En snabb metod för kvantifiering av fri och bunden acetat baserad på alkylering och GC-MS-analys

Metodbeskrivning

Vi har utvecklat en robust metod med hög genomströmning för absolut kvantifiering av acetat i biologiska prover. Metoden bygger på derivatisering med hjälp av en etablerad reaktion med metylkloroformiat (MCF) . Efter att sekventiellt ha tillsatt intern standard, 1-propanol, pyridin och natriumhydroxid initieras derivatiseringsreaktionen genom att MCF tillsätts så snart som möjligt. Den kemiska modifieringen sker under basiska förhållanden på grund av närvaron av natriumhydroxid, medan pyridin håller reaktionssystemet homogent eftersom MCF inte löser sig i enbart vatten (fig. 1). 1-Propanol används som kopplingsreagens för att producera propylacetat (fig. 2). När natriumhydroxid tillsätts till det kylda provet omedelbart innan MCF tillsätts sker ingen hydrolys (se nedan). Alkylering av acetat med MCF underlättar snabb ytterligare modifiering av acetat i vattenbaserade förhållanden. I detta fall angrips acetat-MCF-intermediären (I) av alkoholen (1-propanol), och den resulterande intermediären (II) genomgår ytterligare omarrangemang, vilket leder till bildandet av propylacetat. Sådana derivatiseringsmetoder med hjälp av kloroformatfamiljen av reagenser är väl beskrivna . För att kvantifiera utbytet av derivatiseringen och den efterföljande extraktionen i MTBE jämförde vi MS-signalintensiteten för 1 mM acetat som alkylerats till propylacetat med en ekvimolär koncentration av kommersiellt framställd propylacetat i MTBE. Baserat på detta fann vi att återvinningen var 95,5 ± 1,57 % (Additional file 1: Table S1).

Derivatiseringsreaktionen med MCF är kraftig och exoterm, vilket ger upphov till gaser (klorvätesyra, koldioxid) som gör att trycket ökar i röret. Vi rekommenderar därför att man följer de allmänna hälso- och säkerhetsreglerna när man utför kemisk derivatisering, dvs. bär labbrock, handskar och skyddsglasögon, samtidigt som man utför reaktionen i ett dragskåp. För att minimera reaktionens kraft och därmed tryckökningen är det viktigt att inkubera provet på is (5 min) före derivatiseringen. Vi rekommenderar att hålla locket stängt med ett finger under vortexning och att försiktigt öppna röret efteråt (ett ”poppande” ljud kan höras). Alternativt kan röret hållas öppet under vortexningen, beroende på forskarens önskemål (vi finner att rörets innehåll inte spiller ut när det hanteras försiktigt). Därefter kan den derivatiserade acetaten (propylacetat) lätt extraheras i organiskt lösningsmedel (MTBE) följt av GC-MS-analys (fig. 1).

Andra primära alkoholer (t.ex. metanol och etanol som producerar metyl- respektive etylacetat) kan också användas för derivatisering. Vi fann dock att med vår medelpolära GC-kolonn (som vi anser vara mycket lämplig för analys av ett brett spektrum av metaboliter) ger propylacetat den optimala toppformen och retentionstiden för snabb analys. Det provberedningsprotokoll som beskrivs här är mycket snabbt med en total derivatiseringstid på mindre än 1 minut per prov. Tillsammans med det korta GC-MS-programmet med en total körtid på 4 minuter per prov underlättar detta analyser med hög genomströmning. Även om acetatisotopologerna 12C-acetat, U-13C-acetat och 2H3-acetat har nästan identiska retentionstider kan deras toppar lätt avvecklas med hjälp av specifika joner (fig. 3). Såsom i allmänhet observeras vid GC-analys av deutererade analyter har 2H3-acetatderivatet en något kortare retentionstid på grund av den omvända isotopeffekten . Jonerna m/z 61, 63 och 64 för 12C2-acetat, U-13C2-acetat respektive 2H3-acetat användes för absolut kvantifiering och visade optimal linjär respons.

Metodvalidering

För att bedöma repeterbarheten av provberedningen och analysförfarandet bestämde vi den relativa standardavvikelsen (RSD) för 12C- och U-13C-acetat i nypreparerade standarder vid 50, 200 och 1000 μM för de respektive acetatisotopologerna. Metoden visade utmärkt repeterbarhet med en RSD < 5 % för standarder och < 10 % för biologiska prover (Additional file 1: Tabell S2). Det linjära kvantifieringsområdet bedömdes genom analys av seriellt utspädda standarder av både 12C- och U-13C-acetat inom intervallet 2-2000 μM. Vi kunde inte fastställa detektionsgränsen (LOD) för 12C-acetat eftersom en bakgrundssignal av acetat på cirka 15 μM alltid förekom i våra prover, även om endast reagenser av högsta renhet användes. Det verkar som om acetat är en vanlig spårförorening i atmosfären och reagenserna samt i plast och glas, i likhet med vad som har observerats för långkedjiga fettsyror . För att undersöka detta ytterligare försökte vi fastställa de exakta källorna till bakgrundsacetat (Additional file 1: Figur S1). Eftersom vi analyserar acetat i dess derivatiserade propylacetatform kan den bakgrundssignal som vi vanligtvis observerar antingen komma från propylacetat direkt eller från bakgrundsacetat som har derivatiserats till propylacetat under provberedningen. För att undersöka förekomsten av bakgrunds-propyl-acetat utförde vi ett experiment i både plast- och glasvaror där vi analyserade nivån av propyl-acetat i reagenser som används för kemisk derivatisering. Vi observerade att 1-propanol har den högsta bakgrunden av propylacetat, men att den endast står för ~10 % av den bakgrundsacetat som observeras i procedurblankor (PB, dvs. blankprover som har genomgått hela provberedningen och masspektrometrianalysen), vilket tyder på att fri acetat, snarare än propylacetat, är den viktigaste kontaminanten. Tyvärr behövs alla reagenser för derivatiseringen, så vi kan inte fastställa vilken reagens som innehåller mest bakgrundsacetat. Vi utförde dock hela derivatiserings- och extraktionsförfarandet på blankprover i både glas- och plaströr. Vi fann att i plast är den resulterande acetatbakgrunden ~50 % högre än i glas. På grund av dess bekvämlighet föredrar vi fortfarande att arbeta med plaströr och vi överlåter detta beslut till den enskilda undersökaren.

Oavsett bakgrundsacetat, eftersom svaret visade sig vara mycket linjärt, kunde vi subtrahera bakgrundssignalen (vi kvantifierar acetatbakgrunden med hjälp av blanka prover som har genomgått hela provberednings- och masspektrometrianalysförfarandet, dvs. procedurblanka prover), vilket resulterade i ett linjärt dynamiskt område från 2 till 2 000 μM för både 12C-acetat och U-13C-acetat. Den fastställda kvantifieringsgränsen (LOQ) för U-13C-acetat var 0,1 μM. För att hålla kontamineringen av 12C-acetat till ett minimum rekommenderar vi att man regelbundet (varje vecka) förbereder nya reagenser, och vi rekommenderar också att man rutinmässigt tar med blankprov. Noterbart är att vi rekommenderar användare att kvantifiera sin egen bakgrundssignal för acetat eftersom den beror på de material och reagenser som används och därför är det mycket troligt att den är laboratoriespecifik.

Vi anser att vårt tillvägagångssätt är ett optimerat alternativ till andra publicerade derivatiseringsmetoder, för snabb mätning av acetat . En metod baserad på silylering av acetat med N-tert-butyldimetylsilyl-N-metyltrifluoroacetamid (MTBSTFA) visade ett brett linjärt område för kvantifiering av acetat (0-3500 μM), hög repeterbarhet och låg relativ standardavvikelse (RSD < 5 %) . Den är dock inte lämplig för behandling av vattenbaserade prover, de många extraktionsstegen kan leda till höga bakgrundsnivåer av acetat och MS-körtiden är lång för analys av enbart acetat. Ett tillvägagångssätt som bygger på alkylering med hjälp av propylkloroformiat (PCF) liknar vårt tillvägagångssätt när det gäller metodik och analytisk prestanda, men använder större reagensvolymer (vilket ökar risken för höga bakgrundsnivåer av acetat) och längre MS-körningstider, eftersom det inte var optimerat för acetat specifikt, och det nämner inte formiat . Den publicerade nedre kvantifieringsgränsen var jämförbar med vår metod (15 μM för den aktuella metoden jämfört med 16 μM som rapporterades av Zheng et al. ). Zheng et al. rapporterade ett bredare intervall för linjär respons, dvs. 16 μM-8 mM. Vi testade inte bortom 2 mM eftersom vi inte har observerat så höga nivåer i ett fysiologiskt sammanhang. Den rapporterade repeterbarheten observerades vara mycket likartad med 0,54 % RSD (n = 6) som rapporterades av Zheng et al. och ~0,7 % RSD (n = 3) beroende på acetatkoncentrationen, som rapporterades i den nuvarande metoden för standardprover (relativa standardavvikelser sammanfattas i Additional file 1: Table S2). I en annan GC-MS-baserad metod för analys av kortkedjiga fettsyror användes 2,4-difluoranilin och 1,3-dicyklokarbodiimid som kondensationsreagenser, vilket krävde ett inkubationssteg på 1 timme . Sammantaget bidrar det arbete som presenteras här med följande, utöver de redan publicerade metoderna: (1) en optimerad metod för acetat samt en anpassad metod för att mäta format, (2) en djupgående diskussion om bakgrundsacetat, dess potentiella källor och hur man hanterar det på ett praktiskt sätt, och (3) ett tillvägagångssätt för att inte bara mäta fritt acetat utan även bundet acetat.

Provförberedelseprotokollet innefattar tillsats av natriumhydroxid för att underlätta alkyleringsreaktionen. Även om detta sker omedelbart före derivatiseringsreaktionen och proverna kyls, kan detta potentiellt leda till oönskad hydrolys av acetylerade biomolekyler, vilket leder till ökade nivåer av fri acetat. För att testa om detta inträffar utförde vi provberedning och analys av 10 mM lösningar av N-acetyl-l-asparaginsyra (NAA) och N-acetyl-l-cystein (NAC), 1 g/L BSA samt blankprov. Eftersom acetylering av aminosyror är den vanligaste källan till bunden acetat och vi inte observerade någon signifikant ökning av signalen, drar vi slutsatsen att bidraget från hydrolyserad bunden acetat är försumbart (Fig. 4).

Acetatkvantifiering i biologiska prover

Med tanke på att vi har fastställt att vår metod kan kvantifiera acetat på ett korrekt och reproducerbart sätt ville vi därefter fastställa om den kan reproducera tidigare fastställda resultat. Vi kvantifierade därför acetat i plasma från åtta friska individer. Plasmaacetatkoncentrationerna varierade från 20 till 51 μM med en mediankoncentration på 34,1 ± 9,0 μM (data visas inte). Detta faller inom de tidigare publicerade värdena 41,9 ± 15,1 μM och 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

Nyligen har flera studier identifierat en viktig roll för enzymet acetyl-CoA-syntetas 2 (ACSS2) för att förmedla tumörtillväxt under hypoxiska och näringsbegränsade förhållanden . ACSS2 ”aktiverar” acetat till AcCoA så att det kan användas för nedströmsmetaboliska reaktioner, inklusive lipogenes. Tillsats av U-13C-acetat till mediet av odlade cancerceller visade ökad märkning av lipogen AcCoA, och följaktligen fettsyror, under hypoxiska förhållanden jämfört med normoxiska förhållanden . I vilken utsträckning denna ökade märkning orsakas av ett ökat upptag av acetat är dock fortfarande okänt. För att lösa detta odlade vi A549 lungkarcinomceller i normoxiska eller hypoxiska (1 % O2) förhållanden i medium som innehöll 500 μM U-13C-acetat och följde dess koncentration över tiden med hjälp av vår nya metod (fig. 5). I överensstämmelse med den observerade märkningen av lipogen AcCoA från U-13C-acetat observerades en robust konsumtion av U-13C-acetat av hypoxiska celler, vilket framgår av en tydlig minskning i mediet. Överraskande nog var märkningen av lipogen AcCoA under normoxiska förhållanden betydligt mindre än under hypoxi, men normoxiska celler uppvisade också en ivrig konsumtion av U-13C-acetat. Acetatupptagningshastigheten för hypoxiska celler var med 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL celler (PCV) något högre än för normoxiska celler (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL celler). Dessa resultat tyder på att den ökade märkningen av lipogen AcCoA från U-13C-acetat vid hypoxi (~3-faldig ökning, data visas inte) inte helt kan förklaras av ökat acetatupptag. Istället är det troligt att den ökade märkningen delvis orsakas av en minskad produktion av lipogen AcCoA från glukos i hypoxiska celler, vilket leder till en inflation av det relativa bidraget från acetat. Vi håller på att undersöka detta ytterligare.

Fri acetatkoncentration i vävnader och vätskor från musen

In vivo isotopspårningsexperiment visade på utnyttjandet av exogent acetat av tumörer, vilket bekräftar att ACSS2 har en kritisk roll för att förmedla tillväxten i olika cancerformer. Tillgängligheten av acetat för solida tumörer och hur den varierar mellan olika värdorgan är dock fortfarande till stor del okänd. I ett försök att ta itu med detta analyserade vi vävnader från flera musorgan (C57BL/6) (hjärta, njure, lever, lunga, bukspottkörtel, mjälte, tymus) samt plasma och urin (fig. 6). Av alla analyserade organ innehöll levern den högsta koncentrationen av fri acetat med en genomsnittlig koncentration på 1,0 ± 0,1 nmole acetat per mg vävnad (dvs. ~1 mM), mer än dubbelt så mycket som någon annan vävnad. Näringsämnen som absorberas av tarmen kommer först att passera genom levern via portvenen. Höga millimolära koncentrationer av acetat och andra kortkedjiga fettsyror har rapporterats genereras av tarmmikrobiota , och detta ger en förklaring till den höga acetatkoncentrationen i levern. Eftersom koncentrationen av acetat i levern är mycket högre än i den systemiska cirkulationen (dvs. plasma) och i lungorna, som innehåller det första kapillärsystemet som genomblåses av blod efter leverns passage, verkar levern fånga upp stora mängder acetat för metabolisk användning. Acetat var också avsevärt anrikat i bukspottkörteln och njurarna i förhållande till plasma, med koncentrationer på 0,5 ± 0,04 och 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 och 0,4 mM), respektive. Orsaken till den höga acetathalten i bukspottkörteln återstår att klarlägga. En av njurarnas funktioner är att rensa ut vattenlösliga överskott eller giftiga metaboliter från blodet, och med tanke på att acetatkoncentrationen i urinen är betydligt högre än i plasma kan acetat faktiskt aktivt utsöndras från kroppen som metaboliskt ”avfall”. Acetatnivåerna var betydligt lägre i andra vävnader och det lägsta värdet fanns i mjälten med en koncentration som liknade plasmanivåerna. Tillsammans belyser dessa observationer att tillgängligheten av acetat kan variera avsevärt mellan olika organ, vilket har betydelse för tumörmetabolismen.

Analys av bundet acetat i (sub)cellulära fraktioner och histonfraktioner

AcCoA upptar en central nod i ämnesomsättningen och är involverad i syntesen av biomassa, kataboliska vägar och energiproduktion. På grund av detta spelar AcCoA en viktig roll i metabolisk reglering . Detta sker delvis genom acetylering av biomolekyler, inklusive en rad olika proteiner . Acetylering av histoner främjar till exempel gentranskription och man har observerat en korrelation mellan graden av histonacetylering och tumöraggressivitet . Ytterligare bevis för betydelsen av homeostas av acetylering i cancerutveckling kommer från observationen att störning av acetyleringsdynamiken genom inhibering av deacetylaser (dvs. HDAC, sirtuiner) leder till kraftig induktion av cancercellsdöd . Även om flera aspekter av acetylering studeras ingående är det fortfarande mycket som är okänt om de absoluta poolstorlekarna och omsättningen av acetat som är bundet till biomolekyler i de olika cellkompartmenten, för att inte tala om hur de påverkas av tumörrelevanta förhållanden. För att ta itu med detta kombinerade vi vårt tillvägagångssätt med hydrolys under basiska förhållanden. Genom att värma proverna och inkubera dem över natten med natriumhydroxid hydrolyseras esterbindningarna och frigör fri acetat, som sedan kan derivatiseras och analyseras som tidigare. Genom att använda detta tillvägagångssätt på ett helcelextrakt kunde vi kvantifiera total (bunden + fri) acetat i A549-celler vid 0,38 μmole/mg totalt cellprotein. Därefter frågade vi om det skulle vara möjligt att kvantifiera bunden acetat i separata cellkompartment. Vi uppnådde en nästan fullständig separation av kärn- och resterande cellfraktioner (kombination av cytosol och andra organeller än kärnan) med hjälp av ett kommersiellt kit för isolering av kärnor (se avsnittet ”Metoder”) (fig. 7b). Vi fann att den bundna acetathalten var ungefär lika stor för kärn- och restfraktionerna (fig. 7c). Summan av de båda fraktionerna motsvarade ~80 % av helcellsmåttet, vilket sannolikt orsakas av minskad återhämtning under fraktionering, men kan också orsakas av förlust av fri acetat. Genom att uttrycka acetatinnehållet per mg protein i varje fraktion visade det sig att acetyleringstätheten i kärnan är ungefär tre gånger högre än i den kvarvarande cellfraktionen (fig. 7d). Histoner är kända för att vara kraftigt acetylerade, och för att fastställa hur mycket av kärnacetatet som var histonbundet jämförde vi resultaten av kärnisolationsmetoden med ett publicerat surt histonextraktionsprotokoll (fig. 7e-g) . Båda tillvägagångssätten gav mycket liknande värden, vilket tyder på att nästan all bunden acetat i kärnfraktionen beror på histonacetylering. Således står histonacetylering ensam för hälften av den totala cellulära acetaten.

Detta tillvägagångssätt för att kvantifiera histonbunden acetat kan bidra till att bättre förstå effekten av histonacetylering i olika cancerrelaterade studier. För att visa på användbarheten av metoden behandlade vi A549-celler med panobinostat, en pan-histondeacetylas (HDAC)-hämmare. En kort inkubation på 4 timmar med panobinostat orsakade nästan en fördubbling av mängden histonbundet acetat, vilket visar att omsättningen av histonacetylering är ganska snabb (fig. 7h).

Mätning av format och andra kortkedjiga fettsyror

Då derivatiseringsmedlet modifieras, kan metoden lätt anpassas till andra kortkedjiga fettsyror, inklusive format. Koppling av format med bensylalkohol genererar formatderivat (bensylformiat), som lätt kan analyseras med GC-MS (se kompletterande experimentella förfaranden Additional file 1: S1). Vi har tidigare nämnt att GC-MS-metoden för acetatanalys tar endast 4 minuter, med en massedetektor som arbetar mellan 2,2 och 2,7 minuter. Samma metod kan analysera och kvantifiera propionat och butyrat i form av propylpropionat och propylbutyrat med hjälp av samma uppställning av provderivatiseringsmetoden som för acetat. Genom att förlänga massdetektorns drifttid från 2,2 till 4 minuter kunde vi detektera propionat- och butyrattopparna som eluerar vid 2,92 respektive 3,30 minuter. Genom att använda joner m/z 75 och 89 för propionat respektive butyrat är det möjligt att absolut kvantifiera dessa kortkedjiga fettsyror.