Descripción del método
Desarrollamos un método robusto y de alto rendimiento para la cuantificación absoluta del acetato en muestras biológicas. El método se basa en la derivatización utilizando una reacción establecida con cloroformato de metilo (MCF) . Después de añadir secuencialmente el estándar interno, el 1-propanol, la piridina y el hidróxido de sodio, la reacción de derivatización se inicia añadiendo MCF lo antes posible. La modificación química se produce en condiciones básicas debido a la presencia de hidróxido de sodio, mientras que la piridina mantiene la homogeneidad del sistema de reacción, ya que el MCF no se disuelve solo en agua (Fig. 1). El 1-Propanol se utiliza como reactivo de acoplamiento para producir acetato de propilo (Fig. 2). Cuando se añade hidróxido de sodio a la muestra enfriada inmediatamente antes de la adición del MCF, no se produce hidrólisis (véase más adelante). La alquilación del acetato con MCF facilita una rápida modificación posterior del acetato en condiciones de agua. En este caso, el intermedio acetato-MCF (I) es atacado por el alcohol (1-propanol), y el intermedio resultante (II) sufre más reordenamientos, lo que lleva a la formación de acetato de propilo. Tales enfoques de derivatización utilizando la familia de reactivos del cloroformato están bien descritos. Para cuantificar el rendimiento de la derivatización y la posterior extracción en MTBE, comparamos la intensidad de la señal de MS de 1 mM de acetato alquilado a propil-acetato con una concentración equimolar de propil-acetato obtenido comercialmente en MTBE. Basándonos en esto, encontramos que la recuperación era del 95,5 ± 1,57 % (Archivo adicional 1: Tabla S1).
Representación esquemática del flujo de trabajo para la cuantificación rápida del acetato. Una alícuota de la muestra se mezcló con el estándar interno 2H3-acetato de sodio, piridina (Py) y 1-propanol (1-PrOH), seguido de la derivatización mediante la adición de hidróxido de sodio y cloroformato de metilo (MCF). Tras la derivatización, la muestra se mezcló con metil tert-butil éter (MTBE) y se agitó en vórtex para extraer el derivado de acetato (propil-acetato). A continuación, la muestra se centrifugó y la capa superior de MTBE se transfirió al vial de GC para su posterior análisis por GC-MS
Derivación química del acetato. Utilizando cloroformato de metilo (MCF), el grupo carboxílico del acetato se convierte en un éster de propilo: el acetato ataca primero al MCF y el intermedio resultante (I) es atacado por el alcohol (1-propanol), generando un segundo intermedio (II), que sufre nuevos reordenamientos para formar propil-acetato
La reacción de derivación con el MCF es vigorosa y exotérmica, produciendo gases (gas clorhídrico, dióxido de carbono) que hacen aumentar la presión dentro del tubo. Por lo tanto, se recomienda seguir las normas generales de salud y seguridad al realizar la derivatización química, es decir, llevar bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras, mientras se lleva a cabo la reacción en una campana de humos. Para minimizar el vigor de la reacción y, por tanto, la presurización, es importante incubar la muestra en hielo (5 minutos) antes de la derivatización. Se recomienda mantener la tapa cerrada con un dedo durante el vortexing y abrir el tubo con cuidado después (se puede escuchar un sonido «pop»). Alternativamente, el tubo puede mantenerse abierto durante el vortexing, dependiendo de la preferencia del investigador (encontramos que el contenido del tubo no se derrama cuando se maneja con cuidado). Después, el acetato derivatizado (acetato de propilo) puede extraerse fácilmente en un disolvente orgánico (MTBE) seguido del análisis GC-MS (Fig. 1).
También pueden utilizarse otros alcoholes primarios (por ejemplo, metanol y etanol que producen acetato de metilo y de etilo, respectivamente) para la derivatización. Sin embargo, hemos comprobado que con nuestra columna de GC de polaridad media (que nos parece muy adecuada para el análisis de una amplia gama de metabolitos), el acetato de propilo proporciona la forma de pico y el tiempo de retención óptimos para un análisis rápido. El protocolo de preparación de muestras descrito aquí es muy rápido, con un tiempo total de derivatización de menos de 1 minuto por muestra. Junto con el breve programa de GC-MS, con un tiempo total de ejecución de 4 minutos por muestra, esto facilita el análisis de alto rendimiento. Mientras que los isotopólogos de acetato 12C-acetato, U-13C-acetato y 2H3-acetato tienen tiempos de retención casi idénticos, sus picos se pueden deconvolucionar fácilmente utilizando iones específicos (Fig. 3). Como se observa generalmente en el análisis por GC de analitos deuterados, el derivado del acetato 2H3 tiene un tiempo de retención ligeramente más corto debido al efecto isotópico inverso. Los iones m/z 61, 63 y 64 para 12C2-acetato, U-13C2-acetato y 2H3-acetato, respectivamente, se utilizaron para la cuantificación absoluta y mostraron una respuesta lineal óptima.
Cromatograma de CG para el derivado de acetato (propil-acetato). a Cromatograma de iones totales. b-d Cromatogramas de iones extraídos para 12C-, U-13C-, y 2H3-acetato, respectivamente. Los iones m/z 61, 63 y 64 (se indica la estructura de los iones) se utilizaron para la cuantificación absoluta
Validación del método
Para evaluar la repetibilidad del procedimiento de preparación y análisis de la muestra, se determinó la desviación estándar relativa (RSD) para el 12C- y el U-13C-acetato en estándares recién preparados a 50, 200 y 1000 μM para los respectivos isotopólogos del acetato. El método mostró una excelente repetibilidad con una RSD < 5 % para los estándares y < 10 % para las muestras biológicas (archivo adicional 1: Tabla S2). El rango lineal de cuantificación se evaluó mediante el análisis de estándares diluidos en serie tanto de 12C- como de U-13C-acetato dentro del rango 2-2000 μM. No pudimos determinar el límite de detección (LOD) para el 12C-acetato ya que una señal de fondo de acetato de aproximadamente 15 μM estaba siempre presente en nuestras muestras, a pesar de que sólo se utilizaron reactivos de la máxima pureza. Parece que el acetato es un contaminante traza común en la atmósfera y los reactivos, así como en el plástico y el material de vidrio, de forma similar a lo que se ha observado para los ácidos grasos de cadena más larga . Para investigar esto más a fondo, tratamos de determinar las fuentes exactas de acetato de fondo (archivo adicional 1: Figura S1). Dado que analizamos el acetato en su forma derivada de propil-acetato, la señal de fondo que solemos observar podría proceder del propil-acetato directamente o del acetato de fondo derivado a propil-acetato durante la preparación de la muestra. Para observar la presencia de acetato de propilo de fondo, realizamos un experimento tanto en plástico como en vidrio en el que analizamos el nivel de acetato de propilo en los reactivos utilizados para la derivatización química. Observamos que el 1-propanol tiene el mayor nivel de propil-acetato de fondo, pero que sólo representa el ~10 % del acetato de fondo observado en los espacios en blanco del procedimiento (PB, es decir, muestras en blanco que han sido sometidas a todo el procedimiento de preparación de la muestra y de análisis de espectros de masas), lo que indica que el acetato libre, y no el propil-acetato, es el principal contaminante. Lamentablemente, todos los reactivos son necesarios para la derivatización, por lo que no podemos determinar qué reactivo contiene más acetato de fondo. Sin embargo, realizamos todo el procedimiento de derivatización y extracción en muestras en blanco tanto en tubos de vidrio como de plástico. Encontramos que en el plástico, el fondo de acetato resultante es ~50 % más alto que en el vidrio. Debido a su conveniencia, seguimos prefiriendo trabajar con tubos de plástico y dejamos esta decisión al investigador individual.
Independientemente del acetato de fondo, ya que la respuesta demostró ser altamente lineal, pudimos restar la señal de fondo (cuantificamos el fondo de acetato utilizando muestras en blanco que han sido sometidas a todo el procedimiento de preparación de la muestra y de análisis por espectroscopia de masas, es decir, blancos de procedimiento), lo que dio como resultado un rango dinámico lineal de 2 a 2000 μM tanto para el 12C-acetato como para el U-13C-acetato. El límite de cuantificación (LOQ) determinado para el U-13C-acetato fue de 0,1 μM. Para mantener la contaminación por 12C-acetato al mínimo, recomendamos preparar reactivos frescos con regularidad (semanalmente), y también recomendamos incluir rutinariamente los blancos de procedimiento. Cabe destacar que sugerimos a los usuarios que cuantifiquen su propia señal de acetato de fondo, ya que depende de los materiales y reactivos utilizados y, por lo tanto, es muy probable que sea específica del laboratorio.
Consideramos que nuestro enfoque es una alternativa optimizada a otros métodos de derivatización publicados, para la medición rápida de acetato . Un enfoque basado en la sililación del acetato con N-terc-butildimetilsililil-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) mostró un amplio rango lineal para la cuantificación del acetato (0-3500 μM), una alta repetibilidad y una baja desviación estándar relativa (RSD < 5 %) . Sin embargo, no es adecuado para el procesamiento de muestras a base de agua, los múltiples pasos de extracción pueden conducir a altos niveles de acetato de fondo, y el tiempo de ejecución de MS es largo para el análisis de acetato solo. Un enfoque basado en la alquilación con cloroformato de propilo (PCF) es similar al nuestro con respecto a la metodología y el rendimiento analítico, pero utiliza mayores volúmenes de reactivos (lo que aumenta el riesgo de altos niveles de fondo de acetato) y tiempos de ejecución de MS más largos, ya que no fue optimizado para el acetato específicamente, y no menciona el formiato . El límite inferior de cuantificación publicado era comparable a nuestro método (15 μM para el método actual frente a 16 μM informado por Zheng et al. ). Zheng et al. informaron de un rango más amplio de respuesta lineal, es decir, 16 μM-8 mM. No probamos más allá de 2 mM ya que no hemos observado niveles tan altos en un contexto fisiológico. Se observó que la repetibilidad reportada era muy similar con un 0,54 % de RSD (n = 6) reportado por Zheng et al. , y ~0,7 % de RSD (n = 3) dependiendo de la concentración de acetato, reportado en el método actual para muestras estándar (desviaciones estándar relativas resumidas en el archivo adicional 1: Tabla S2). Finalmente, otro método basado en GC-MS para el análisis de ácidos grasos de cadena corta utilizó 2,4-difluoroanilina y 1,3-dicyclocarbodiimide como reactivos de condensación, lo que requirió un paso de incubación de 1-h. En general, el trabajo presentado aquí contribuye a lo siguiente, además de los métodos ya publicados: (1) un método optimizado para el acetato, así como un método adaptado para medir el formiato, (2) una discusión en profundidad sobre el acetato de fondo, sus fuentes potenciales, y cómo tratar con él de una manera práctica, y (3) un enfoque para medir no sólo el acetato libre, sino también el acetato unido.
El protocolo de preparación de la muestra incluye la adición de hidróxido de sodio para facilitar la reacción de alquilación. Aunque esto ocurre inmediatamente antes de la reacción de derivatización y las muestras se enfrían, esto podría dar lugar a una hidrólisis no deseada de las biomoléculas acetiladas, lo que llevaría a un aumento de los niveles de acetato libre. Para comprobar si esto ocurre, realizamos la preparación de la muestra y el análisis en soluciones de 10 mM de ácido N-acetil-l-aspártico (NAA) y N-acetil-l-cisteína (NAC), 1 g/L de BSA, así como espacios en blanco del procedimiento. Como la acetilación de aminoácidos es la fuente más abundante de acetato ligado, y no observamos un aumento significativo de la señal, concluimos que la contribución del acetato ligado hidrolizado es insignificante (Fig. 4).
El efecto del hidróxido de sodio añadido durante la derivatización sobre la hidrólisis del acetato ligado. Gráfico de Whisker para el fondo de acetato relativo derivado del procedimiento en blanco y de las biomoléculas N-acetiladas-BSA, N-acetil-l-aspartato (NAA) y N-acetil-l-cisteína (NAC). No se produce una desacetilación significativa durante el procedimiento de derivatización. Los datos son medias ± SD de n = 5 para todas las condiciones. La línea horizontal y el punto en el gráfico de caja corresponden al valor medio y al valor atípico, respectivamente. Los extremos superior e inferior de la línea vertical del diagrama de caja son los valores máximos y mínimos determinados, respectivamente
Cuantificación de acetato en muestras biológicas
Habiendo establecido que nuestro método puede cuantificar el acetato de forma precisa y reproducible, quisimos determinar a continuación si puede reproducir los resultados previamente establecidos. Por lo tanto, cuantificamos el acetato en el plasma de ocho individuos sanos. Las concentraciones de acetato en plasma variaron de 20 a 51 μM, con una concentración media de 34,1 ± 9,0 μM (datos no mostrados). Esto se encuentra dentro de los valores previamente publicados de 41,9 ± 15,1 μM y 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).
Recientemente, múltiples estudios identificaron un papel importante para la enzima acetil-CoA sintetasa 2 (ACSS2) en la mediación del crecimiento tumoral durante condiciones hipóxicas y de limitación de nutrientes . La ACSS2 «activa» el acetato para convertirlo en AcCoA y así poder utilizarlo en las reacciones metabólicas posteriores, incluida la lipogénesis. De hecho, la adición de U-13C-acetato al medio de las células cancerosas cultivadas reveló un mayor etiquetado de AcCoA lipogénico, y en consecuencia de ácidos grasos, en condiciones hipóxicas en relación con las normoxicas . Sin embargo, se desconoce hasta qué punto este aumento del marcaje se debe a un incremento de la captación de acetato. Para ello, cultivamos células de carcinoma de pulmón A549 en condiciones de normoxia o hipoxia (1 % O2) en un medio que contenía 500 μM de U-13C-acetato, y seguimos su concentración a lo largo del tiempo utilizando nuestro nuevo método (Fig. 5). En consonancia con el etiquetado observado de AcCoA lipogénico a partir de U-13C-acetato, se observó un consumo robusto de U-13C-acetato por parte de las células hipóxicas, como demuestra una clara reducción en el medio. Sorprendentemente, mientras que el etiquetado de AcCoA lipogénico en condiciones de normoxia es considerablemente menor que en hipoxia , las células normoxicas también mostraron un ávido consumo de U-13C-acetato. Las tasas de captación de acetato para las células hipóxicas fueron con 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL de células (PCV) modestamente más altas que para las células normoxicas (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL de células). Estos resultados sugieren que el aumento del etiquetado de AcCoA lipogénico a partir de U-13C-acetato en hipoxia (aumento de ~3 veces, datos no mostrados) no puede explicarse totalmente por una mayor captación de acetato. En cambio, es probable que el aumento del etiquetado se deba en parte a un descenso de la producción de AcCoA lipogénico a partir de la glucosa en las células hipóxicas, lo que lleva a inflar la contribución relativa del acetato. Estamos investigando esto más a fondo.
Captación de acetato por las células cancerosas normoxicas e hipóxicas. Perfil de concentración de U-13C-acetato en el medio de las células A549 en a condiciones de normoxia y b hipoxia (1 % O2) y c tasas de captación calculadas a partir de (a, b). Los valores son la media ± SD (n = 3)
Concentración de acetato libre en tejidos y fluidos de ratón
Los experimentos de rastreo isotópico in vivo demostraron la utilización de acetato exógeno por parte de los tumores , confirmando un papel crítico de ACSS2 en la mediación del crecimiento en varios cánceres . Sin embargo, la disponibilidad de acetato para los tumores sólidos y la forma en que esto varía entre los órganos anfitriones sigue siendo en gran medida desconocida. En un intento de abordar esta cuestión, analizamos tejidos de múltiples órganos de ratones (C57BL/6) (corazón, riñón, hígado, pulmón, páncreas, bazo, timo), así como plasma y orina (Fig. 6). De todos los órganos analizados, el hígado contenía la mayor concentración de acetato libre, con una concentración media de 1,0 ± 0,1 nmoles de acetato por mg de tejido (es decir, ~1 mM), más del doble que cualquier otro tejido. Los nutrientes absorbidos por el intestino pasan primero por el hígado a través de la vena porta. Se ha informado de que la microbiota intestinal genera altas concentraciones milimolares de acetato y otros ácidos grasos de cadena corta, lo que justifica la elevada concentración de acetato en el hígado. Como la concentración de acetato en el hígado es mucho mayor que en la circulación sistémica (es decir, en el plasma) y en los pulmones, que contienen el primer sistema capilar perfundido por la sangre tras el paso por el hígado, éste parece captar cantidades sustanciales de acetato para su uso metabólico. El acetato también estaba considerablemente enriquecido en el páncreas y el riñón en relación con el plasma, con concentraciones de 0,5 ± 0,04 y 0,4 ± 0,06 nmoles/mg (~0,5 y 0,4 mM), respectivamente. La razón de la elevada concentración de acetato en el páncreas está aún por dilucidar. Una de las funciones de los riñones es eliminar el exceso de metabolitos hidrosolubles o tóxicos de la sangre y, teniendo en cuenta que la concentración de acetato en la orina es sustancialmente mayor que en el plasma, es posible que el acetato se excrete activamente del organismo como «residuo» metabólico. Los niveles de acetato fueron considerablemente menores en otros tejidos, encontrándose el valor más bajo en el bazo con una concentración similar a la del plasma. En conjunto, estas observaciones ponen de manifiesto que la disponibilidad de acetato puede variar considerablemente entre órganos, lo que tiene implicaciones para el metabolismo tumoral.
Concentración de acetato libre en muestras de ratón. Se obtuvieron gráficos de bigotes de (a) los tejidos del corazón, riñón, hígado, pulmón, páncreas, bazo y timo, así como para (b) el plasma y la orina de C57BL/6. Se trituraron los tejidos congelados y se utilizaron alícuotas de tejido para la cuantificación del acetato libre. Los datos son las medias ± SD de las muestras de tejido (n = 7) y de líquido (n = 5). La línea horizontal y el punto en el gráfico de caja corresponden al valor medio y al valor atípico, respectivamente. Los extremos superior e inferior de la línea vertical del diagrama de caja son los valores máximos y mínimos determinados, respectivamente. Las líneas horizontales superior e inferior de una caja son el 3er y el 1er cuartil, respectivamente
Análisis del acetato ligado en fracciones (sub)celulares y de histonas
El AcCoA ocupa un nodo central en el metabolismo y está implicado en la síntesis de biomasa, las vías catabólicas y la producción de energía. Debido a esto, el AcCoA juega un papel importante en la regulación metabólica . Esto ocurre en parte a través de la acetilación de biomoléculas, incluyendo una variedad de proteínas . Por ejemplo, la acetilación de las histonas promueve la transcripción de genes y se ha observado una correlación entre el grado de acetilación de las histonas y la agresividad de los tumores. Otra prueba de la importancia de la homeostasis de la acetilación en la progresión del cáncer es la observación de que la alteración de la dinámica de la acetilación mediante la inhibición de las desacetilasas (es decir, las HDAC y las sirtuinas) conduce a una potente inducción de la muerte de las células cancerosas. Aunque se están estudiando ampliamente varios aspectos de la acetilación, aún se desconoce mucho sobre los tamaños absolutos de las reservas y la rotación del acetato unido a biomoléculas en los distintos compartimentos celulares, y mucho menos cómo se ven afectados por las condiciones relevantes para el tumor. Para abordar esto, combinamos nuestro enfoque con la hidrólisis en condiciones básicas. Al calentar las muestras e incubarlas durante la noche con hidróxido de sodio, los enlaces de ésteres se hidrolizan, liberando acetato libre, que luego puede derivarse y analizarse como antes. El uso de este enfoque en un extracto de células enteras nos permitió cuantificar el acetato total (unido + libre) en las células A549 a 0,38 μmole/mg de proteína celular total. A continuación nos preguntamos si sería posible cuantificar el acetato unido en compartimentos celulares separados. Conseguimos una separación casi completa de las fracciones nuclear y celular residual (combinación de citosol y orgánulos distintos del núcleo) utilizando un kit comercial de aislamiento nuclear (véase la sección «Métodos») (Fig. 7b). Encontramos que el contenido de acetato ligado era aproximadamente igual para las fracciones nucleares y residuales (Fig. 7c). La suma de ambas fracciones fue igual al ~80 % de la medición de la célula completa, lo que probablemente se debe a una menor recuperación durante el fraccionamiento, pero también puede ser causado por la pérdida de acetato libre. La expresión del contenido de acetato por mg de proteína en cada fracción reveló que la densidad de acetilación en el núcleo es aproximadamente tres veces mayor que en la fracción de células residuales (Fig. 7d). Se sabe que las histonas están fuertemente acetiladas, y para determinar cuánto del acetato nuclear estaba unido a las histonas, comparamos los resultados del enfoque de aislamiento nuclear con un protocolo publicado de extracción de histonas ácidas (Fig. 7e-g) . Ambos enfoques dieron valores muy similares, indicando que casi todo el acetato unido en la fracción nuclear se debe a la acetilación de las histonas. Por lo tanto, la acetilación de histonas representa por sí sola la mitad del acetato celular total.
Cuantificación del acetato total (sub)celular. a Esquema indicando qué fracciones se analizaron. b Western-blot mostrando la calidad de la separación de la fracción nuclear (TBP) y celular residual (tubulina). c Acetato total en el extracto de células enteras o en las fracciones nuclear y celular residual. d Igual que (c), pero expresado en relación con la cantidad de proteína en cada fracción. e Las histonas (esferas rojas) están fuertemente acetiladas y la acetilación controla la expresión génica. f Western blot de las histonas tras la extracción ácida, teñido con Ponceau S. g Cantidad de acetato total de las histonas extraídas con ácido o del fraccionamiento nuclear. h Efecto del inhibidor de HDAC panobinostat en los niveles de acetato unido a las histonas. Los valores son la media ± SD (n = 3)
Este enfoque para cuantificar el acetato unido a las histonas puede ayudar a comprender mejor el efecto de la acetilación de las histonas en varios estudios relacionados con el cáncer. Para demostrar la utilidad del enfoque, tratamos las células A549 con panobinostat, un inhibidor de la pan-histona deacetilasa (HDAC). Una incubación breve de 4 horas con panobinostat provocó una duplicación de la cantidad de acetato unido a las histonas, lo que demuestra que el recambio de acetilación de las histonas es bastante rápido (Fig. 7h).
Medición del formiato y otros ácidos grasos de cadena corta
Modificando el agente de derivación, el método se puede adaptar fácilmente a otros ácidos grasos de cadena corta, incluido el formiato. El acoplamiento del formiato con el alcohol bencílico genera un derivado del formiato (formiato bencílico), que puede analizarse fácilmente por GC-MS (véase el procedimiento experimental suplementario Archivo adicional 1: S1). Ya hemos mencionado que el método de GC-MS para el análisis del acetato tarda sólo 4 minutos, con el detector de masas operando entre 2,2 y 2,7 minutos. El mismo método es capaz de analizar y cuantificar el propionato y el butirato en forma de propil-propionato y propil-butirato utilizando la misma configuración del método de derivatización de la muestra que para el acetato. Al ampliar el tiempo de funcionamiento del detector de masas de 2,2 a 4 minutos, pudimos detectar los picos de propionato y butirato que eluyen a 2,92 y 3,30 minutos, respectivamente. Utilizando los iones m/z 75 y 89 para el propionato y el butirato, respectivamente, es posible cuantificar absolutamente estos ácidos grasos de cadena corta.