Eine schnelle Methode zur Quantifizierung von freiem und gebundenem Acetat auf der Grundlage von Alkylierung und GC-MS-Analyse

Methodenbeschreibung

Wir haben eine robuste und durchsatzstarke Methode zur absoluten Quantifizierung von Acetat in biologischen Proben entwickelt. Die Methode basiert auf einer Derivatisierung unter Verwendung einer etablierten Reaktion mit Methylchlorformiat (MCF) . Nach der sequentiellen Zugabe von internem Standard, 1-Propanol, Pyridin und Natriumhydroxid wird die Derivatisierungsreaktion so schnell wie möglich durch Zugabe von MCF eingeleitet. Die chemische Modifikation erfolgt aufgrund der Anwesenheit von Natriumhydroxid unter basischen Bedingungen, während Pyridin das Reaktionssystem homogen hält, da sich MCF in Wasser allein nicht auflöst (Abb. 1). 1-Propanol wird als Kupplungsreagenz verwendet, um Propylacetat herzustellen (Abb. 2). Wird der gekühlten Probe unmittelbar vor der Zugabe von MCF Natriumhydroxid zugesetzt, findet keine Hydrolyse statt (siehe unten). Die Alkylierung von Acetat mit MCF erleichtert die schnelle weitere Modifizierung von Acetat unter wässrigen Bedingungen. In diesem Fall wird das Acetat-MCF-Zwischenprodukt (I) durch den Alkohol (1-Propanol) angegriffen, und das resultierende Zwischenprodukt (II) durchläuft weitere Umlagerungen, die zur Bildung von Propylacetat führen. Derartige Derivatisierungsansätze unter Verwendung von Reagenzien aus der Chlorameisensäurefamilie sind gut beschrieben. Um die Ausbeute der Derivatisierung und der anschließenden Extraktion in MTBE zu quantifizieren, verglichen wir die MS-Signalintensität von 1 mM zu Propylacetat alkyliertem Acetat mit einer äquimolaren Konzentration von kommerziell gewonnenem Propylacetat in MTBE. Auf dieser Grundlage ermittelten wir eine Wiederfindung von 95,5 ± 1,57 % (Additional file 1: Table S1).

Die Derivatisierungsreaktion mit MCF ist heftig und exotherm, wobei Gase (Salzsäure, Kohlendioxid) entstehen, die zu einem Druckanstieg im Rohr führen. Wir empfehlen daher, bei der Durchführung der chemischen Derivatisierung die allgemeinen Gesundheits- und Sicherheitsregeln zu beachten, d. h. einen Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille zu tragen und die Reaktion in einem Abzug durchzuführen. Um die Reaktionsstärke und damit die Druckbelastung zu minimieren, ist es wichtig, die Probe vor der Derivatisierung auf Eis (5 Minuten) zu inkubieren. Wir empfehlen, den Deckel während des Vortexens mit einem Finger geschlossen zu halten und das Röhrchen anschließend vorsichtig zu öffnen (ein „Plopp“-Geräusch ist zu hören). Alternativ kann das Röhrchen auch während des Vortexens geöffnet bleiben, je nach Vorliebe des Forschers (wir haben festgestellt, dass der Inhalt des Röhrchens bei vorsichtiger Handhabung nicht überläuft). Anschließend lässt sich das derivatisierte Acetat (Propylacetat) leicht in ein organisches Lösungsmittel (MTBE) extrahieren, gefolgt von der GC-MS-Analyse (Abb. 1).

Auch andere primäre Alkohole (z. B. Methanol und Ethanol, die Methyl- bzw. Ethylacetat ergeben) können zur Derivatisierung verwendet werden. Wir haben jedoch festgestellt, dass Propylacetat mit unserer mittelpolaren GC-Säule (die wir für die Analyse eines breiten Spektrums von Metaboliten für sehr geeignet halten) die optimale Peakform und Retentionszeit für eine schnelle Analyse bietet. Das hier beschriebene Probenvorbereitungsprotokoll ist mit einer Gesamtderivatisierungszeit von weniger als 1 Minute pro Probe sehr schnell. Zusammen mit dem kurzen GC-MS-Programm mit einer Gesamtlaufzeit von 4 Minuten pro Probe ermöglicht dies eine Hochdurchsatzanalyse. Da die Acetat-Isotopologe 12C-Acetat, U-13C-Acetat und 2H3-Acetat fast identische Retentionszeiten haben, können ihre Peaks leicht durch spezifische Ionen dekonvolutiert werden (Abb. 3). Wie bei der GC-Analyse von deuterierten Analyten allgemein zu beobachten ist, hat das 2H3-Acetat-Derivat aufgrund des inversen Isotopeneffekts eine etwas kürzere Retentionszeit. Die Ionen m/z 61, 63 und 64 für 12C2-Acetat, U-13C2-Acetat bzw. 2H3-Acetat wurden für die absolute Quantifizierung verwendet und zeigten eine optimale lineare Reaktion.

Methodenvalidierung

Um die Wiederholbarkeit der Probenvorbereitung und des Analyseverfahrens zu bewerten, bestimmten wir die relative Standardabweichung (RSD) für 12C- und U-13C-Acetat in frisch hergestellten Standards bei 50, 200 und 1000 μM für die jeweiligen Acetat-Isotopologe. Die Methode zeigte eine ausgezeichnete Wiederholbarkeit mit einer RSD < 5 % für Standards und < 10 % für biologische Proben (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Der lineare Bereich der Quantifizierung wurde durch die Analyse seriell verdünnter Standards von sowohl 12C- als auch U-13C-Acetat im Bereich von 2-2000 μM ermittelt. Wir waren nicht in der Lage, die Nachweisgrenze (LOD) für 12C-Acetat zu bestimmen, da in unseren Proben immer ein Acetat-Hintergrundsignal von etwa 15 μM vorhanden war, obwohl nur Reagenzien höchster Reinheit verwendet wurden. Es scheint, dass Acetat eine häufige Spurenverunreinigung in der Atmosphäre und den Reagenzien sowie in den Kunststoff- und Glasgeräten ist, ähnlich wie dies bei längerkettigen Fettsäuren beobachtet wurde. Um dies weiter zu untersuchen, haben wir versucht, die genauen Quellen des Hintergrund-Acetats zu bestimmen (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1). Da wir Acetat in seiner derivatisierten Propylacetatform analysieren, könnte das Hintergrundsignal, das wir üblicherweise beobachten, entweder von direktem Propylacetat oder von Hintergrundacetat stammen, das während der Probenvorbereitung zu Propylacetat derivatisiert wird. Um das Vorhandensein von Hintergrund-Propylacetat zu untersuchen, führten wir ein Experiment mit Kunststoff- und Glasgeräten durch, bei dem wir den Propylacetatgehalt in den für die chemische Derivatisierung verwendeten Reagenzien analysierten. Wir stellten fest, dass 1-Propanol den höchsten Propylacetat-Hintergrundgehalt aufweist, aber nur ~10 % des Acetat-Hintergrundgehalts in Leerproben (PB, d. h. Leerproben, die dem gesamten Probenvorbereitungs- und Massenspektralanalyseverfahren unterzogen wurden) ausmacht, was darauf hindeutet, dass freies Acetat und nicht Propylacetat die Hauptverunreinigung darstellt. Leider werden alle Reagenzien für die Derivatisierung benötigt, so dass wir nicht feststellen können, welches Reagenz das meiste Hintergrund-Acetat enthält. Wir haben jedoch das gesamte Derivatisierungs- und Extraktionsverfahren an Leerproben in Glas- und Kunststoffröhrchen durchgeführt. Wir haben festgestellt, dass der resultierende Acetat-Hintergrund in Kunststoffröhrchen um 50 % höher ist als in Glasröhrchen. Da sich die Reaktion unabhängig vom Acetat-Hintergrund als sehr linear erwies, konnten wir das Hintergrundsignal subtrahieren (wir quantifizieren den Acetat-Hintergrund unter Verwendung von Leerproben, die das gesamte Probenvorbereitungs- und Massenspektralanalyseverfahren durchlaufen haben, d. h. Leerproben), was zu einem linearen dynamischen Bereich von 2 bis 2000 μM sowohl für 12C-Acetat als auch für U-13C-Acetat führte. Die ermittelte Bestimmungsgrenze (LOQ) für U-13C-Acetat betrug 0,1 μM. Um die Kontamination mit 12C-Acetat so gering wie möglich zu halten, empfehlen wir, regelmäßig (wöchentlich) frische Reagenzien zuzubereiten und routinemäßig Leerwertproben zu verwenden. Wir empfehlen den Anwendern, ihr eigenes Acetat-Hintergrundsignal zu quantifizieren, da es von den verwendeten Materialien und Reagenzien abhängt und daher höchstwahrscheinlich laborspezifisch ist.

Wir halten unseren Ansatz für eine optimierte Alternative zu anderen veröffentlichten Derivatisierungsmethoden für die schnelle Messung von Acetat. Ein Ansatz, der auf der Silylierung von Acetat mit N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid (MTBSTFA) basiert, zeigte einen weiten linearen Bereich für die Acetatquantifizierung (0-3500 μM), eine hohe Wiederholbarkeit und eine geringe relative Standardabweichung (RSD < 5 %) . Es ist jedoch nicht für die Verarbeitung von Proben auf Wasserbasis geeignet, die mehrfachen Extraktionsschritte können zu hohen Acetat-Hintergrundwerten führen, und die MS-Laufzeit ist für die Analyse von Acetat allein lang. Ein auf der Alkylierung mit Propylchlorformiat (PCF) basierender Ansatz ähnelt dem unseren in Bezug auf Methodik und analytische Leistung, verwendet jedoch größere Reagenzienvolumina (was das Risiko hoher Acetat-Hintergrundwerte erhöht) und längere MS-Laufzeiten, da er nicht speziell für Acetat optimiert wurde, und erwähnt kein Formiat. Die veröffentlichte untere Bestimmungsgrenze war mit unserer Methode vergleichbar (15 μM für die derzeitige Methode gegenüber 16 μM, die von Zheng et al. berichtet wurde). Zheng et al. berichteten über einen breiteren Bereich der linearen Reaktion, d. h. 16 μM-8 mM. Wir haben keine Tests über 2 mM hinaus durchgeführt, da wir solche hohen Konzentrationen in einem physiologischen Kontext nicht beobachtet haben. Die gemeldete Wiederholbarkeit war mit der von Zheng et al. gemeldeten RSD von 0,54 % (n = 6) und einer RSD von ~0,7 % (n = 3) in Abhängigkeit von der Acetatkonzentration, die bei der aktuellen Methode für Standardproben gemeldet wurde, sehr ähnlich (relative Standardabweichungen zusammengefasst in Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Eine andere GC-MS-basierte Methode für die Analyse kurzkettiger Fettsäuren schließlich verwendete 2,4-Difluoranilin und 1,3-Dicyclocarbodiimid als Kondensationsreagenzien, was einen 1-stündigen Inkubationsschritt erforderte. Insgesamt leistet die hier vorgestellte Arbeit zusätzlich zu den bereits veröffentlichten Methoden folgende Beiträge: (1) eine optimierte Methode für Acetat sowie eine angepasste Methode zur Messung von Formiat, (2) eine eingehende Diskussion über Hintergrund-Acetat, seine potenziellen Quellen und den praktischen Umgang damit sowie (3) einen Ansatz, um nicht nur freies, sondern auch gebundenes Acetat zu messen.

Das Probenvorbereitungsprotokoll umfasst die Zugabe von Natriumhydroxid, um die Alkylierungsreaktion zu erleichtern. Obwohl dies unmittelbar vor der Derivatisierungsreaktion geschieht und die Proben gekühlt werden, könnte dies möglicherweise zu einer unerwünschten Hydrolyse acetylierter Biomoleküle führen, was zu einem erhöhten Gehalt an freiem Acetat führt. Um zu testen, ob dies der Fall ist, haben wir die Probenvorbereitung und -analyse mit 10 mM-Lösungen von N-Acetyl-l-Asparaginsäure (NAA) und N-Acetyl-l-Cystein (NAC), 1 g/L BSA sowie mit Leerproben durchgeführt. Da die Aminosäureacetylierung die häufigste Quelle für gebundenes Acetat ist und wir keine signifikante Erhöhung des Signals beobachten konnten, schließen wir, dass der Beitrag von hydrolysiertem gebundenem Acetat vernachlässigbar ist (Abb. 4).

Acetatquantifizierung in biologischen Proben

Nachdem wir festgestellt haben, dass unsere Methode Acetat genau und reproduzierbar quantifizieren kann, wollten wir als Nächstes feststellen, ob sie die zuvor ermittelten Ergebnisse reproduzieren kann. Daher haben wir Acetat im Plasma von acht gesunden Personen quantifiziert. Die Acetatkonzentrationen im Plasma schwankten zwischen 20 und 51 μM mit einer mittleren Konzentration von 34,1 ± 9,0 μM (Daten nicht gezeigt). Dies liegt innerhalb der zuvor veröffentlichten Werte von 41,9 ± 15,1 μM und 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

In jüngster Zeit wurde in mehreren Studien eine wichtige Rolle des Enzyms Acetyl-CoA-Synthetase 2 (ACSS2) bei der Vermittlung des Tumorwachstums unter hypoxischen und nährstoffarmen Bedingungen festgestellt. ACSS2 „aktiviert“ Acetat zu AcCoA, so dass es für nachgeschaltete Stoffwechselreaktionen, einschließlich der Lipogenese, verwendet werden kann. Die Zugabe von U-13C-Acetat zum Medium von kultivierten Krebszellen ergab eine erhöhte Markierung von lipogenem AcCoA und folglich von Fettsäuren unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu normoxischen Bedingungen. Inwieweit diese verstärkte Markierung jedoch auf eine erhöhte Acetataufnahme zurückzuführen ist, bleibt unbekannt. Um dies zu klären, kultivierten wir A549-Lungenkarzinomzellen unter normoxischen oder hypoxischen (1 % O2) Bedingungen in einem Medium, das 500 μM U-13C-Acetat enthielt, und verfolgten seine Konzentration mit unserer neuen Methode über die Zeit (Abb. 5). In Übereinstimmung mit der beobachteten Markierung von lipogenem AcCoA aus U-13C-Acetat wurde ein starker Verbrauch von U-13C-Acetat durch hypoxische Zellen beobachtet, was durch eine deutliche Verringerung im Medium belegt wird. Überraschenderweise ist die Markierung von lipogenem AcCoA unter normoxischen Bedingungen zwar deutlich geringer als unter Hypoxie, aber auch normoxische Zellen zeigten einen regen U-13C-Acetat-Verbrauch. Die Acetat-Aufnahmeraten für hypoxische Zellen waren mit 2,5 ± 0,1 nmol/h/μL Zellen (PCV) geringfügig höher als für normoxische Zellen (1,9 ± 0,1 nmol/h/μL Zellen). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die erhöhte Markierung von lipogenem AcCoA aus U-13C-Acetat unter Hypoxie (~3-facher Anstieg, Daten nicht gezeigt) nicht vollständig durch eine erhöhte Acetataufnahme erklärt werden kann. Stattdessen wird die erhöhte Markierung wahrscheinlich teilweise durch einen Rückgang der Produktion von lipogenem AcCoA aus Glukose in hypoxischen Zellen verursacht, was zu einer Erhöhung des relativen Beitrags von Acetat führt. Wir sind dabei, dies weiter zu untersuchen.

Konzentration von freiem Acetat im Gewebe und in den Flüssigkeiten von Mäusen

In-vivo-Experimente zur Isotopenverfolgung haben die Verwertung von exogenem Acetat durch Tumore gezeigt und bestätigen eine entscheidende Rolle von ACSS2 bei der Vermittlung von Wachstum in verschiedenen Krebsarten. Die Verfügbarkeit von Acetat für solide Tumoren und die Unterschiede zwischen den Wirtsorganen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Um diese Frage zu klären, analysierten wir Gewebe aus verschiedenen Mäuseorganen (C57BL/6) (Herz, Niere, Leber, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Milz, Thymus) sowie Plasma und Urin (Abb. 6). Von allen analysierten Organen enthielt die Leber die höchste Konzentration an freiem Acetat mit einer durchschnittlichen Konzentration von 1,0 ± 0,1 nmol Acetat pro mg Gewebe (d. h. ~1 mM), mehr als doppelt so viel wie jedes andere Gewebe. Nährstoffe, die aus dem Darm aufgenommen werden, passieren zunächst über die Pfortader die Leber. Es wurde berichtet, dass hohe millimolare Konzentrationen von Acetat und anderen kurzkettigen Fettsäuren von der Darmmikrobiota gebildet werden, was eine Erklärung für die hohe Acetatkonzentration in der Leber liefert. Da die Acetatkonzentration in der Leber viel höher ist als im systemischen Kreislauf (d. h. im Plasma) und in der Lunge, die das erste Kapillarsystem enthält, das nach der Leberpassage von Blut durchströmt wird, scheint die Leber erhebliche Mengen an Acetat für den Stoffwechsel zu speichern. Auch in der Bauchspeicheldrüse und den Nieren war Acetat im Vergleich zum Plasma erheblich angereichert, mit Konzentrationen von 0,5 ± 0,04 bzw. 0,4 ± 0,06 nmol/mg (~0,5 bzw. 0,4 mM). Der Grund für die hohe Acetatkonzentration in der Bauchspeicheldrüse muss noch geklärt werden. Eine Aufgabe der Nieren besteht darin, wasserlösliche überschüssige oder toxische Stoffwechselprodukte aus dem Blut auszuscheiden, und da die Acetatkonzentration im Urin wesentlich höher ist als im Plasma, könnte Acetat tatsächlich aktiv als Stoffwechsel-„Abfall“ aus dem Körper ausgeschieden werden. In anderen Geweben war der Acetatgehalt deutlich geringer, wobei der niedrigste Wert in der Milz mit einer ähnlichen Konzentration wie im Plasma gefunden wurde. Zusammengenommen unterstreichen diese Beobachtungen, dass die Verfügbarkeit von Acetat zwischen den Organen erheblich variieren kann, was Auswirkungen auf den Tumorstoffwechsel hat.

Analyse von gebundenem Acetat in (sub)zellulären und Histonfraktionen

AcCoA nimmt einen zentralen Knotenpunkt im Stoffwechsel ein und ist an der Biomassesynthese, an katabolen Wegen und an der Energieproduktion beteiligt. Aus diesem Grund spielt AcCoA eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels. Dies geschieht zum Teil durch die Acetylierung von Biomolekülen, einschließlich einer Vielzahl von Proteinen. Beispielsweise fördert die Acetylierung von Histonen die Gentranskription, und es wurde eine Korrelation zwischen dem Grad der Histonacetylierung und der Aggressivität von Tumoren beobachtet. Ein weiterer Beleg für die Bedeutung der Acetylierungshomöostase für das Fortschreiten von Krebs ist die Beobachtung, dass eine Störung der Acetylierungsdynamik durch Hemmung von Deacetylasen (d. h. HDACs, Sirtuine) zu einer starken Induktion des Todes von Krebszellen führt. Während verschiedene Aspekte der Acetylierung eingehend untersucht werden, ist noch vieles über die absolute Größe der Pools und den Umsatz von an Biomoleküle gebundenem Acetat in den verschiedenen Zellkompartimenten unbekannt, ganz zu schweigen davon, wie sie durch tumorrelevante Bedingungen beeinflusst werden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir unseren Ansatz mit der Hydrolyse unter einfachen Bedingungen kombiniert. Durch Erhitzen der Proben und Inkubation mit Natriumhydroxid über Nacht werden die Esterbindungen hydrolysiert, wodurch freies Acetat freigesetzt wird, das dann wie zuvor derivatisiert und analysiert werden kann. Die Anwendung dieses Ansatzes auf einen Gesamtzellextrakt ermöglichte es uns, das gesamte (gebundene + freie) Acetat in A549-Zellen bei 0,38 μmol/mg Gesamtzellprotein zu quantifizieren. Als nächstes fragten wir, ob es möglich wäre, gebundenes Acetat in separaten Zellkompartimenten zu quantifizieren. Mit Hilfe eines kommerziellen Kits zur Isolierung des Zellkerns (siehe Abschnitt „Methoden“) gelang uns eine nahezu vollständige Trennung der Kern- und der restlichen Zellfraktion (Kombination aus Zytosol und anderen Organellen als dem Zellkern) (Abb. 7b). Wir stellten fest, dass der Gehalt an gebundenem Acetat in den Kern- und Restfraktionen ungefähr gleich war (Abb. 7c). Die Summe beider Fraktionen entsprach ~80 % der Messung für die gesamte Zelle, was höchstwahrscheinlich auf eine geringere Wiederfindung während der Fraktionierung zurückzuführen ist, aber auch durch den Verlust von freiem Acetat verursacht werden kann. Die Berechnung des Acetatgehalts pro mg Protein in jeder Fraktion ergab, dass die Acetylierungsdichte im Zellkern etwa dreimal so hoch ist wie in der Restzellfraktion (Abb. 7d). Es ist bekannt, dass Histone stark acetyliert sind. Um festzustellen, wie viel des Acetats im Kern an Histone gebunden war, verglichen wir die Ergebnisse der Kernisolierung mit einem veröffentlichten Protokoll zur Extraktion von saurem Histon (Abb. 7e-g). Beide Ansätze ergaben sehr ähnliche Werte, was darauf hindeutet, dass fast das gesamte gebundene Acetat in der Kernfraktion auf die Histonacetylierung zurückzuführen ist. Somit ist die Histonacetylierung allein für die Hälfte des gesamten zellulären Acetats verantwortlich.

Dieser Ansatz zur Quantifizierung von an Histone gebundenem Acetat kann dazu beitragen, die Auswirkungen der Histonacetylierung in verschiedenen Krebsstudien besser zu verstehen. Um die Nützlichkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, haben wir A549-Zellen mit Panobinostat, einem Pan-Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor, behandelt. Eine kurze, 4-stündige Inkubation mit Panobinostat führte zu einer annähernden Verdoppelung der Menge an histongebundenem Acetat, was zeigt, dass der Umsatz von Histonacetylierung ziemlich schnell ist (Abb. 7h).

Messung von Formiat und anderen kurzkettigen Fettsäuren

Durch Modifizierung des Derivatisierungsmittels lässt sich die Methode leicht an andere kurzkettige Fettsäuren, einschließlich Formiat, anpassen. Durch Kopplung von Formiat mit Benzylalkohol entsteht ein Formiat-Derivat (Benzylformiat), das leicht mit GC-MS analysiert werden kann (siehe ergänzende experimentelle Verfahren Additional file 1: S1). Wir haben bereits erwähnt, dass die GC-MS-Methode für die Acetatanalyse nur 4 Minuten dauert, wobei der Massendetektor zwischen 2,2 und 2,7 Minuten arbeitet. Mit der gleichen Methode können Propionat und Butyrat in Form von Propylpropionat und Propylbutyrat analysiert und quantifiziert werden, wobei die gleiche Probenderivatisierungsmethode wie für Acetat verwendet wird. Durch die Verlängerung der Betriebszeit des Massendetektors von 2,2 auf 4 Minuten konnten wir die Propionat- und Butyrat-Peaks nachweisen, die bei 2,92 bzw. 3,30 Minuten eluierten. Mit den Ionen m/z 75 und 89 für Propionat bzw. Butyrat ist es möglich, diese kurzkettigen Fettsäuren absolut zu quantifizieren.