Lyhyt 4 tunnin inkubointi panobinostaatin kanssa aiheutti histoniin sitoutuneen asetaatin määrän lähes kaksinkertaistumisen, mikä osoittaa, että histoniasetylaation liikevaihto on melko nopeaa (kuva 7h).

Formaatin ja muiden lyhytketjuisten rasvahappojen mittaaminen

Derivointiyhdisteen muokkaamisella menetelmä on helposti muunneltavissa muille lyhytketjuisille rasvahapoille, mukaan lukien formiaatti. Kytkemällä formiaatti bentsyylialkoholiin saadaan formiaattijohdannainen (bentsyyliformiaatti), joka voidaan helposti analysoida GC-MS:llä (ks. täydentävät kokeelliset menetelmät Additional file 1: S1). Mainitsimme aiemmin, että GC-MS-menetelmä asetaatin analysoimiseksi kestää vain 4 minuuttia, ja massadetektorin toiminta-aika on 2,2-2,7 minuuttia. Samalla menetelmällä voidaan analysoida ja kvantifioida propionaatti ja butyraatti propyylipropionaatin ja propyylibutyraatin muodossa käyttäen samaa näytteen derivatisointimenetelmän asetusta kuin asetaatille. Pidentämällä massadetektorin toiminta-aikaa 2,2 minuutista 4 minuuttiin pystyttiin havaitsemaan propionaatti- ja butyraattipiikit, jotka eluoituvat vastaavasti 2,92 ja 3,30 minuutissa. Käyttämällä propionaatille ja butyraatille ioneja m/z 75 ja 89 on mahdollista kvantifioida nämä lyhytketjuiset rasvahapot absoluuttisesti.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.