Une méthode rapide pour quantifier l’acétate libre et lié basée sur l’alkylation et l’analyse GC-MS

Description de la méthode

Nous avons développé une méthode robuste et à haut débit pour la quantification absolue de l’acétate dans les échantillons biologiques. La méthode est basée sur la dérivatisation en utilisant une réaction établie avec le chloroformate de méthyle (MCF) . Après avoir ajouté successivement l’étalon interne, le 1-propanol, la pyridine et l’hydroxyde de sodium, la réaction de dérivatisation est initiée en ajoutant le MCF dès que possible. La modification chimique se produit dans des conditions basiques en raison de la présence d’hydroxyde de sodium, tandis que la pyridine maintient l’homogénéité du système réactionnel car le MCF ne se dissout pas dans l’eau seule (Fig. 1). Le 1-Propanol est utilisé comme réactif de couplage pour produire de l’acétate de propyle (Fig. 2). Lorsque l’hydroxyde de sodium est ajouté à l’échantillon refroidi immédiatement avant l’addition du MCF, aucune hydrolyse ne se produit (voir ci-dessous). L’alkylation de l’acétate avec le MCF facilite une modification ultérieure rapide de l’acétate dans des conditions aqueuses. Dans ce cas, l’intermédiaire acétate-MCF (I) est attaqué par l’alcool (1-propanol), et l’intermédiaire résultant (II) subit d’autres réarrangements, conduisant à la formation d’acétate de propyle. De telles approches de dérivation utilisant la famille de réactifs chloroformate sont bien décrites. Pour quantifier le rendement de la dérivatisation et de l’extraction ultérieure dans le MTBE, nous avons comparé l’intensité du signal MS de 1 mM d’acétate alkylé en acétate de propyle à une concentration équimolaire d’acétate de propyle obtenu commercialement dans le MTBE. Sur cette base, nous avons trouvé que la récupération était de 95,5 ± 1,57 % (fichier supplémentaire 1 : tableau S1).

La réaction de dérivation avec le MCF est vigoureuse et exothermique, produisant des gaz (gaz chlorhydrique, dioxyde de carbone) qui provoquent une augmentation de la pression à l’intérieur du tube. Nous recommandons donc de suivre les règles générales d’hygiène et de sécurité lors de la réalisation de la dérivatisation chimique, c’est-à-dire de porter une blouse, des gants et des lunettes de protection, tout en effectuant la réaction sous une hotte. Pour minimiser la vigueur de la réaction et donc la pressurisation, il est important d’incuber l’échantillon sur la glace (5 min) avant la dérivatisation. Nous recommandons de maintenir le couvercle fermé avec un doigt pendant le vortex et d’ouvrir le tube avec précaution par la suite (un son « pop » peut être entendu). Alternativement, le tube peut être maintenu ouvert pendant le vortex, selon la préférence du chercheur (nous constatons que le contenu du tube ne se répand pas lorsqu’il est manipulé avec précaution). Ensuite, l’acétate dérivé (acétate de propyle) peut être facilement extrait dans un solvant organique (MTBE) suivi par l’analyse GC-MS (Fig. 1).

D’autres alcools primaires (par exemple, le méthanol et l’éthanol produisant de l’acétate de méthyle et d’éthyle, respectivement) peuvent également être utilisés pour la dérivation. Cependant, nous avons constaté qu’avec notre colonne GC à polarité moyenne (que nous trouvons très adaptée à l’analyse d’une large gamme de métabolites), l’acétate de propyle fournit la forme de pic et le temps de rétention optimaux pour une analyse rapide. Le protocole de préparation des échantillons décrit ici est très rapide, le temps total de dérivatisation étant inférieur à 1 minute par échantillon. Associé au programme court de GC-MS avec un temps d’exécution total de 4 minutes par échantillon, cela facilite l’analyse à haut débit. Alors que les isotopologues de l’acétate 12C-acétate, U-13C-acétate, et 2H3-acétate ont des temps de rétention presque identiques, leurs pics peuvent être facilement déconvolués en utilisant des ions spécifiques (Fig. 3). Comme on l’observe généralement dans l’analyse GC des analytes deutérés, le dérivé 2H3-acétate a un temps de rétention légèrement plus court en raison de l’effet isotopique inverse. Les ions m/z 61, 63 et 64 pour le 12C2-acétate, le U-13C2-acétate et le 2H3-acétate, respectivement, ont été utilisés pour la quantification absolue et ont montré une réponse linéaire optimale.

Validation de la méthode

Pour évaluer la répétabilité de la préparation de l’échantillon et de la procédure d’analyse, nous avons déterminé l’écart-type relatif (RSD) pour l’acétate 12C- et U-13C- dans des étalons fraîchement préparés à 50, 200 et 1000 μM pour les isotopologues d’acétate respectifs. La méthode a montré une excellente répétabilité avec une RSD < 5 % pour les étalons et < 10 % pour les échantillons biologiques (fichier supplémentaire 1 : tableau S2). La gamme linéaire de quantification a été évaluée par l’analyse d’étalons dilués en série de 12C- et U-13C-acétate dans la gamme 2-2000 μM. Nous n’avons pas pu déterminer la limite de détection (LOD) du 12C-acétate car un signal de fond d’acétate d’environ 15 μM était toujours présent dans nos échantillons, même si seuls des réactifs de la plus haute pureté ont été utilisés. Il semble que l’acétate soit un contaminant commun à l’état de trace dans l’atmosphère et les réactifs, ainsi que dans le plastique et la verrerie, similaire à ce qui a été observé pour les acides gras à plus longue chaîne . Pour approfondir cette question, nous avons cherché à déterminer les sources exactes de l’acétate de fond (fichier supplémentaire 1 : Figure S1). Comme nous analysons l’acétate sous sa forme dérivée de propyl-acétate, le signal de fond que nous observons couramment pourrait provenir soit du propyl-acétate directement, soit de l’acétate de fond qui est dérivé en propyl-acétate pendant la préparation de l’échantillon. Pour étudier la présence de l’acétate de propyle de fond, nous avons réalisé une expérience en plastique et en verre où nous avons analysé le niveau d’acétate de propyle dans les réactifs utilisés pour la dérivatisation chimique. Nous avons observé que le 1-propanol présente le taux le plus élevé d’acétate de propyle de fond, mais qu’il ne représente que ~10 % de l’acétate de fond observé dans les blancs de procédure (PB, c’est-à-dire les échantillons blancs qui ont été soumis à l’ensemble de la procédure de préparation des échantillons et d’analyse par spectrométrie de masse), ce qui indique que l’acétate libre, plutôt que l’acétate de propyle, est le principal contaminant. Malheureusement, tous les réactifs sont nécessaires pour la dérivatisation, nous ne sommes donc pas en mesure de déterminer quel réactif contient le plus d’acétate de fond. Nous avons cependant effectué l’ensemble de la procédure de dérivatisation et d’extraction sur des échantillons vierges dans des tubes en verre et en plastique. Nous avons constaté que dans le plastique, le fond d’acétate résultant est ~50 % plus élevé que dans le verre. En raison de sa commodité, nous préférons toujours travailler avec des tubes en plastique et nous laissons cette décision à l’investigateur individuel.

Indépendamment de l’acétate de fond, comme la réponse s’est avérée hautement linéaire, nous avons pu soustraire le signal de fond (nous quantifions le fond d’acétate en utilisant des échantillons vierges qui ont été soumis à l’ensemble de la procédure de préparation de l’échantillon et d’analyse par spectrométrie de masse, c’est-à-dire des blancs de procédure), ce qui donne une gamme dynamique linéaire de 2 à 2000 μM pour le 12C-acétate et le U-13C-acétate. La limite de quantification (LOQ) déterminée pour l’U-13C-acétate était de 0,1 μM. Pour limiter au maximum la contamination par le 12C-acétate, nous recommandons de préparer régulièrement (chaque semaine) des réactifs frais et d’inclure systématiquement des blancs de procédure. À noter, nous suggérons aux utilisateurs de quantifier leur propre signal d’acétate de fond, car il dépend des matériaux et des réactifs utilisés et, par conséquent, il est très probable qu’il soit spécifique au laboratoire.

Nous considérons notre approche comme une alternative optimisée aux autres méthodes de dérivatisation publiées, pour la mesure rapide de l’acétate . Une approche basée sur la silylation de l’acétate avec le N-tert-Butyldiméthylsilyl-N-méthyltrifluoroacétamide (MTBSTFA) a montré une large gamme linéaire pour la quantification de l’acétate (0-3500 μM), une haute répétabilité et un faible écart-type relatif (RSD < 5 %) . Cependant, elle n’est pas adaptée au traitement des échantillons à base d’eau, les multiples étapes d’extraction peuvent conduire à des niveaux d’acétate de fond élevés, et le temps d’exécution de la SM est long pour l’analyse de l’acétate seul. Une approche basée sur l’alkylation à l’aide de chloroformate de propyle (PCF) est similaire à la nôtre en termes de méthodologie et de performance analytique, mais elle utilise des volumes de réactifs plus importants (ce qui augmente le risque de niveaux de fond élevés d’acétate) et des temps d’exécution MS plus longs car elle n’a pas été optimisée pour l’acétate spécifiquement, et elle ne mentionne pas le formate . La limite inférieure de quantification publiée était comparable à notre méthode (15 μM pour la méthode actuelle contre 16 μM rapportée par Zheng et al. ). Zheng et al. ont signalé une plus grande plage de réponse linéaire, soit 16 μM-8 mM. Nous n’avons pas testé au-delà de 2 mM car nous n’avons pas observé des niveaux aussi élevés dans un contexte physiologique. La répétabilité rapportée a été observée comme étant très similaire à 0,54 % RSD (n = 6) rapporté par Zheng et al, et ~0,7 % RSD (n = 3) en fonction de la concentration d’acétate, rapporté dans la méthode actuelle pour les échantillons standard (écarts types relatifs résumés dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S2). Enfin, une autre méthode basée sur la GC-MS pour l’analyse des acides gras à chaîne courte a utilisé la 2,4-difluoroaniline et le 1,3-dicyclocarbodiimide comme réactifs de condensation, ce qui a nécessité une étape d’incubation de 1 heure. Dans l’ensemble, le travail présenté ici apporte les éléments suivants, en plus des méthodes déjà publiées : (1) une méthode optimisée pour l’acétate ainsi qu’une méthode adaptée pour mesurer le formate, (2) une discussion approfondie sur l’acétate de fond, ses sources potentielles et la façon de le traiter de manière pratique, et (3) une approche pour mesurer non seulement l’acétate libre mais aussi l’acétate lié.

Le protocole de préparation des échantillons comprend l’ajout d’hydroxyde de sodium pour faciliter la réaction d’alkylation. Bien que cela se produise immédiatement avant la réaction de dérivatisation et que les échantillons soient refroidis, cela pourrait potentiellement entraîner une hydrolyse indésirable des biomolécules acétylées, conduisant à des niveaux accrus d’acétate libre. Pour vérifier si cela se produit, nous avons préparé et analysé des solutions 10 mM d’acide N-acétyl-l-aspartique (NAA) et de N-acétyl-l-cystéine (NAC), 1 g/L de BSA ainsi que des blancs de procédure. Comme l’acétylation des acides aminés est la source la plus abondante d’acétate lié, et que nous n’avons pas observé d’augmentation significative du signal, nous concluons que la contribution de l’acétate lié hydrolysé est négligeable (Fig. 4).

Quantification de l’acétate dans des échantillons biologiques

Ayant établi que notre méthode peut quantifier l’acétate de manière précise et reproductible, nous avons ensuite voulu déterminer si elle pouvait reproduire des résultats précédemment établis. Nous avons donc quantifié l’acétate dans le plasma de huit individus en bonne santé. Les concentrations plasmatiques d’acétate variaient de 20 à 51 μM, avec une concentration médiane de 34,1 ± 9,0 μM (données non présentées). Cela se situe dans les valeurs précédemment publiées de 41,9 ± 15,1 μM et 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

Récemment, de multiples études ont identifié un rôle important pour l’enzyme acétyl-CoA synthétase 2 (ACSS2) dans la médiation de la croissance tumorale dans des conditions hypoxiques et limitées en nutriments . L’ACSS2 « active » l’acétate en AcCoA afin qu’il puisse être utilisé pour des réactions métaboliques en aval, notamment la lipogenèse. En effet, l’ajout d’U-13C-acétate au milieu de cellules cancéreuses en culture a révélé un marquage accru de l’AcCoA lipogénique, et par conséquent des acides gras, dans des conditions hypoxiques par rapport aux conditions normoxiques. Cependant, on ne sait pas encore dans quelle mesure ce marquage accru est causé par une augmentation de l’absorption d’acétate. Pour répondre à cette question, nous avons cultivé des cellules de carcinome pulmonaire A549 dans des conditions normoxiques ou hypoxiques (1 % O2) dans un milieu contenant 500 μM d’acétate U-13C, et nous avons suivi sa concentration au fil du temps en utilisant notre nouvelle méthode (figure 5). Conformément au marquage observé de l’AcCoA lipogénique à partir de l’U-13C-acétate, une consommation robuste d’U-13C-acétate par les cellules hypoxiques a été observée, comme en témoigne une nette réduction dans le milieu. De façon surprenante, alors que le marquage de l’AcCoA lipogénique dans des conditions normoxiques est considérablement moins important qu’en hypoxie, les cellules normoxiques ont également montré une consommation avide d’U-13C-acétate. Les taux d’absorption d’acétate pour les cellules hypoxiques étaient avec 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL de cellules (PCV) modestement plus élevés que pour les cellules normoxiques (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL de cellules). Ces résultats suggèrent que le marquage accru de l’AcCoA lipogénique à partir de l’acétate U-13C en hypoxie (~3 fois plus, données non montrées) ne peut pas être entièrement expliqué par une augmentation de l’absorption d’acétate. Au contraire, l’augmentation du marquage est probablement due en partie à une baisse de la production d’AcCoA lipogénique à partir du glucose dans les cellules hypoxiques, ce qui entraîne une inflation de la contribution relative de l’acétate. Nous sommes en train d’étudier cette question de manière plus approfondie.

Concentration d’acétate libre dans les tissus et les fluides de la souris

Des expériences de traçage isotopique in vivo ont démontré l’utilisation d’acétate exogène par les tumeurs , confirmant un rôle critique de l’ACSS2 dans la médiation de la croissance dans divers cancers . Cependant, la disponibilité de l’acétate pour les tumeurs solides et la façon dont elle varie entre les organes hôtes restent largement inconnues. Pour tenter de répondre à cette question, nous avons analysé les tissus de plusieurs organes de souris (C57BL/6) (cœur, rein, foie, poumon, pancréas, rate, thymus) ainsi que le plasma et l’urine (Fig. 6). De tous les organes analysés, le foie contenait la plus forte concentration d’acétate libre avec une concentration moyenne de 1,0 ± 0,1 nmole d’acétate par mg de tissu (c’est-à-dire ~1 mM), soit plus du double de celle de tous les autres tissus. Les nutriments absorbés par l’intestin passent d’abord par le foie via la veine porte. Des concentrations millimolaires élevées d’acétate et d’autres acides gras à chaîne courte sont générées par le microbiote intestinal, ce qui explique la forte concentration d’acétate dans le foie. Comme la concentration d’acétate dans le foie est beaucoup plus élevée que dans la circulation systémique (c’est-à-dire le plasma) et les poumons, qui contiennent le premier système capillaire à être perfusé par le sang après le passage du foie, le foie semble capturer des quantités substantielles d’acétate pour une utilisation métabolique. L’acétate était également considérablement enrichi dans le pancréas et les reins par rapport au plasma, avec des concentrations de 0,5 ± 0,04 et 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 et 0,4 mM), respectivement. La raison de la présence élevée d’acétate dans le pancréas reste à élucider. Une des fonctions des reins est d’éliminer les excès hydrosolubles ou les métabolites toxiques du sang et, étant donné que la concentration d’acétate dans l’urine est sensiblement plus élevée que dans le plasma, l’acétate peut en fait être activement excrété du corps comme « déchet » métabolique. Les niveaux d’acétate étaient considérablement plus faibles dans les autres tissus, la valeur la plus basse étant trouvée dans la rate à une concentration similaire à celle du plasma. Ensemble, ces observations soulignent que la disponibilité de l’acétate peut varier considérablement entre les organes, ce qui a des implications pour le métabolisme tumoral.

Analyse de l’acétate lié dans les fractions (sub)cellulaires et histones

L’AcCoA occupe un nœud central dans le métabolisme et est impliqué dans la synthèse de la biomasse, les voies cataboliques et la production d’énergie. De ce fait, l’AcCoA joue un rôle important dans la régulation métabolique . Cela se produit en partie par l’acétylation des biomolécules, y compris une variété de protéines. Par exemple, l’acétylation des histones favorise la transcription des gènes et une corrélation entre le degré d’acétylation des histones et l’agressivité des tumeurs a été observée. D’autres preuves de l’importance de l’homéostasie de l’acétylation dans la progression du cancer proviennent de l’observation que la perturbation de la dynamique de l’acétylation par l’inhibition des désacétylases (c’est-à-dire les HDAC, les sirtuines) entraîne une induction puissante de la mort des cellules cancéreuses. Bien que plusieurs aspects de l’acétylation fassent l’objet d’études approfondies, on ignore encore beaucoup de choses sur la taille absolue des pools et le renouvellement de l’acétate lié aux biomolécules dans les différents compartiments cellulaires, sans parler de la façon dont ils sont affectés par les conditions tumorales. Pour répondre à cette question, nous avons combiné notre approche avec l’hydrolyse dans des conditions de base. En chauffant les échantillons et en les incubant pendant une nuit avec de l’hydroxyde de sodium, les liaisons ester s’hydrolysent, libérant de l’acétate libre, qui peut ensuite être dérivé et analysé comme précédemment. L’utilisation de cette approche sur un extrait de cellules entières nous a permis de quantifier l’acétate total (lié + libre) dans les cellules A549 à 0,38 μmole/mg de protéines cellulaires totales. Nous avons ensuite demandé s’il était possible de quantifier l’acétate lié dans des compartiments cellulaires séparés. Nous avons obtenu une séparation quasi-complète des fractions nucléaires et cellulaires résiduelles (combinaison du cytosol et des organites autres que le noyau) à l’aide d’un kit commercial d’isolement nucléaire (voir section  » Méthodes « ) (figure 7b). Nous avons constaté que la teneur en acétate lié était approximativement égale pour les fractions nucléaires et résiduelles (Fig. 7c). La somme des deux fractions était égale à environ 80 % de la mesure de la cellule entière, ce qui est très probablement dû à une récupération réduite pendant le fractionnement, mais peut également être causé par la perte d’acétate libre. L’expression de la teneur en acétate par mg de protéine dans chaque fraction a révélé que la densité d’acétylation dans le noyau est environ trois fois plus élevée que dans la fraction cellulaire résiduelle (Fig. 7d). Les histones sont connues pour être fortement acétylées, et pour déterminer quelle proportion de l’acétate nucléaire était liée aux histones, nous avons comparé les résultats de l’approche d’isolement nucléaire avec un protocole d’extraction d’histone acide publié (Fig. 7e-g). Les deux approches ont donné des valeurs très similaires, indiquant que presque tout l’acétate lié dans la fraction nucléaire est dû à l’acétylation des histones. Ainsi, l’acétylation des histones représente à elle seule la moitié de l’acétate cellulaire total.

Cette approche vers la quantification de l’acétate lié aux histones peut aider à mieux comprendre l’effet de l’acétylation des histones dans diverses études liées au cancer. Pour démontrer l’utilité de cette approche, nous avons traité des cellules A549 avec du panobinostat, un inhibiteur pan-histone désacétylase (HDAC). Une courte incubation de 4 heures avec le panobinostat a provoqué un quasi-doublement de la quantité d’acétate liée à l’histone, démontrant que le renouvellement de l’acétylation de l’histone est assez rapide (Fig. 7h).

Mesure du formiate et d’autres acides gras à chaîne courte

En modifiant l’agent de dérivatisation, la méthode est facilement adaptable à d’autres acides gras à chaîne courte, y compris le formiate. Le couplage du formate avec l’alcool benzylique génère un dérivé du formate (formate de benzyle), qui peut être facilement analysé par GC-MS (voir les procédures expérimentales supplémentaires Additional file 1 : S1). Nous avons mentionné précédemment que la méthode GC-MS pour l’analyse de l’acétate ne prend que 4 min, le détecteur de masse fonctionnant entre 2,2 et 2,7 min. La même méthode est capable d’analyser et de quantifier le propionate et le butyrate sous forme de propionate de propyle et de butyrate de propyle en utilisant la même configuration de la méthode de dérivatisation de l’échantillon que pour l’acétate. En prolongeant le temps de fonctionnement du détecteur de masse de 2,2 à 4 min, nous avons pu détecter les pics de propionate et de butyrate éluant à 2,92 et 3,30 min, respectivement. En utilisant les ions m/z 75 et 89 pour le propionate et le butyrate, respectivement, il est possible de quantifier absolument ces acides gras à chaîne courte.