Een snelle methode voor het kwantificeren van vrij en gebonden acetaat op basis van alkylering en GC-MS analyse

Methodebeschrijving

Wij ontwikkelden een robuuste en high-throughput methode voor absolute acetaat kwantificering in biologische monsters. De methode is gebaseerd op derivatisering met behulp van een gevestigde reactie met methylchloroformaat (MCF) . Na achtereenvolgens interne standaard, 1-propanol, pyridine en natriumhydroxide te hebben toegevoegd, wordt de derivatatiereactie op gang gebracht door zo snel mogelijk MCF toe te voegen. De chemische modificatie vindt plaats in basische omstandigheden door de aanwezigheid van natriumhydroxide, terwijl pyridine het reactiesysteem homogeen houdt aangezien MCF niet in water alleen oplost (fig. 1). 1-Propanol wordt gebruikt als koppelingsreagens om propyl-acetaat te produceren (fig. 2). Wanneer onmiddellijk vóór de toevoeging van MCF natriumhydroxide aan het afgekoelde monster wordt toegevoegd, treedt geen hydrolyse op (zie hieronder). Alkylering van acetaat met MCF vergemakkelijkt een snelle verdere modificatie van acetaat in waterige omstandigheden. In dit geval wordt het acetaat-MCF tussenproduct (I) aangevallen door de alcohol (1-propanol), en het resulterende tussenproduct (II) ondergaat verdere herschikkingen, wat leidt tot de vorming van propyl-acetaat. Dergelijke derivatiseringsmethoden met behulp van de chloroformaatfamilie van reagentia zijn goed beschreven. Om het rendement van de derivatisering en de daaropvolgende extractie in MTBE te kwantificeren, vergeleken we de MS-signaalintensiteit van 1 mM acetaat gealkyleerd tot propyl-acetaat met een equimolaire concentratie van commercieel verkregen propyl-acetaat in MTBE. Op basis hiervan vonden we de recovery 95,5 ± 1,57 % (Additional file 1: tabel S1).

De derivatatiereactie met MCF is krachtig en exotherm, waarbij gassen vrijkomen (zoutzuurgas, kooldioxide) die de druk in de buis doen toenemen. Daarom wordt aanbevolen de algemene gezondheids- en veiligheidsvoorschriften na te leven wanneer chemische derivatisering wordt uitgevoerd, d.w.z. een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril te dragen, en de reactie in een zuurkast uit te voeren. Om de kracht van de reactie en dus de druk te minimaliseren, is het belangrijk het monster op ijs te incuberen (5 min) vóór de derivatisering. Het verdient aanbeveling het deksel tijdens het vortexen met één vinger gesloten te houden en het buisje daarna voorzichtig te openen (er is een “poppend” geluid hoorbaar). Als alternatief kan de buis tijdens het vortexen geopend worden gehouden, afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker (wij vinden dat de inhoud van de buis niet morst als er voorzichtig mee wordt omgegaan). Daarna kan de gederivatiseerde acetaat (propyl-acetaat) gemakkelijk worden geëxtraheerd in organisch oplosmiddel (MTBE), gevolgd door de GC-MS analyse (Fig. 1).

Andere primaire alcoholen (bijvoorbeeld methanol en ethanol produceren methyl-en ethylacetaat, respectievelijk) kan ook worden gebruikt voor derivatisering. Wij vonden echter dat met onze mid-polaire GC-kolom (die wij zeer geschikt vinden voor de analyse van een breed scala van metabolieten), propyl-acetaat de optimale piekvorm en retentietijd voor een snelle analyse biedt. Het hier beschreven monsterbereidingsprotocol is zeer snel met een totale derivatiseringstijd van minder dan 1 min per monster. Samen met het korte GC-MS programma met een totale run tijd van 4 min per monster, vergemakkelijkt dit high-throughput analyse. Terwijl de acetaatisotopologen 12C-acetaat, U-13C-acetaat en 2H3-acetaat bijna identieke retentietijden hebben, kunnen hun pieken gemakkelijk worden gedeconvolueerd met behulp van specifieke ionen (Fig. 3). Zoals algemeen wordt waargenomen bij GC-analyse van geduterateerde analyten, heeft het 2H3-acetaatderivaat een iets kortere retentietijd als gevolg van het inverse isotoopeffect. Ionen m/z 61, 63 en 64 voor respectievelijk 12C2-acetaat, U-13C2-acetaat en 2H3-acetaat werden gebruikt voor absolute kwantificering en vertoonden een optimale lineaire respons.

Methodevalidatie

Om de herhaalbaarheid van de monstervoorbereiding en de analyseprocedure te beoordelen, bepaalden we de relatieve standaardafwijking (RSD) voor 12C- en U-13C-acetaat in vers bereide standaarden bij 50, 200, en 1000 μM voor de respectieve acetaatisotopologieën. De methode vertoonde een uitstekende herhaalbaarheid met een RSD < 5 % voor standaarden en < 10 % voor biologische monsters (Additional file 1: tabel S2). Het lineaire bereik van de kwantificering werd beoordeeld door analyse van serieel verdunde standaarden van zowel 12C- als U-13C-acetaat binnen het bereik 2-2000 μM. We waren niet in staat om de aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor 12C-acetaat bepalen als een achtergrond acetaat signaal van ongeveer 15 uM was altijd aanwezig in onze monsters, ook al alleen reagentia van de hoogste zuiverheid werden gebruikt. Het lijkt erop dat acetaat is een gemeenschappelijke spoor verontreiniging in de atmosfeer en reagentia, alsmede in de kunststof en glaswerk, vergelijkbaar met wat is waargenomen voor langere keten vetzuren . Om dit verder te onderzoeken, hebben wij getracht de exacte bronnen van achtergrondacetaat te bepalen (Additional file 1: figuur S1). Aangezien wij acetaat in zijn gederivatiseerde propyl-acetaatvorm analyseren, zou het achtergrondsignaal dat wij gewoonlijk waarnemen hetzij van propyl-acetaat direct kunnen zijn of van achtergrondacetaat dat aan propyl-acetaat tijdens de steekproefvoorbereiding wordt gederivatiseerd. Om de aanwezigheid van achtergrondpropylacetaat te onderzoeken, hebben wij een experiment uitgevoerd in zowel plastic als glaswerk, waarbij wij het gehalte aan propylacetaat analyseerden in reagentia die voor chemische derivatisering werden gebruikt. Wij stelden vast dat 1-propanol de hoogste achtergrond propyl-acetaat heeft, maar dat het slechts ~10 % van de achtergrond acetaat waargenomen in procedure blanks (PB, d.w.z. blanco monsters die zijn onderworpen aan de gehele monsterbereiding en mass spec analyse procedure), wat aangeeft dat vrij acetaat, in plaats van propyl-acetaat is de belangrijkste verontreiniging. Helaas zijn alle reagentia nodig voor de derivatisering, zodat wij niet kunnen bepalen welk reagens het meeste achtergrondacetaat bevat. Wij hebben echter de gehele derivatatie- en extractieprocedure uitgevoerd op blanco monsters in zowel glazen als plastic buisjes. Wij vonden dat in plastic de resulterende acetaatachtergrond ~50 % hoger is dan in glas. Vanwege het gemak geven wij nog steeds de voorkeur aan het werken met plastic buisjes en laten wij deze beslissing over aan de individuele onderzoeker.

Oongeacht het achtergrondacetaat, aangezien de respons zeer lineair bleek, konden wij het achtergrondsignaal aftrekken (wij kwantificeren de acetaatachtergrond met behulp van blanco monsters die zijn onderworpen aan de gehele monstervoorbereiding en mass spec analyseprocedure, d.w.z. procedureblanco’s), hetgeen resulteert in een lineair dynamisch bereik van 2 tot 2000 μM voor zowel 12C-acetaat als U-13C-acetaat. De vastgestelde bepaalbaarheidsgrens (LOQ) voor U-13C-acetaat was 0,1 μM. Om de 12C-acetaatverontreiniging tot een minimum te beperken, bevelen wij aan regelmatig (wekelijks) verse reagentia te bereiden en routinematig procedureblanco’s toe te voegen. Van de nota, raden wij gebruikers aan hun eigen achtergrond acetaat signaal kwantificeren als het afhankelijk is van de gebruikte materialen en reagentia en daarom is het zeer waarschijnlijk lab-specific.

Wij beschouwen onze aanpak als een geoptimaliseerd alternatief voor andere gepubliceerde derivatisatie methoden, voor de snelle meting van acetaat . Een aanpak op basis van silylering van acetaat met N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) toonde een breed lineair bereik voor acetaat kwantificering (0-3500 μM), hoge herhaalbaarheid en een lage relatieve standaardafwijking (RSD < 5 %) . De methode is echter niet geschikt voor de verwerking van monsters op waterbasis, de meervoudige extractiestappen kunnen leiden tot hoge achtergrondacetaatniveaus, en de MS-runtime is lang voor de analyse van acetaat alleen. Een aanpak op basis van alkylering met propylchloroformaat (PCF) is vergelijkbaar met de onze wat methodologie en analyseprestaties betreft, maar maakt gebruik van grotere reagensvolumes (waardoor het risico van hoge acetaatachtergrondniveaus toeneemt) en langere MS-reeksen aangezien hij niet specifiek voor acetaat is geoptimaliseerd, en hij vermeldt geen formiaat. De gepubliceerde ondergrens van kwantificering was vergelijkbaar met onze methode (15 μM voor de huidige methode versus 16 μM gerapporteerd door Zheng et al. ). Zheng et al. meldden een breder bereik van lineaire respons, d.w.z. 16 μM-8 mM. Wij hebben niet meer dan 2 mM getest, aangezien wij dergelijke hoge niveaus in een fysiologische context niet hebben waargenomen. De herhaalbaarheid werd waargenomen zeer vergelijkbaar met 0,54% RSD (n = 6) gerapporteerd door Zheng et al., en ~ 0,7% RSD (n = 3) afhankelijk van de acetaat concentratie, gerapporteerd in de huidige methode voor standaard monsters (relatieve standaarddeviaties samengevat in Additional file 1: tabel S2). Ten slotte werden bij een andere GC-MS-methode voor de analyse van vetzuren met een korte keten 2,4-difluoraniline en 1,3-dicyclocarbodiimide als condensatiereagentia gebruikt, waarvoor een incubatiestap van 1 uur nodig was. In het algemeen draagt het hier gepresenteerde werk het volgende bij, in aanvulling op de reeds gepubliceerde methoden: (1) een geoptimaliseerde methode voor acetaat, alsmede een aangepaste methode om formiaat te meten, (2) een diepgaande discussie over achtergrondacetaat, de mogelijke bronnen, en hoe er op een praktische manier mee om te gaan, en (3) een benadering om niet alleen vrij acetaat te meten, maar ook gebonden acetaat.

Het monsterbereidingsprotocol omvat de toevoeging van natriumhydroxide om de alkyleringsreactie te vergemakkelijken. Hoewel dit gebeurt onmiddellijk voorafgaand aan de derivatisatiereactie en de monsters worden gekoeld, kan dit mogelijk resulteren in ongewenste hydrolyse van geacetyleerde biomoleculen, wat leidt tot verhoogde niveaus van vrij acetaat. Om te testen of dit gebeurt, voerden we monstervoorbereiding en analyse uit op 10 mM oplossingen van N-acetyl-l-asparaginezuur (NAA) en N-acetyl-l-cysteïne (NAC), 1 g/L van BSA en procedure blanco’s. Aangezien aminozuuracetylatie de meest voorkomende bron van gebonden acetaat is, en we geen significante toename van het signaal waarnamen, concluderen we dat de bijdrage van gehydrolyseerd gebonden acetaat te verwaarlozen is (Fig. 4).

Acetaat kwantificering in biologische monsters

Hoeven vastgesteld dat onze methode nauwkeurig en reproduceerbaar kan kwantificeren acetaat, we vervolgens wilden bepalen of het kan reproduceren eerder vastgestelde resultaten. Daarom kwantificeerden wij acetaat in plasma van acht gezonde personen. De plasmaacetaatconcentraties varieerden van 20 tot 51 μM met een mediane concentratie van 34,1 ± 9,0 μM (gegevens niet weergegeven). Dit valt binnen de eerder gepubliceerde waarden van 41,9 ± 15,1 μM en 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

Recentelijk hebben meerdere studies een belangrijke rol vastgesteld voor het enzym acetyl-CoA synthetase 2 (ACSS2) in het mediëren van tumorgroei tijdens hypoxische en nutriënten-gelimiteerde omstandigheden. ACSS2 “activeert” acetaat tot AcCoA, zodat het kan worden gebruikt voor metabolische reacties stroomafwaarts, waaronder lipogenese. Toevoeging van U-13C-acetaat aan het medium van gekweekte kankercellen toonde inderdaad een verhoogde labeling van lipogeen AcCoA, en bijgevolg van vetzuren, in hypoxische omstandigheden in vergelijking met normoxische omstandigheden. In welke mate deze verhoogde labeling veroorzaakt wordt door een verhoogde acetaatopname blijft echter onbekend. Om dit aan te pakken, hebben we gekweekt A549 longcarcinoom cellen in normoxische of hypoxische (1% O 2) omstandigheden in het medium met 500 uM U-13C-acetaat, en volgde de concentratie in de tijd met behulp van onze nieuwe methode (Fig. 5). In overeenstemming met de waargenomen etikettering van lipogene AcCoA van U-13C-acetaat, werd een robuuste consumptie van U-13C-acetaat door hypoxische cellen waargenomen, zoals blijkt uit een duidelijke vermindering in het medium. Verrassend genoeg, terwijl de labeling van lipogeen AcCoA in normoxische omstandigheden aanzienlijk minder is dan in hypoxie, vertoonden normoxische cellen ook een gretige U-13C-acetaat consumptie. De acetaatopnamesnelheden voor hypoxische cellen waren met 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL cellen (PCV) bescheiden hoger dan voor normoxische cellen (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL cellen). Deze resultaten suggereren dat de verhoogde labeling van lipogeen AcCoA uit U-13C-acetaat bij hypoxie (~3-voudige toename, gegevens niet weergegeven) niet volledig verklaard kan worden door een verhoogde acetaatopname. In plaats daarvan is de verhoogde etikettering waarschijnlijk deels veroorzaakt door een daling van de productie van lipogeen AcCoA uit glucose in hypoxische cellen, wat leidt tot inflatie van de relatieve bijdrage van acetaat. We zijn bezig dit verder te onderzoeken.

Vrije acetaatconcentratie in muisweefsels en -vloeistoffen

In vivo isotopische traceringsexperimenten toonden het gebruik van exogeen acetaat door tumoren aan, wat een cruciale rol voor ACSS2 bevestigt bij het bemiddelen van de groei in diverse kankers. De beschikbaarheid van acetaat voor solide tumoren en hoe dit varieert tussen gastheerorganen blijft echter grotendeels onbekend. In een poging om dit aan te pakken, analyseerden we weefsels van meerdere muis (C57BL / 6) organen (hart, nier, lever, long, pancreas, milt, thymus) evenals plasma en urine (Fig. 6). Van alle geanalyseerde organen bevatte de lever de hoogste concentratie vrij acetaat met een gemiddelde concentratie van 1,0 ± 0,1 nmol acetaat per mg weefsel (d.w.z. ~1 mM), meer dan tweemaal zoveel als elk ander weefsel. Voedingsstoffen die door de darm worden opgenomen, passeren eerst de lever via de poortader. Hoge millimolaire concentraties van acetaat en andere vetzuren met een korte keten worden naar verluidt gegenereerd door de darmmicrobiota, en dit vormt een verklaring voor de hoge acetaatconcentratie in de lever. Aangezien de concentratie van acetaat in de lever veel hoger is dan in de systemische circulatie (d.w.z. plasma) en de longen, die het eerste capillaire systeem bevatten dat doorbloed wordt na passage van de lever, lijkt de lever aanzienlijke hoeveelheden acetaat op te vangen voor metabolisch gebruik. Acetaat was ook aanzienlijk verrijkt in de pancreas en de nieren in vergelijking met plasma, met concentraties van respectievelijk 0,5 ± 0,04 en 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 en 0,4 mM). De reden voor het hoge acetaatgehalte in de pancreas moet nog worden opgehelderd. Een van de functies van de nieren is het verwijderen van in water oplosbare overtollige of toxische metabolieten uit het bloed en aangezien de acetaatconcentratie in de urine aanzienlijk hoger is dan in het plasma, zou acetaat wel eens actief uit het lichaam kunnen worden uitgescheiden als metabolisch “afval”. De acetaatconcentraties waren aanzienlijk lager in andere weefsels, waarbij de laagste waarde werd aangetroffen in de milt met een concentratie die vergelijkbaar was met die in plasma. Samen tonen deze waarnemingen aan dat de beschikbaarheid van acetaat aanzienlijk kan variëren tussen organen, wat implicaties heeft voor het metabolisme van tumoren.

Analyse van gebonden acetaat in (sub)cellulaire en histonfracties

AcCoA neemt een centrale plaats in het metabolisme in en is betrokken bij de synthese van biomassa, katabole routes en de energieproductie. Daarom speelt AcCoA een belangrijke rol bij de regulering van het metabolisme. Dit gebeurt gedeeltelijk door acetylering van biomoleculen, waaronder een verscheidenheid van eiwitten. Zo bevordert acetylering van histon-eiwitten de transcriptie van genen en is er een correlatie waargenomen tussen de mate van histon-acetylering en de agressiviteit van tumoren. Verder bewijs voor het belang van acetylatie homeostase in kankerprogressie komt van de observatie dat het verstoren van acetylatie dynamica door remming van deacetylases (d.w.z., HDACs, sirtuins) leidt tot krachtige inductie van kanker celdood. Hoewel verschillende aspecten van acetylatie uitgebreid bestudeerd worden, blijft er nog veel onbekend over de absolute poolgrootte en de omzet van acetaat gebonden aan biomoleculen in de verschillende celcompartimenten, laat staan hoe ze beïnvloed worden door tumor-relevante condities. Om dit aan te pakken, combineerden we onze aanpak met hydrolyse in basisomstandigheden. Door de monsters te verhitten en ze ’s nachts met natriumhydroxide te incuberen, hydrolyseren de esterverbindingen, waarbij vrij acetaat vrijkomt, dat vervolgens kan worden gederivatiseerd en geanalyseerd zoals voorheen. Met behulp van deze aanpak op een hele cel extract konden we kwantificeren totaal (gebonden + gratis) acetaat in A549 cellen op 0,38 umole / g totaal cellulair eiwit. Vervolgens vroegen we of het mogelijk zou zijn om gebonden acetaat kwantificeren in afzonderlijke cel compartimenten. We bereikten een bijna-complete scheiding van de kern en de resterende cellulaire fracties (combinatie van cytosol en organellen anders dan de kern) met behulp van een commerciële nucleaire isolatie kit (zie “Methoden” sectie) (Fig. 7b). Wij vonden dat het gebonden acetaatgehalte ongeveer gelijk was voor de kern- en restfracties (Fig. 7c). De som van beide fracties was gelijk aan ~80% van de hele-cel meting, wat hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt wordt door verminderd herstel tijdens fractionering, maar kan ook veroorzaakt worden door verlies van vrij acetaat. Uitdrukken van het acetaatgehalte per mg eiwit in elke fractie bleek dat de acetylatie dichtheid in de kern is ongeveer drie keer hoger dan in de resterende cel fractie (Fig. 7d). Histonen zijn bekend dat zwaar geacetyleerd, en om te bepalen hoeveel van de nucleaire acetaat was histon-gebonden, vergeleken we de resultaten van de nucleaire isolatie aanpak met een gepubliceerde zure histon extractie protocol (Fig. 7e-g) . Beide benaderingen gaven zeer vergelijkbare waarden, wat aangeeft dat bijna alle gebonden acetaat in de kernfractie is te wijten aan histon-acetylering. Aldus, histon acetylatie alleen goed voor de helft van de totale cellulaire acetaat.

Deze benadering van het kwantificeren van histon gebonden acetaat kan helpen om het effect van histon acetylatie beter te begrijpen in verschillende kanker-gerelateerde studies. Om het nut van de aanpak aan te tonen, hebben we A549 cellen behandeld met panobinostat, een pan-histon deacetylase (HDAC) remmer. Een korte, 4-h incubatie met panobinostat veroorzaakt een bijna verdubbeling van de hoeveelheid histon-gebonden acetaat, waaruit blijkt dat histon acetylatie omzet vrij snel (Fig. 7h).

Meten van formiaat en andere korte-keten vetzuren

Door wijziging van de derivatiseringsmiddel, de methode is gemakkelijk aanpasbaar aan andere korte-keten vetzuren, waaronder formiaat. Koppelen formiaat met benzylalcohol genereert formiaat derivaat (benzylformiaat), die gemakkelijk kan worden geanalyseerd door GC-MS (zie aanvullende experimentele procedures Extra bestand 1: S1). We hebben eerder vermeld dat de GC-MS-methode voor acetaat analyse duurt slechts 4 min, met massadetector werken tussen 2,2 en 2,7 min. Dezelfde methode is in staat om te analyseren en te kwantificeren propionaat en butyraat in de vorm van propyl-propionaat en propyl-butyraat met behulp van hetzelfde monster derivatisatie methode setup als voor acetaat. Door de werkingstijd van de massadetector van 2,2 tot 4 min te verlengen, konden wij de propionaat- en butyraatpieken detecteren die bij respectievelijk 2,92 en 3,30 min elueerden. Met behulp van ionen m/z 75 en 89 voor propionaat en butyraat, respectievelijk, is het mogelijk om deze korte-keten vetzuren absoluut te kwantificeren.