A gyors módszer a szabad és kötött acetát mennyiségi meghatározására alkilálás és GC-MS analízis alapján

Módszer leírása

Robusztus és nagy áteresztőképességű módszert fejlesztettünk ki az abszolút acetát mennyiségi meghatározására biológiai mintákban. A módszer a metil-kloroformiáttal (MCF) történő deriváláson alapul egy bevált reakció segítségével . A belső standard, 1-propanol, piridin és nátrium-hidroxid szekvenciális hozzáadása után a derivatizációs reakciót a lehető leghamarabb MCF hozzáadásával indítjuk el. A kémiai módosítás bázikus körülmények között történik a nátrium-hidroxid jelenléte miatt, míg a piridin homogénen tartja a reakciórendszert, mivel az MCF önmagában nem oldódik vízben (1. ábra). A propil-acetát előállításához 1-propanolt használunk kapcsolási reagensként (2. ábra). Ha közvetlenül az MCF hozzáadása előtt nátrium-hidroxidot adunk a lehűtött mintához, nem következik be hidrolízis (lásd alább). Az acetát MCF-fel történő alkilezése megkönnyíti az acetát gyors további módosítását vizes körülmények között. Ebben az esetben az acetát-MCF köztiterméket (I) megtámadja az alkohol (1-propanol), és a keletkező köztitermék (II) további átrendeződéseken megy keresztül, ami propil-acetát kialakulásához vezet. Az ilyen, a klórformiát-reagensek családját használó deriválási megközelítések jól le vannak írva . A derivatizálás és az azt követő MTBE-be történő extrakció hozamának számszerűsítése érdekében összehasonlítottuk 1 mM propil-acetáttá alkilezett acetát MS jelintenzitását a kereskedelmi forgalomban előállított propil-acetát MTBE-ben lévő ekvimoláris koncentrációjával. Ez alapján 95,5 ± 1,57 %-os visszanyerést találtunk (Additional file 1: S1 táblázat).

Az MCF-fel történő derivatizációs reakció erőteljes és exoterm, gázok (sósavgáz, szén-dioxid) keletkeznek, amelyek a csőben a nyomás növekedését okozzák. Ezért javasoljuk az általános egészségügyi és biztonsági szabályok betartását a kémiai derivatizálás során, azaz viseljen laboratóriumi köpenyt, kesztyűt és védőszemüveget, a reakciót pedig füstelvezetőben végezze. A reakció hevességének és ezáltal a nyomásnövekedés minimalizálása érdekében fontos, hogy a mintát a derivatizálás előtt jégen inkubáljuk (5 perc). Javasoljuk, hogy a vortexelés során a fedelet egy ujjal tartsa zárva, és utána óvatosan nyissa ki a csövet (“pukkanó” hang hallható). Alternatív megoldásként a kutató preferenciájától függően a cső nyitva is tartható a vortexelés alatt (úgy tapasztaljuk, hogy a cső tartalma nem ömlik ki, ha óvatosan kezeljük). Ezután a derivatizált acetát (propil-acetát) könnyen kivonható szerves oldószerbe (MTBE), majd következhet a GC-MS analízis (1. ábra).

A derivatizáláshoz más primer alkoholok (pl. metil- és etil-acetátot előállító metanol és etanol) is használhatók. Úgy találtuk azonban, hogy a középpólusú GC-oszlopunkkal (amelyet nagyon alkalmasnak találunk a metabolitok széles körének elemzésére) a propil-acetát biztosítja az optimális csúcsformát és retenciós időt a gyors elemzéshez. Az itt leírt mintaelőkészítési protokoll nagyon gyors, a teljes deriválási idő kevesebb mint 1 perc mintánként. A rövid GC-MS programmal együtt, amelynek teljes futási ideje mintánként 4 perc, ez megkönnyíti a nagy áteresztőképességű elemzést. Bár az acetát izotópok 12C-acetát, U-13C-acetát és 2H3-acetát retenciós ideje közel azonos, csúcsaik könnyen dekonvolutálhatók specifikus ionok segítségével (3. ábra). Mint a deuterált analitok GC-analízisénél általában megfigyelhető, a 2H3-acetát származéknak az inverz izotóphatás miatt kissé rövidebb a retenciós ideje. A 12C2-acetát, az U-13C2-acetát és a 2H3-acetát m/z 61, 63 és 64 ionjait használtuk az abszolút mennyiségi meghatározáshoz, és optimális lineáris választ mutattak.

Módszer validálása

A mintaelőkészítési és analitikai eljárás megismételhetőségének értékeléséhez meghatároztuk a 12C- és U-13C-acetát relatív standard eltérését (RSD) a frissen készített standardokban 50, 200 és 1000 μM-on az adott acetát izotopológokra. A módszer kiváló ismételhetőséget mutatott, az RSD < 5 % a standardok esetében és < 10 % a biológiai minták esetében (Additional file 1: S2 táblázat). A mennyiségi meghatározás lineáris tartományát mind a 12C-, mind az U-13C-acetát sorozatosan hígított standardjainak elemzésével vizsgáltuk a 2-2000 μM tartományban. A 12C-acetát kimutatási határát (LOD) nem tudtuk meghatározni, mivel a mintáinkban mindig jelen volt egy körülbelül 15 μM-os acetát háttérjel, annak ellenére, hogy csak a legnagyobb tisztaságú reagenseket használtuk. Úgy tűnik, hogy az acetát gyakori nyom-szennyezőanyag a légkörben és a reagensekben, valamint a műanyagban és az üvegedényekben, hasonlóan a hosszabb láncú zsírsavak esetében megfigyeltekhez . Ennek további vizsgálatához igyekeztünk meghatározni a háttér-acetát pontos forrásait (Additional file 1: S1 ábra). Mivel az acetátot származékosított propil-acetát formájában elemezzük, az általunk gyakran megfigyelt háttérjel vagy közvetlenül a propil-acetátból, vagy a minta előkészítése során propil-acetáttá származékosított háttéracetátból származhat. A háttér-propil-acetát jelenlétének vizsgálatához műanyag és üvegedényekben is végeztünk egy kísérletet, amelyben elemeztük a kémiai derivatizáláshoz használt reagensekben lévő propil-acetát szintjét. Megfigyeltük, hogy az 1-propanol rendelkezik a legmagasabb háttér-propil-acetáttal, de ez csak ~10%-át teszi ki az eljárás üres mintákban (PB, azaz a teljes mintaelőkészítési és tömegspektrometriás elemzési eljárásnak alávetett üres minták) megfigyelt háttér-acetátnak, ami arra utal, hogy nem a propil-acetát, hanem a szabad acetát a fő szennyezőanyag. Sajnos a derivatizáláshoz minden reagensre szükség van, így nem tudjuk meghatározni, hogy melyik reagens tartalmazza a legtöbb háttér-acetátot. Elvégeztük azonban a teljes derivatizálási és extrakciós eljárást üres mintákon, üveg- és műanyag csövekben egyaránt. Azt találtuk, hogy műanyagban a keletkező acetát háttér ~50%-kal magasabb, mint üvegben. A kényelem miatt továbbra is inkább műanyag csövekkel dolgozunk, és ezt a döntést az egyes vizsgálókra bízzuk.

A háttér-acetáttól függetlenül, mivel a válasz igen lineárisnak bizonyult, képesek voltunk kivonni a háttérjelet (az acetát-háttér számszerűsítését olyan vakmintákkal végezzük, amelyeken a teljes mintaelőkészítési és tömegspektrométer-elemzési eljárást elvégeztük, azaz eljárási vakok), így mind a 12C-acetát, mind az U-13C-acetát esetében 2 és 2000 μM közötti lineáris dinamikai tartományt kaptunk. Az U-13C-acetát esetében a meghatározott mennyiségi határérték (LOQ) 0,1 μM volt. A 12C-acetát-szennyeződés minimálisra csökkentése érdekében javasoljuk, hogy rendszeresen (hetente) készítsen friss reagenseket, és javasoljuk továbbá, hogy rutinszerűen vegyen be eljárási vakteszteket. Megjegyezzük, hogy javasoljuk a felhasználóknak, hogy számszerűsítsék saját háttér-acetát jelüket, mivel az függ a felhasznált anyagoktól és reagensektől, és ezért nagy valószínűséggel labor-specifikus.

Megközelítésünket más publikált derivatizációs módszerek optimalizált alternatívájának tekintjük az acetát gyors mérésére . Az acetát N-tert-butildimetil-szililil-N-metiltrifluoracetamiddal (MTBSTFA) történő szilezésén alapuló megközelítés széles lineáris tartományt mutatott az acetát mennyiségi meghatározására (0-3500 μM), magas ismételhetőséget és alacsony relatív standard eltérést (RSD < 5 %) . Nem alkalmas azonban vízalapú minták feldolgozására, a többszörös extrakciós lépések magas háttér-acetát szinteket eredményezhetnek, és az MS futási ideje hosszú csak az acetát elemzéséhez. A propil-kloroformiát (PCF) alkilezésen alapuló megközelítés módszertanát és analitikai teljesítményét tekintve hasonló a miénkhez, de nagyobb reagensmennyiséget használ (ami növeli a magas acetát háttérszintek kockázatát) és hosszabb MS futási időt, mivel nem kifejezetten acetátra optimalizálták, és nem említi a formiátot . A közzétett alsó mennyiségi meghatározási határ a mi módszerünkhöz hasonló volt (15 μM a jelenlegi módszer esetében, szemben a Zheng és munkatársai által közölt 16 μM-mal). Zheng és munkatársai a lineáris válasz szélesebb tartományáról számoltak be, azaz 16 μM-8 mM. Mi nem vizsgáltuk a 2 mM-nél nagyobb értékeket, mivel fiziológiai körülmények között nem figyeltünk meg ilyen magas szinteket. A jelentett ismételhetőséget nagyon hasonlónak figyeltük meg, a Zheng és munkatársai által jelentett 0,54 % RSD (n = 6), és ~0,7 % RSD (n = 3) az acetátkoncentrációtól függően, a jelenlegi módszerben jelentett standard mintákra (a relatív standard eltéréseket összefoglalja a Additional file 1: S2 táblázat). Végül, egy másik GC-MS-alapú módszer a rövid szénláncú zsírsavak elemzésére 2,4-difluoroanilint és 1,3-diciklokarbodiimidet használt kondenzációs reagensként, ami 1 órás inkubációs lépést tett szükségessé . Összességében az itt bemutatott munka a már publikált módszerek mellett a következőkkel járul hozzá : (1) egy optimalizált módszer az acetátra, valamint egy adaptált módszer a formiát mérésére, (2) egy mélyreható vita a háttér-acetátról, annak lehetséges forrásairól és gyakorlati kezeléséről, valamint (3) egy olyan megközelítés, amellyel nem csak a szabad acetát, hanem a kötött acetát is mérhető.

A mintaelőkészítési protokoll magában foglalja a nátrium-hidroxid hozzáadását az alkilezési reakció megkönnyítése érdekében. Bár ez közvetlenül a deriválási reakció előtt történik, és a mintákat lehűtjük, ez potenciálisan az acetilezett biomolekulák nem kívánt hidrolízisét eredményezheti, ami a szabad acetát szintjének növekedéséhez vezethet. Annak tesztelésére, hogy ez bekövetkezik-e, 10 mM N-acetil-l-aszparaginsav (NAA) és N-acetil-l-cisztein (NAC), 1 g/l BSA, valamint eljárási vakok 10 mM-os oldatain végeztünk mintaelőkészítést és elemzést. Mivel az aminosav-acetiláció a kötött acetát legnagyobb mennyiségben előforduló forrása, és nem tapasztaltunk jelentős jelnövekedést, arra következtetünk, hogy a hidrolizált kötött acetát hozzájárulása elhanyagolható (4. ábra).

Acetát mennyiségi meghatározása biológiai mintákban

Miután megállapítottuk, hogy módszerünk pontosan és reprodukálhatóan képes az acetát mennyiségi meghatározására, a következőkben azt kívántuk meghatározni, hogy képes-e reprodukálni a korábban megállapított eredményeket. Ezért nyolc egészséges személy plazmájában számszerűsítettük az acetátot. A plazma acetátkoncentrációja 20 és 51 μM között változott, a medián koncentráció 34,1 ± 9,0 μM volt (az adatok nem láthatóak). Ez a korábban közzétett 41,9 ± 15,1 μM és 30,4 ± 9,0 μM értékek közé esik (Human Metabolome Database ).

A közelmúltban több tanulmány is azonosította az acetil-CoA-szintetáz 2 (ACSS2) enzim fontos szerepét a tumorok növekedésének közvetítésében hipoxiás és tápanyag-korlátozott körülmények között . Az ACSS2 “aktiválja” az acetátot AcCoA-vá, hogy az felhasználható legyen a későbbi metabolikus reakciókhoz, beleértve a lipogenezist is. Valóban, az U-13C-acetát hozzáadása a tenyésztett rákos sejtek közegéhez kimutatta a lipogén AcCoA és következésképpen a zsírsavak fokozott jelölését hipoxiás körülmények között a normoxiás körülményekhez képest . Az azonban, hogy ezt a fokozott jelölést milyen mértékben okozza az acetátfelvétel növekedése, még nem ismert. Ennek megoldására A549 tüdőkarcinóma-sejteket tenyésztettünk normoxikus vagy hipoxikus (1 % O2) körülmények között 500 μM U-13C-acetátot tartalmazó tápfolyadékban, és új módszerünkkel követtük annak koncentrációját az idő múlásával (5. ábra). Összhangban a lipogén AcCoA U-13C-acetátból történő megfigyelt jelölésével, a hipoxiás sejtek erőteljes U-13C-acetát-fogyasztását figyeltük meg, amit a közegben bekövetkező egyértelmű csökkenés jelzett. Meglepő módon, míg normoxiás körülmények között a lipogén AcCoA jelölése lényegesen kisebb, mint hipoxiában , a normoxiás sejtek szintén avid U-13C-acetát fogyasztást mutattak. A hipoxiás sejtek acetátfelvételi rátája 2,5 ± 0,1 nmol/h/μL sejtekkel (PCV) szerényen magasabb volt, mint a normoxiás sejteké (1,9 ± 0,1 nmol/h/μL sejtek). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a lipogén AcCoA fokozott jelölése U-13C-acetátból hipoxiában (~3-szoros növekedés, az adatok nem láthatóak) nem magyarázható teljes mértékben a fokozott acetátfelvétellel. Ehelyett a megnövekedett jelölést valószínűleg részben a lipogén AcCoA glükózból történő termelésének csökkenése okozza a hipoxiás sejtekben, ami az acetát relatív hozzájárulásának inflálódásához vezet. Ennek további vizsgálata folyamatban van.”

A szabad acetát koncentráció egérszövetekben és folyadékokban

In vivo izotópkövetési kísérletek kimutatták az exogén acetát tumorok általi felhasználását, megerősítve az ACSS2 kritikus szerepét a növekedés közvetítésében különböző rákos megbetegedésekben. Azonban az acetát elérhetősége a szolid tumorok számára, és hogy ez hogyan változik a gazdaszervezetek között, még mindig nagyrészt ismeretlen. Ennek megoldására több egér (C57BL/6) szervből (szív, vese, máj, tüdő, hasnyálmirigy, lép, tímusz), valamint plazmából és vizeletből származó szöveteket elemeztünk (6. ábra). Az összes vizsgált szerv közül a máj tartalmazta a legnagyobb koncentrációban a szabad acetátot, átlagosan 1,0 ± 0,1 nmol acetátot mg szövetre vetítve (azaz ~1 mM), több mint kétszer annyit, mint bármely más szövet. A bélből felszívódó tápanyagok először a portális vénán keresztül áthaladnak a májon. Az acetát és más rövid szénláncú zsírsavak magas millimoláris koncentrációjáról már beszámoltak, hogy a bél mikrobióta termeli őket, és ez magyarázatot ad a máj magas acetátkoncentrációjára. Mivel a májban az acetát koncentrációja sokkal magasabb, mint a szisztémás keringésben (azaz a plazmában) és a tüdőben, amely a máj áthaladása után az első olyan kapilláris rendszert tartalmazza, amelyet a vér perfundál, úgy tűnik, hogy a máj jelentős mennyiségű acetátot rögzít metabolikus felhasználásra. Az acetát a hasnyálmirigyben és a vesében is jelentősen feldúsult a plazmához képest, 0,5 ± 0,04 és 0,4 ± 0,06 nmol/mg (~0,5 és 0,4 mM) koncentrációval. A hasnyálmirigy magas acetátszintjének oka még tisztázásra vár. A vesék egyik feladata a vízben oldódó felesleges vagy toxikus metabolitok kiürítése a vérből, és figyelembe véve, hogy a vizeletben az acetát koncentrációja lényegesen magasabb, mint a plazmában, az acetát valójában aktívan kiürülhet a szervezetből, mint metabolikus “hulladék”. Az acetát szintje más szövetekben lényegesen alacsonyabb volt, a legalacsonyabb értéket a lépben találták, a plazmához hasonló koncentrációval. Ezek a megfigyelések együttesen rávilágítanak arra, hogy az acetát elérhetősége szervenként jelentősen eltérhet, ami hatással van a tumor anyagcseréjére.

A kötött acetát elemzése (szub)celluláris és hisztonfrakciókban

AcCoA központi csomópontot foglal el az anyagcserében, és részt vesz a biomassza szintézisében, a katabolikus útvonalakban és az energiatermelésben. Emiatt az AcCoA fontos szerepet játszik a metabolikus szabályozásban . Ez részben a biomolekulák, köztük számos fehérje acetilálásán keresztül történik . A hisztonok acetilációja például elősegíti a génátírást, és összefüggést figyeltek meg a hiszton-acetiláció mértéke és a tumor agresszivitása között . További bizonyíték az acetilációs homeosztázis jelentőségére a rák progressziójában az a megfigyelés, hogy az acetilációs dinamika megzavarása a deacetilázok (pl. HDAC-ok, sirtuinok) gátlásával a rákos sejtek halálának erőteljes indukciójához vezet . Míg az acetiláció számos aspektusát széles körben tanulmányozzák, sok ismeretlen maradt a különböző sejtkompartmentekben a biomolekulákhoz kötött acetát abszolút pool méreteiről és forgalmáról, nem is beszélve arról, hogy a tumor szempontjából releváns körülmények hogyan befolyásolják ezeket. Ennek megoldására kombináltuk megközelítésünket a hidrolízissel bázikus körülmények között. A minták melegítésével és egy éjszakán át tartó nátrium-hidroxiddal való inkubálásával az észterkötések hidrolizálódnak, szabad acetátot szabadítva fel, amely aztán derivatizálható és elemezhető, mint korábban. Ezt a megközelítést teljes sejtkivonaton alkalmazva az A549 sejtekben a teljes (kötött + szabad) acetátot 0,38 μmol/mg teljes sejtfehérje mennyiségben tudtuk számszerűsíteni. Ezután feltettük a kérdést, hogy lehetséges-e a kötött acetát mennyiségi meghatározása különálló sejtkompartmentekben. Egy kereskedelmi forgalomban kapható nukleáris izoláló készlettel (lásd a “Módszerek” fejezetet) elértük a sejtmag és a maradék sejtfrakciók (a citoszol és a sejtmagtól eltérő organellák kombinációja) majdnem teljes elkülönítését (7b. ábra). Megállapítottuk, hogy a kötött acetát-tartalom megközelítőleg azonos volt a nukleáris és a maradék frakciók esetében (7c. ábra). A két frakció összege megegyezett az egész sejtes mérés ~80%-ával, amit valószínűleg a frakcionálás során csökkent visszanyerés okoz, de a szabad acetát elvesztése is okozhatta. Az egyes frakciók mg fehérjére vonatkoztatott acetát-tartalmát kifejezve kiderült, hogy a sejtmagban az acetilációs sűrűség körülbelül háromszor nagyobb, mint a maradék sejtfrakcióban (7d. ábra). A hisztonok köztudottan erősen acetiláltak, és annak meghatározására, hogy a nukleáris acetát mekkora része volt hisztonhoz kötött, összehasonlítottuk a nukleáris izolációs megközelítés eredményeit egy publikált savas hiszton extrakciós protokollal (7e-g ábra) . Mindkét megközelítés nagyon hasonló értékeket adott, ami azt jelzi, hogy a nukleáris frakcióban lévő majdnem minden kötött acetát a hiszton-acetilációnak köszönhető. Így a hiszton-acetiláció önmagában a teljes celluláris acetát felét teszi ki.

A hisztonokhoz kötött acetát mennyiségi meghatározásának ez a megközelítése segíthet jobban megérteni a hiszton-acetiláció hatását különböző rákos megbetegedésekkel kapcsolatos vizsgálatokban. A megközelítés hasznosságának demonstrálására az A549 sejteket panobinosztáttal, egy pán-hiszton-deacetiláz (HDAC) inhibitorral kezeltük. A panobinosztáttal való rövid, 4 órás inkubáció a hisztonhoz kötött acetát mennyiségének közel kétszeresét okozta, ami azt mutatja, hogy a hiszton acetilációs turnover meglehetősen gyors (7h ábra).

A formiát és más rövidláncú zsírsavak mérése

A deriválószer módosításával a módszer könnyen adaptálható más rövidláncú zsírsavakra, beleértve a formiátot is. A formiát benzil-alkohollal való összekapcsolása formiát-származékot (benzil-formiát) eredményez, amely könnyen elemezhető GC-MS-sel (lásd a kiegészítő kísérleti eljárásokat Additional file 1: S1). Korábban említettük, hogy az acetát analízisére szolgáló GC-MS módszer mindössze 4 percet vesz igénybe, a tömegdetektor 2,2 és 2,7 perc között működik. Ugyanez a módszer képes a propionát és a butirát propil-propionát és propil-butirát formájában történő elemzésére és mennyiségi meghatározására az acetátéval azonos mintaszármaztatási módszer beállításával. A tömegdetektor működési idejének 2,2 percről 4 percre történő meghosszabbításával sikerült kimutatni a 2,92, illetve 3,30 percnél eluálódó propionát- és butirát-csúcsokat. A propionát és a butirát m/z 75 és 89 ionjainak felhasználásával lehetővé vált e rövid szénláncú zsírsavak abszolút mennyiségi meghatározása.