O metodă rapidă de cuantificare a acetatului liber și legat pe baza alchilării și a analizei GC-MS

Descriere metodă

Am dezvoltat o metodă robustă și de mare randament pentru cuantificarea absolută a acetatului în probe biologice. Metoda se bazează pe derivatizare folosind o reacție stabilită cu cloroformiatul de metil (MCF) . După adăugarea secvențială de standard intern, 1-propanol, piridină și hidroxid de sodiu, reacția de derivatizare este inițiată prin adăugarea de MCF cât mai curând posibil. Modificarea chimică are loc în condiții bazice datorită prezenței hidroxidului de sodiu, în timp ce piridina menține sistemul de reacție omogen, deoarece MCF nu se dizolvă doar în apă (Fig. 1). 1-Propanolul este utilizat ca reactiv de cuplare pentru a produce propil-acetat (Fig. 2). Atunci când se adaugă hidroxid de sodiu la proba răcită imediat înainte de adăugarea MCF, nu are loc nicio hidroliză (a se vedea mai jos). Alchilarea acetatului cu MCF facilitează modificarea ulterioară rapidă a acetatului în condiții de apă. În acest caz, intermediarul acetat-MCF (I) este atacat de alcool (1-propanol), iar intermediarul rezultat (II) suferă alte rearanjări, ceea ce duce la formarea de propil-acetat. Astfel de abordări de derivatizare care utilizează reactivi din familia cloroformiaților sunt bine descrise. Pentru a cuantifica randamentul derivatizării și al extracției ulterioare în MTBE, am comparat intensitatea semnalului MS a 1 mM de acetat alchilat la propil-acetat cu o concentrație echimolară de propil-acetat obținut în comerț în MTBE. Pe această bază, am constatat că recuperarea a fost de 95,5 ± 1,57 % (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1).

Reacția de derivatizare cu MCF este viguroasă și exotermică, producând gaze (gaz clorhidric, dioxid de carbon) care determină creșterea presiunii în interiorul tubului. Prin urmare, vă recomandăm să respectați regulile generale de sănătate și siguranță atunci când efectuați derivatizări chimice, adică să purtați halat de laborator, mănuși și ochelari de protecție, în timp ce efectuați reacția într-o hotă de fum. Pentru a minimiza vigoarea reacției și, prin urmare, presurizarea, este important să se incubeze proba la gheață (5 min) înainte de derivatizare. Vă recomandăm să mențineți capacul închis cu un deget în timpul vortexării și să deschideți cu grijă tubul după aceea (se poate auzi un sunet de „pocnitură”). Alternativ, tubul poate fi ținut deschis în timpul vortexării, în funcție de preferințele cercetătorului (am constatat că conținutul tubului nu se varsă atunci când este manipulat cu atenție). Ulterior, acetatul derivatizat (acetat de propil) poate fi extras cu ușurință în solvent organic (MTBE), urmat de analiza GC-MS (Fig. 1).

Alți alcooli primari (de exemplu, metanol și etanol care produc acetat de metil și, respectiv, de etil) pot fi, de asemenea, utilizați pentru derivatizare. Cu toate acestea, am constatat că, în cazul coloanei noastre GC cu polaritate medie (pe care o considerăm foarte potrivită pentru analiza unei game largi de metaboliți), acetatul de propil oferă forma optimă a vârfului și timpul de retenție pentru o analiză rapidă. Protocolul de pregătire a probelor descris aici este foarte rapid, cu un timp total de derivatizare de mai puțin de 1 minut pentru fiecare probă. Împreună cu programul scurt de GC-MS, cu un timp total de execuție de 4 min pe eșantion, acest lucru facilitează analiza de mare randament. În timp ce izotopologii acetatului 12C-acetat, U-13C-acetat și 2H3-acetat au timpi de retenție aproape identici, vârfurile lor pot fi ușor deconvoluționate cu ajutorul unor ioni specifici (Fig. 3). Așa cum se observă în general în analiza GC a analiților deuterați, derivatul 2H3-acetat are un timp de retenție ușor mai scurt din cauza efectului izotopic invers . Ionii m/z 61, 63 și 64 pentru 12C2-acetat, U-13C2-acetat și, respectiv, 2H3-acetat, au fost utilizați pentru cuantificarea absolută și au prezentat un răspuns liniar optim.

Validarea metodei

Pentru a evalua repetabilitatea procedurii de pregătire și analiză a probelor, am determinat abaterea standard relativă (RSD) pentru 12C- și U-13C-acetat în standardele proaspăt preparate la 50, 200 și 1000 μM pentru izotopologii acetatului respectiv. Metoda a arătat o repetabilitate excelentă, cu o RSD < 5 % pentru standarde și < 10 % pentru probele biologice (Fișier suplimentar 1: Tabelul S2). Intervalul liniar de cuantificare a fost evaluat prin analiza standardelor diluați în serie atât de 12C- cât și de U-13C-acetat în intervalul 2-2000 μM. Nu am reușit să determinăm limita de detecție (LOD) pentru 12C-acetat, deoarece în probele noastre a fost întotdeauna prezent un semnal de fond de acetat de aproximativ 15 μM, chiar dacă au fost utilizați numai reactivi de cea mai mare puritate. Se pare că acetatul este un contaminant de urmă comun în atmosferă și în reactivi, precum și în plastic și sticlărie, similar cu ceea ce s-a observat pentru acizii grași cu lanț mai lung . Pentru a investiga acest lucru în continuare, am încercat să determinăm sursele exacte de acetat de fond (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Deoarece analizăm acetatul în forma sa derivatizată de propil-acetat, semnalul de fond pe care îl observăm în mod obișnuit ar putea proveni fie din propil-acetat direct, fie din acetatul de fond care este derivatizat în propil-acetat în timpul preparării probei. Pentru a examina prezența propil-acetatului de fond, am efectuat un experiment atât în vase de plastic, cât și în vase de sticlă, în care am analizat nivelul de propil-acetat în reactivii utilizați pentru derivatizarea chimică. Am observat că 1-propanolul are cel mai ridicat nivel de propil-acetat de fond, dar că acesta reprezintă doar ~10 % din acetatul de fond observat în blanchetele de procedură (PB, adică probele albe care au fost supuse întregii proceduri de pregătire a probelor și de analiză prin spectrometrie de masă), ceea ce indică faptul că acetatul liber, mai degrabă decât propil-acetatul, este principalul contaminant. Din păcate, toți reactivii sunt necesari pentru derivatizare, astfel încât nu putem determina ce reactiv conține cel mai mult acetat de fond. Cu toate acestea, am efectuat întreaga procedură de derivatizare și extracție pe eșantioane goale, atât în tuburi de sticlă, cât și în tuburi de plastic. Am constatat că, în plastic, fondul de acetat rezultat este cu ~50 % mai mare decât în sticlă. Datorită comodității sale, preferăm în continuare să lucrăm cu tuburi de plastic și lăsăm această decizie la latitudinea fiecărui investigator în parte.

Indiferent de fondul de acetat, deoarece răspunsul s-a dovedit a fi foarte liniar, am putut să sustragem semnalul de fond (cuantificăm fondul de acetat folosind probe martor care au fost supuse întregii proceduri de pregătire a probei și de analiză prin spectrometrie de masă, adică martori de procedură), rezultând un interval dinamic liniar de la 2 la 2000 μM atât pentru 12C-acetat, cât și pentru U-13C-acetat. Limita de cuantificare (LOQ) determinată pentru U-13C-acetat a fost de 0,1 μM. Pentru a reduce la minimum contaminarea cu 12C-acetat, recomandăm pregătirea de reactivi proaspeți în mod regulat (săptămânal) și recomandăm, de asemenea, includerea de rutină a blanchetelor de procedură. De remarcat, sugerăm utilizatorilor să își cuantifice propriul semnal de fond al acetatului, deoarece acesta depinde de materialele și reactivii utilizați și, prin urmare, este foarte probabil să fie specific laboratorului.

Considerăm că abordarea noastră este o alternativă optimizată la alte metode de derivatizare publicate, pentru măsurarea rapidă a acetatului . O abordare bazată pe sililarea acetatului cu N-tert-butildimetilsililil-N-metiltrifluoroacetamidă (MTBSTFA) a arătat un interval liniar larg pentru cuantificarea acetatului (0-3500 μM), o repetabilitate ridicată și o abatere standard relativă scăzută (RSD < 5 %) . Cu toate acestea, nu este potrivit pentru prelucrarea probelor pe bază de apă, etapele multiple de extracție pot duce la niveluri ridicate de acetat de fond, iar timpul de execuție a MS este lung pentru analiza numai a acetatului. O abordare bazată pe alchilarea cu ajutorul cloroformiatului de propil (PCF) este similară cu a noastră în ceea ce privește metodologia și performanța analitică, dar utilizează volume mai mari de reactivi (ceea ce sporește riscul unor niveluri de fond ridicate de acetat) și timpi de execuție MS mai lungi, deoarece nu a fost optimizată pentru acetat în mod specific, și nu menționează formatul . Limita inferioară de cuantificare publicată a fost comparabilă cu metoda noastră (15 μM pentru metoda actuală față de 16 μM raportată de Zheng et al. ). Zheng et al. au raportat un interval mai larg de răspuns liniar, și anume 16 μM-8 mM. Noi nu am testat dincolo de 2 mM, deoarece nu am observat niveluri atât de ridicate într-un context fiziologic. S-a observat că repetabilitatea raportată este foarte similară cu 0,54 % RSD (n = 6) raportată de Zheng et al. , și ~0,7 % RSD (n = 3) în funcție de concentrația de acetat, raportată în metoda actuală pentru probele standard (abaterile standard relative rezumate în Fișierul suplimentar 1: Tabelul S2). În cele din urmă, o altă metodă bazată pe GC-MS pentru analiza acizilor grași cu lanț scurt a utilizat 2,4-difluoroanilină și 1,3-diciclocarbodiimidă ca reactivi de condensare, ceea ce a necesitat o etapă de incubare de 1 h . În general, lucrarea prezentată aici aduce următoarele contribuții, în plus față de metodele deja publicate : (1) o metodă optimizată pentru acetat, precum și o metodă adaptată pentru măsurarea formiatului, (2) o discuție aprofundată despre acetatul de fond, sursele sale potențiale și modul de tratare a acestuia într-o manieră practică și (3) o abordare pentru a măsura nu numai acetatul liber, ci și acetatul legat.

Protocolul de pregătire a probei include adăugarea de hidroxid de sodiu pentru a facilita reacția de alchilare. Deși acest lucru se întâmplă imediat înainte de reacția de derivatizare, iar probele sunt răcite, acest lucru ar putea avea ca rezultat potențial o hidroliză nedorită a biomoleculelor acetilate, ceea ce ar putea duce la creșterea nivelului de acetat liber. Pentru a testa dacă acest lucru se întâmplă, am efectuat pregătirea și analiza probelor pe soluții de 10 mM de acid N-acetil-l-aspartic (NAA) și N-acetil-l-cisteină (NAC), 1 g/L de BSA, precum și pe blancuri de procedură. Deoarece acetilarea aminoacizilor este cea mai abundentă sursă de acetat legat, iar noi nu am observat o creștere semnificativă a semnalului, concluzionăm că aportul acetatului legat hidrolizat este neglijabil (Fig. 4).

Cuantificarea acetatului în probe biologice

După ce am stabilit că metoda noastră poate cuantifica cu precizie și în mod reproductibil acetatul, am vrut apoi să determinăm dacă aceasta poate reproduce rezultatele stabilite anterior. Prin urmare, am cuantificat acetatul în plasma de la opt persoane sănătoase. Concentrațiile plasmatice de acetat au variat de la 20 la 51 μM, cu o concentrație mediană de 34,1 ± 9,0 μM (datele nu sunt prezentate). Aceasta se încadrează în valorile publicate anterior de 41,9 ± 15,1 μM și 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

Recent, mai multe studii au identificat un rol important pentru enzima acetil-CoA sintetază 2 (ACSS2) în medierea creșterii tumorale în condiții hipoxice și de limitare a nutrienților . ACSS2 „activează” acetatul în AcCoA, astfel încât acesta poate fi utilizat pentru reacțiile metabolice din aval, inclusiv pentru lipogeneză. Într-adevăr, adăugarea de U-13C-acetat în mediul celulelor canceroase cultivate a evidențiat o marcare crescută a AcCoA lipogenic și, în consecință, a acizilor grași, în condiții hipoxice în comparație cu cele normoxice . Cu toate acestea, nu se știe în ce măsură această marcare crescută este cauzată de o creștere a absorbției de acetat. Pentru a aborda acest aspect, am cultivat celule de carcinom pulmonar A549 în condiții normoxice sau hipoxice (1 % O2) în mediu care conținea 500 μM U-13C-acetat și am urmărit concentrația acestuia în timp folosind noua noastră metodă (Fig. 5). În concordanță cu marcarea observată a AcCoA lipogenică din U-13C-acetat, s-a observat un consum robust de U-13C-acetat de către celulele hipoxice, evidențiat de o reducere clară în mediu. În mod surprinzător, în timp ce marcarea AcCoA lipogenic în condiții normoxice este considerabil mai mică decât în hipoxie , celulele normoxice au prezentat, de asemenea, un consum avid de U-13C-acetat. Ratele de absorbție a acetatului pentru celulele hipoxice au fost cu 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL de celule (PCV) modest mai mari decât pentru celulele normoxice (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL de celule). Aceste rezultate sugerează că marcarea crescută a AcCoA lipogenic din U-13C-acetat în hipoxie (creștere de ~ 3 ori, datele nu sunt prezentate) nu poate fi explicată pe deplin prin creșterea absorbției de acetat. În schimb, este posibil ca marcarea crescută să fie parțial cauzată de o scădere a producției de AcCoA lipogenic din glucoză în celulele hipoxice, ceea ce duce la umflarea contribuției relative a acetatului. Suntem în curs de investigare în continuare a acestui aspect.

Concentrația de acetat liber în țesuturile și fluidele de șoarece

Experimentele de urmărire izotopică in vivo au demonstrat utilizarea acetatului exogen de către tumori, confirmând un rol critic pentru ACSS2 în medierea creșterii în diferite tipuri de cancer. Cu toate acestea, disponibilitatea acetatului pentru tumorile solide și modul în care aceasta variază între organele gazdă rămâne în mare parte necunoscută. În încercarea de a aborda acest aspect, am analizat țesuturi din mai multe organe de șoarece (C57BL/6) (inimă, rinichi, ficat, plămâni, pancreas, splină, timus), precum și plasmă și urină (Fig. 6). Dintre toate organele analizate, ficatul conținea cea mai mare concentrație de acetat liber, cu o concentrație medie de 1,0 ± 0,1 nmole de acetat pe mg de țesut (adică ~1 mM), de peste două ori mai mult decât orice alt țesut. Nutrienții absorbiți de intestin vor trece mai întâi prin ficat prin vena portală. S-a raportat că concentrații milimolare ridicate de acetat și alți acizi grași cu lanț scurt sunt generate de microbiota intestinală , iar acest lucru oferă o justificare pentru concentrația ridicată de acetat din ficat. Deoarece concentrația de acetat în ficat este mult mai mare decât în circulația sistemică (adică în plasmă) și în plămâni, care conțin primul sistem capilar care va fi perfuzat de sânge după trecerea ficatului, se pare că ficatul captează cantități substanțiale de acetat pentru utilizare metabolică. Acetatul a fost, de asemenea, îmbogățit considerabil în pancreas și rinichi în raport cu plasma, cu concentrații de 0,5 ± 0,04 și 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 și, respectiv, 0,4 mM). Motivul pentru un nivel ridicat de acetat în pancreas rămâne să fie elucidat. Una dintre funcțiile rinichilor este de a elimina din sânge excesul de metaboliți toxici sau solubili în apă și, având în vedere că concentrația de acetat în urină este substanțial mai mare decât în plasmă, este posibil ca acetatul să fie de fapt excretat în mod activ din organism ca „deșeu” metabolic. Nivelurile de acetat au fost considerabil mai mici în alte țesuturi, cea mai mică valoare fiind găsită în splină, la o concentrație similară cu cea din plasmă. Împreună, aceste observații evidențiază faptul că disponibilitatea acetatului poate varia considerabil de la un organ la altul, ceea ce are implicații asupra metabolismului tumoral.

Analiza acetatului legat în fracțiile (sub)celulare și histonice

AcCoA ocupă un nod central în metabolism și este implicat în sinteza biomasei, în căile catabolice și în producția de energie. Din acest motiv, AcCoA joacă un rol important în reglarea metabolică . Aceasta are loc în parte prin acetilarea biomoleculelor, inclusiv a unei varietăți de proteine . De exemplu, acetilarea histonelor favorizează transcrierea genelor și a fost observată o corelație între gradul de acetilare a histonelor și agresivitatea tumorilor . O dovadă suplimentară a importanței homeostaziei acetilării în progresia cancerului provine din observarea faptului că întreruperea dinamicii acetilării prin inhibarea deacetilazelor (de exemplu, HDAC, sirtuine) duce la o puternică inducție a morții celulelor canceroase . În timp ce mai multe aspecte ale acetilației sunt studiate pe larg, rămân multe necunoscute cu privire la dimensiunile absolute ale bazinelor și la fluctuația acetatului legat de biomolecule în diversele compartimente celulare, ca să nu mai vorbim de modul în care acestea sunt afectate de condițiile relevante pentru tumori. Pentru a aborda acest aspect, am combinat abordarea noastră cu hidroliza în condiții de bază. Prin încălzirea probelor și incubarea lor peste noapte cu hidroxid de sodiu, legăturile esterice se hidrolizează, eliberând acetat liber, care poate fi apoi derivatizat și analizat ca înainte. Utilizarea acestei abordări pe un extract de celule întregi ne-a permis să cuantificăm acetatul total (legat + liber) în celulele A549 la 0,38 μmole/mg de proteină celulară totală. Ne-am întrebat apoi dacă ar fi posibil să cuantificăm acetatul legat în compartimente celulare separate. Am realizat o separare aproape completă a fracțiunilor nucleare și a fracțiunilor celulare reziduale (combinație de citosol și organite, altele decât nucleul) folosind un kit comercial de izolare nucleară (a se vedea secțiunea „Metode”) (Fig. 7b). Am constatat că conținutul de acetat legat a fost aproximativ egal pentru fracțiunile nucleare și reziduale (Fig. 7c). Suma celor două fracții a fost egală cu ~80 % din măsurarea celulei întregi, ceea ce este cel mai probabil cauzat de recuperarea redusă în timpul fracționării, dar poate fi cauzat și de pierderea de acetat liber. Exprimarea conținutului de acetat per mg de proteină în fiecare fracție a arătat că densitatea de acetilare în nucleu este de aproximativ trei ori mai mare decât în fracția celulară reziduală (Fig. 7d). Se știe că histonele sunt puternic acetilate și, pentru a determina cât de mult din acetatul nuclear era legat de histone, am comparat rezultatele abordării de izolare nucleară cu un protocol publicat de extracție acidă a histonei (Fig. 7e-g) . Ambele abordări au dat valori foarte asemănătoare, ceea ce indică faptul că aproape tot acetatul legat din fracția nucleară se datorează acetilării histonelor. Astfel, acetilarea histonelor reprezintă singură jumătate din totalul acetatului celular.

Această abordare pentru cuantificarea acetatului legat de histone poate ajuta la o mai bună înțelegere a efectului acetilării histonelor în diverse studii legate de cancer. Pentru a demonstra utilitatea abordării, am tratat celulele A549 cu panobinostat, un inhibitor al pan-histone deacetilazei (HDAC). O incubare scurtă, de 4 ore, cu panobinostat a provocat o aproape dublare a cantității de acetat legat de histone, demonstrând că rotația acetilării histonelor este destul de rapidă (Fig. 7h).

Măsurarea formiatului și a altor acizi grași cu lanț scurt

Prin modificarea agentului de derivatizare, metoda este ușor adaptabilă la alți acizi grași cu lanț scurt, inclusiv la formiat. Cuplarea formiatului cu alcoolul benzilic generează un derivat de formiat (formiat de benzil), care poate fi analizat cu ușurință prin GC-MS (a se vedea procedurile experimentale suplimentare Fișier suplimentar 1: S1). Am menționat anterior că metoda GC-MS pentru analiza acetatului durează doar 4 min, detectorul de masă funcționând între 2,2 și 2,7 min. Aceeași metodă este capabilă să analizeze și să cuantifice propionatul și butiratul sub formă de propil-propionat și propil-butirat, utilizând aceeași configurație a metodei de derivatizare a probei ca și pentru acetat. Prin extinderea timpului de funcționare a detectorului de masă de la 2,2 la 4 min, am reușit să detectăm vârfurile de propionat și butirat care se eluează la 2,92 și, respectiv, 3,30 min. Utilizând ionii m/z 75 și 89 pentru propionat și, respectiv, butirat, este posibilă cuantificarea absolută a acestor acizi grași cu lanț scurt.

Arquidia Mantina