A rapid method for quantifying free and bound acetate based on alkylation and GC-MS analysis

酢酸の化学的誘導体化。 クロロギ酸メチル（MCF）を用いて、酢酸のカルボキシル基をプロピルエステルに変換する。 酢酸がまずMCFを攻撃し、得られた中間体（I）がアルコール（1-プロパノール）に攻撃されて第二中間体（II）を生成し、これがさらに転位して酢酸プロピルを形成する

MCFによる誘導体化反応は激しく発熱し、ガス（塩酸ガス、二酸化炭素）が発生してチューブ内の圧力が上昇する。 従って、化学誘導体化反応を行う際には、白衣、手袋、保護眼鏡を着用し、ヒュームフードの中で行うなど、一般的な安全衛生規則を遵守することをお勧めします。 誘導体化の前にサンプルを氷上でインキュベート（5分）することが重要です。 ボルテックス中は指一本で蓋を閉め、その後注意深くチューブを開けることをお勧めします（”popping “という音が聞こえます）。 また、ボルテックス中はチューブを開けたままにしておくことも可能である（注意深く扱えばチューブの中身がこぼれないことが分かっている）。 その後、誘導体化した酢酸（酢酸プロピル）を有機溶媒（MTBE）に抽出し、GC-MSで分析することが容易にできる（図1）＜4285＞＜7607＞他の一級アルコール（例えば、メタノール、エタノールからそれぞれ酢酸メチル、酢酸エチル）を誘導体に使用することも可能である。 しかし、中極性GCカラム(幅広い代謝物の分析に非常に適していると思われる)では、酢酸プロピルが最適なピーク形状と保持時間を提供し、迅速な分析が可能であることが分かった。 ここで説明したサンプル調製プロトコルは、1サンプルあたりの誘導体化時間が1分未満と、非常に高速です。 また、GC-MSのプログラムも1試料あたり4分と短く、ハイスループット分析が可能です。 酢酸同位体である12C-酢酸、U-13C-酢酸、2H3-酢酸は保持時間がほぼ同じであるため、特定のイオンを用いて簡単にピークを分離することができます(Fig. 3). 重水素化された分析物のGC分析で一般的に見られるように、2H3-酢酸誘導体は逆同位体効果により保持時間がわずかに短くなります。 12C2-acetate、U-13C2-acetate、2H3-acetateのイオンm/z 61、63、64はそれぞれ絶対定量に用いられ、最適な線形応答を示した

酢酸誘導体（酢酸プロピル）のGCクロマトグラム。 a 全イオンクロマトグラム。 b-d 酢酸12C-, U-13C-, 2H3-それぞれの抽出イオンクロマトグラム。 イオンm/z 61, 63, 64 (イオンの構造を示す) は絶対定量に用いた

Method validation

サンプル調製と分析手順の再現性を評価するために、それぞれの酢酸同位体について50、200、1000μMの新鮮な標準溶液で12C-とU-13C-の相対標準偏差 (RSD) を測定しました。 本法は，標準物質のRSD < 5 %，生体試料のRSD < 10 %と優れた再現性を示した（Additional file 1: Table S2）。 12C-およびU-13C-酢酸の両方を連続的に希釈した標準物質を2-2000 μMの範囲で分析することにより、定量範囲の線形性を評価した。 最高純度の試薬のみを使用したにもかかわらず、約15μMのバックグラウンド酢酸シグナルが常にサンプル中に存在したため、12C-酢酸の検出限界（LOD）を決定することはできませんでした。 このことから、酢酸は大気中や試薬中、プラスチックやガラス器具によく含まれる微量汚染物質であり、長鎖脂肪酸で観察されているのと同様であると考えられる。 このことをさらに調べるために、バックグラウンドの酢酸の正確な発生源を特定することを試みた（Additional file 1: Figure S1）。 酢酸を誘導体化された酢酸プロピルの形で分析するため、一般的に観測されるバックグラウンドシグナルは、酢酸プロピルに直接由来するものと、サンプル調製中に酢酸プロピルに誘導体化されたバックグラウンド酢酸のどちらかである可能性があります。 バックグラウンドの酢酸プロピレンの存在を調べるため、プラスチックとガラス器具の両方で実験を行い、化学誘導体化に使用した試薬の酢酸プロピルレベルを分析しました。 その結果、1-プロパノールが最もバックグラウンドの高い酢酸プロピルですが、手順ブランク（PB、すなわちサンプル調製と質量分析手順のすべてを経たブランクサンプル）で観測されるバックグラウンド酢酸のわずか10 %しか占めておらず、酢酸プロピルではなく、遊離酢酸が主要汚染物質であることを示していることが確認されました。 残念ながら、誘導体化にはすべての試薬が必要であるため、どの試薬が最もバックグラウンドの酢酸を含んでいるかを判断することはできません。 しかし、ガラス管とプラスチック管の両方に入れたブランク試料に対して、誘導体化と抽出の全手順を実施しました。 その結果、プラスチックチューブの場合、ガラスチューブに比べて酢酸のバックグラウンドが50%程度高くなることがわかりました。 4285>

酢酸のバックグラウンドに関係なく、応答が非常に線形であることが証明されたため、バックグラウンド信号を差し引くことができ (サンプル調製と質量分析手順全体を経たブランクサンプル、すなわち手順ブランクを使用して酢酸バックグラウンドを定量)、12C-酢酸および U-13C- 酢酸の両方で 2 ～ 2000 μM の線形ダイナミックレンジとなった。 U-13C-酢酸の定量下限（LOQ）は0.1μMであった。 12C-酢酸の汚染を最小限に抑えるため、定期的（毎週）に新しい試薬を調製すること、またルーチンにプロシージャーブランクスを含めることをお勧めします。 4285>

私たちは、酢酸の迅速な測定のために、他の誘導体化手法に代わる最適な方法として、私たちのアプローチを考えています。 N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) による酢酸のシリル化に基づくアプローチは、酢酸定量に広い線形範囲 (0-3500 μM) と高い再現性、低い相対標準偏差 (RSD < 5 %) を示しました。 しかし、水系サンプルの処理には適しておらず、複数の抽出ステップにより酢酸のバックグラウンドが高くなる可能性があり、酢酸のみの分析ではMSのランタイムが長くなる。 クロロギ酸プロピル (PCF) を用いたアルキル化に基づくアプローチは、方法論と分析性能の点で私たちのものと似ていますが、酢酸に特化して最適化されていないため、試薬量が多く (酢酸のバックグラウンドレベルが高くなるリスクが高まる)、MS 分析時間が長く、ギ酸については言及されていません . 発表された定量下限は我々の手法と同等でした（Zhengらの報告16 μMに対し，現在の手法は15 μM）。 Zhengらは16 μMから8 mMという広い範囲の線形応答を報告している。 我々は、生理的な状況でそのような高いレベルを観察していないため、2 mMを超えるテストは行っていない。 報告された再現性は，Zheng らによって報告された 0.54 % RSD (n = 6) と非常に類似しており，標準試料に対する本手法の報告では，酢酸 濃度に依存して ~0.7 % RSD (n = 3) となった（相対標準偏差は Additional file 1: Table S2 に要約されている）。 また，GC-MSを用いた短鎖脂肪酸の分析法では，縮合試薬として2,4-ジフルオロアニリンと1,3-ジシクロカルボジイミドを用いており，1時間のインキュベーションが必要であったが，本手法では1時間のインキュベーションで十分であった。 (1)酢酸測定法の最適化、ギ酸測定法の改良、(2)バックグラウンド酢酸、その発生源、対処法に関する詳細な考察、(3)遊離酢酸のみならず結合酢酸の測定法、などである。 これは誘導体化反応の直前に行われ、サンプルは冷却されますが、アセチル化された生体分子の不要な加水分解を引き起こし、遊離酢酸レベルの上昇を招く可能性があります。 そこで、N-acetyl-l-aspartic acid (NAA) と N-acetyl-l-cysteine (NAC) の10 mM溶液、1 g/L のBSA、およびプロシージャブランクのサンプル調整と分析を行いました。 アミノ酸のアセチル化が結合酢酸の最も豊富なソースであり、シグナルの有意な増加が観察されなかったことから、加水分解された結合酢酸からの寄与は無視できると結論付けた（図4）

誘導体化の際に加えた水酸化ナトリウムの結合酢酸加水分解への影響。 手順ブランクとN-アセチル化生体分子-BSA、N-アセチル-L-アスパラギン酸（NAA）およびN-アセチル-L-システイン（NAC）から得られた相対的な酢酸バックグラウンドに対するウィスカープロット。 誘導体化手順の間、顕著な脱アセチル化は起こりません。 データはすべての条件におけるn = 5の平均±SDである。 箱ひげ図上の横線と点は、それぞれ中央値と外れ値に対応する。 box plotの縦線の上端と下端はそれぞれ決定された最大値と最小値

Acetate quantification in biological samples

我々の方法が正確かつ再現性よく酢酸を定量できることがわかったので、次に我々は以前に確立した結果を再現できるかどうかを確認したいと考えた。 そこで、健常者8人の血漿中の酢酸を定量した。 血漿中の酢酸濃度は20〜51μMの範囲で変動し、中央値は34.1±9.0μMであった（データは示していない）。 これは、これまでに発表された41.9 ± 15.1 μM および 30.4 ± 9.0 μM (Human Metabolome Database ) という値の範囲内です。

最近、複数の研究により、低酸素および栄養制限条件下での腫瘍成長を仲介するアセチルCoA合成酵素2 (ACSS2) という酵素の重要な役割が特定されました。 ACSS2は酢酸をACCOAに「活性化」し、脂肪生成を含む下流の代謝反応に使用できるようにする。 実際、培養がん細胞の培地にU-13C-酢酸を添加すると、正常な状態よりも低酸素状態の方が、脂肪生成AcCoA、ひいては脂肪酸の標識が増加することが明らかになった . しかし、この標識の増加がどの程度酢酸の取り込みの増加に起因しているかはまだ不明である。 そこで、A549肺がん細胞を500μM U-13C-酢酸を含む培地で正常酸素濃度または低酸素濃度（1 % O2）で培養し、新しい方法でその濃度を経時的に追跡した（図5）。 U-13C-acetate から脂質生成 AcCoA の標識が観察されたのと同様に、低酸素状態の細胞による U-13C-acetate の強固な消費が観察され、培地中の明確な減少が証明された。 一方、正常酸素濃度条件下での脂質生成 AcCoA の標識は低酸素濃度条件下よりもかなり少ないが、正常酸素濃度条件下の細胞でも U-13C-acetate の消費は旺盛であることがわかった。 低酸素状態の細胞における酢酸の取り込み速度は、2.5 ± 0.1 nmole/h/μL cells (PCV) で、正常酸素状態の細胞 (1.9 ± 0.1 nmole/h/μL cells) よりもわずかに高い値であった。 これらの結果は、低酸素状態におけるU-13C-酢酸からの脂質生成AcCoAのラベル化の増加（〜3倍増加、データ示さず）は、酢酸の取り込みの増加では完全に説明できないことを示唆している。 むしろ、この標識の増加は、低酸素細胞においてグルコースからの脂質生成AcCoAの生成が低下し、酢酸からの相対的な寄与が増大したことに一部起因すると思われる。

正常酸素および低酸素がん細胞による酢酸取り込み量。 a正常酸素状態およびb低酸素状態（1 % O2）のA549細胞の培地中のU-13C-酢酸の濃度プロファイルとc（a、b）から算出した取り込み率。 値は平均±SD（n = 3）

マウス組織および体液中の遊離酢酸濃度

In vivo同位体追跡実験により腫瘍が外来酢酸を利用することが示され、ACSS2が各種がんの成長を媒介して重要な役割を果たすことが確認されました 。 しかし、固形癌が酢酸を利用できるか、また、それが宿主臓器によってどのように異なるかは、まだほとんど分かっていない。 そこで、我々はマウス（C57BL/6）の複数の臓器（心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、胸腺）の組織、および血漿と尿を分析した（図6）。 分析したすべての臓器の中で、肝臓は最も高濃度の遊離酢酸を含み、組織1mgあたりの平均酢酸濃度は1.0 ± 0.1 nmole（すなわち、〜1 mM）で、他のどの組織よりも2倍以上であった。 腸から吸収された栄養素は、まず門脈を経由して肝臓を通過する。 ミリモル濃度の高い酢酸や他の短鎖脂肪酸は、腸内細菌叢によって生成されることが報告されており、これが肝臓の酢酸濃度が高い根拠となっている。 肝臓の酢酸濃度は、全身循環（すなわち血漿）および肝臓通過後に血液が最初に灌流される毛細血管系を含む肺よりもはるかに高いため、肝臓は相当量の酢酸を代謝に利用しているようである。 酢酸は膵臓と腎臓でも血漿に比べてかなり濃縮されており、その濃度はそれぞれ0.5 ± 0.04 と 0.4 ± 0.06 nmole/mg (~0.5 と 0.4 mM) であった。 膵臓の酢酸濃度が高い理由はまだ解明されていない。 腎臓の機能のひとつに、水溶性の過剰代謝物や毒性代謝物を血液から排出することがあるが、尿中の酢酸濃度が血漿中よりもかなり高いことを考えると、実際には酢酸が代謝の「老廃物」として体外に積極的に排泄されている可能性がある。 他の組織では酢酸濃度はかなり低く、最も低い値は脾臓で血漿と同程度の濃度で見つかった。 4285>

マウス試料中の遊離酢酸の濃度。 C57BL/6から(a)心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、胸腺の組織、(b)血漿、尿のウィスカープロットを取得した。 スナップ凍結した組織を粉砕し、組織のアリコートを遊離酢酸の定量に使用した。 データは組織（n = 7）および液体（n = 5）サンプルの平均値±SDである。 Box plot上の横線と点はそれぞれ中央値と外れ値に対応する。 Box plotの縦線の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値を示す。 箱の上下の横線はそれぞれ第3四分位値と第1四分位値

（亜）細胞およびヒストン画分中の結合酢酸の分析

AcCoA は代謝における中心ノードで、バイオマス合成、異化経路、エネルギー生産に関与しています。 このため、AcCoAは代謝の調節に重要な役割を担っている。 これは、様々なタンパク質を含む生体分子のアセチル化を通じて行われる。 例えば、ヒストンのアセチル化は、遺伝子の転写を促進し、ヒストンのアセチル化の程度と腫瘍の侵襲性の間に相関があることが観察されている . さらに、脱アセチル化酵素（HDACs、サーチュイン）を阻害してアセチル化の動態を乱すと、がん細胞の死が強力に誘導されるという観察から、がんの進行におけるアセチル化の恒常性の重要性が証明されている … アセチル化のいくつかの側面は広く研究されているが、様々な細胞コンパートメントにおける生体分子と結合した酢酸の絶対的なプールサイズとターンオーバーについては、腫瘍関連条件によってどのように影響されるかは言うまでもなく、まだ多くの不明な点がある。 この問題を解決するために、我々は基本的な条件下での加水分解と我々のアプローチを組み合わせた。 サンプルを加熱し、水酸化ナトリウムと一晩インキュベートすることで、エステル結合が加水分解され、遊離酢酸が放出されるため、従来通り誘導体化し、分析することが可能である。 全細胞抽出液にこの方法を用いることで、A549細胞における総酢酸（結合＋遊離）を0.38μmole/mgの細胞総タンパク質で定量することが可能となった。 次に、別々の細胞コンパートメントで結合した酢酸を定量することが可能かどうか検討した。 市販の核分離キット（「方法」のセクションを参照）を用いて、核と残留細胞画分（細胞質と核以外のオルガネラの組み合わせ）のほぼ完全な分離を達成した（図7b）。 その結果、結合酢酸量は核画分と残留画分でほぼ等しいことがわかった（Fig. 7c）。 両分画の合計は細胞全体の測定値の約80 %に相当した。これは分画時の回収率の低下によるものと思われるが、遊離酢酸の損失が原因である可能性もある。 各分画のタンパク質1mgあたりの酢酸含量を表すと、核のアセチル化密度は残存細胞分画の約3倍であることがわかった（Fig. 7d）。 ヒストンはアセチル化度が高いことが知られており、核の酢酸がどの程度ヒストンに結合しているかを調べるため、核分離法の結果を、公表されている酸性ヒストン抽出プロトコルと比較しました（図7e-g）。 どちらのアプローチも非常によく似た値を示したことから、核画分中の結合酢酸のほぼすべてが、ヒストンのアセチル化に起因していることがわかった。 したがって、ヒストンのアセチル化だけで細胞全体の酢酸の半分を占めることになる。 a どの画分を分析したかを示す概略図。 b 核画分（TBP）と残留細胞画分（チューブリン）の分離の質を示すウェスタンブロット。 c 全細胞抽出物または核および残留細胞画分中の全酢酸量。 d (c)と同じだが、各画分中のタンパク質量に対する相対値で表した。 e ヒストン（赤い球）は大きくアセチル化されており、アセチル化は遺伝子発現を制御する。 f 酸性抽出後のヒストンをPonceau Sで染色したウェスタンブロット。 h ヒストンに結合した酢酸のレベルに対するHDAC阻害剤panobinostatの効果。 値は平均±SD（n = 3）

ヒストン結合酢酸を定量するこのアプローチは、様々な癌関連の研究においてヒストンのアセチル化の影響をより理解するために役立つと考えられる。 このアプローチの有用性を実証するために、汎ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤である panobinostat で A549 細胞を処理しました。 4285>

ギ酸および他の短鎖脂肪酸の測定

誘導体化剤を変更することにより、この方法はギ酸を含む他の短鎖脂肪酸に容易に適応可能である。 ギ酸をベンジルアルコールとカップリングさせるとギ酸誘導体（ギ酸ベンジル）が生成し、GC-MSで容易に分析できる（実験手順の補足 Additional file 1: S1参照）。 酢酸のGC-MS分析法は、質量検出器の動作時間が2.2〜2.7分で、4分しかかからないことは先に述べたとおりである。 同じ方法で、酢酸と同じ試料誘導体化法の設定を用いて、プロピル-プロピオン酸、プロピル-酪酸の形で分析・定量することが可能である。 質量検出器の動作時間を2.2分から4分に延長することで，2.92分と3.30分にそれぞれ溶出するプロピオン酸と酪酸のピークを検出することができた。 プロピオン酸、酪酸のイオンm/z 75、89を用いることで、これらの短鎖脂肪酸を絶対定量することが可能である

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