Um método rápido para quantificação de acetato livre e ligado baseado na alquilação e análise GC-MS

Descrição do método

Desenvolvemos um método robusto e de alto rendimento para quantificação de acetato absoluto em amostras biológicas. O método é baseado na derivatização usando uma reação estabelecida com clorofórmato de metilo (MCF) . Depois de adicionar sequencialmente padrão interno, 1-propanol, piridina e hidróxido de sódio, a reação de derivatização é iniciada pela adição de MCF o mais rápido possível. A modificação química ocorre em condições básicas devido à presença de hidróxido de sódio, enquanto que a piridina mantém o sistema de reação homogêneo, uma vez que o MCF não se dissolve apenas em água (Fig. 1). 1-Propanol é usado como reagente de acoplamento para produzir acetato de propil (Fig. 2). Quando o hidróxido de sódio é adicionado à amostra arrefecida imediatamente antes da adição de MCF, não ocorre hidrólise (ver abaixo). A alquilação do acetato com MCF facilita a modificação rápida do acetato em condições de base aquosa. Neste caso, o intermediário acetato-MCF (I) é atacado pelo álcool (1-propanol), e o intermediário resultante (II) sofre rearranjos adicionais, levando à formação de propilacetato. Tais abordagens de derivatização utilizando a família dos reagentes clorofórmatos são bem descritas. Para quantificar o rendimento da derivatização e subsequente extração em MTBE, comparamos a intensidade do sinal de MS de 1 mM de acetato alquilado ao acetato de propilo com uma concentração equimolar de acetato de propilo obtido comercialmente em MTBE. Com base nisso, encontramos a recuperação em 95,5 ± 1,57 % (arquivo adicional 1: Tabela S1).

A reação de derivatização com MCF é vigorosa e exotérmica, produzindo gases (gás clorídrico, dióxido de carbono) que causam o aumento da pressão dentro do tubo. Portanto, recomendamos seguir as regras gerais de saúde e segurança ao realizar a derivação química, ou seja, usar uma bata de laboratório, luvas e óculos de proteção, enquanto realiza a reação em um capuz de fumaça. Para minimizar o vigor da reação e, portanto, a pressurização, é importante incubar a amostra no gelo (5 min) antes da derivatização. Recomendamos manter a tampa fechada com um dedo durante o vortex e abrir cuidadosamente o tubo depois (ouve-se um som de “estalido”). Alternativamente, o tubo pode ser mantido aberto durante o vortexing, dependendo da preferência do pesquisador (verificamos que o conteúdo do tubo não derrama quando manuseado com cuidado). Em seguida, o acetato derivatizado (acetato de propil) pode ser facilmente extraído em solvente orgânico (MTBE) seguido pela análise GC-MS (Fig. 1).

Outros álcoois primários (por exemplo, metanol e etanol produzindo metil e acetato de etila, respectivamente) também podem ser usados para a derivatização. No entanto, descobrimos que com nossa coluna GC médio-polar (que achamos ser muito adequada para a análise de uma ampla gama de metabólitos), o acetato de propila fornece a forma de pico ideal e o tempo de retenção para análise rápida. O protocolo de preparação da amostra aqui descrito é muito rápido com um tempo total de derivatização de menos de 1 min por amostra. Juntamente com o curto programa GC-MS com um tempo total de execução de 4 min por amostra, isto facilita a análise de alto rendimento. Enquanto os isotopólogos de acetato 12C-acetate, U-13C-acetate, e 2H3-acetate têm tempos de retenção quase idênticos, seus picos podem ser facilmente desconvoluídos usando íons específicos (Fig. 3). Como é geralmente observado na análise de GC de analitos deuterados, a derivada do 2H3-acetato tem um tempo de retenção ligeiramente mais curto devido ao efeito isotópico inverso. Íons m/z 61, 63 e 64 para 12C2-acetate, U-13C2-acetate e 2H3-acetate, respectivamente, foram usados para quantificação absoluta e mostraram resposta linear ótima.

Validação do método

Para avaliar a repetibilidade do preparo da amostra e do procedimento de análise, determinamos o desvio padrão relativo (DER) para o acetato 12C- e U-13C em padrões recém-preparados em 50, 200 e 1000 μM para os respectivos isotopólogos de acetato. O método mostrou excelente repetibilidade com um RSD < 5% para padrões e < 10% para amostras biológicas (arquivo adicional 1: Tabela S2). A faixa linear de quantificação foi avaliada pela análise de padrões serialmente diluídos de 12C e U-13C-acetate dentro da faixa de 2-2000 μM. Não foi possível determinar o limite de detecção (LOD) para o acetato de 12C como um sinal de acetato de fundo de aproximadamente 15 μM esteve sempre presente em nossas amostras, mesmo que apenas reagentes da mais alta pureza tenham sido utilizados. Parece que o acetato é um contaminante traço comum na atmosfera e nos reagentes, bem como no plástico e nos objectos de vidro, semelhante ao que foi observado para os ácidos gordos de cadeia mais longa. Para investigar mais a fundo, procurámos determinar as fontes exactas do acetato de fundo (Ficheiro adicional 1: Figura S1). Ao analisarmos o acetato na sua forma derivatizada de acetato de propilo, o sinal de fundo que comumente observamos pode ser tanto do acetato de propilo diretamente quanto do acetato de fundo que é derivatizado para o acetato de propilo durante o preparo da amostra. Para observar a presença de acetato propil-acetato de fundo, realizamos um experimento tanto em plástico quanto em vidro, onde analisamos o nível de acetato propil-acetato em reagentes usados para a derivatização química. Observamos que o 1-propanol tem o maior teor de acetato de propilo de fundo, mas que ele representa apenas ~10 % do acetato de fundo observado nos blanks do procedimento (PB, ou seja, amostras em branco que foram submetidas a todo o preparo da amostra e ao procedimento de análise de espectros de massa), indicando que o acetato livre, ao invés do acetato de propilo, é o principal contaminante. Infelizmente, todos os reagentes são necessários para a derivatização, por isso não conseguimos determinar qual o reagente que contém mais acetato de fundo. Realizámos, no entanto, todo o procedimento de derivação e extracção em amostras em branco, tanto em tubos de vidro como de plástico. Descobrimos que no plástico, o fundo de acetato resultante é ~50 % maior do que no vidro. Devido à sua conveniência, ainda preferimos trabalhar com tubos plásticos e deixamos essa decisão para o investigador individual.

Independentemente do acetato de fundo, como a resposta provou ser altamente linear, conseguimos subtrair o sinal de fundo (quantificamos o fundo de acetato usando amostras em branco que foram submetidas a todo o preparo da amostra e procedimento de análise de espectros de massa, ou seja, o procedimento em branco), resultando em uma faixa dinâmica linear de 2 a 2000 μM tanto para o acetato de 12C quanto para o acetato de U-13C. O limite de quantificação determinado (LOQ) para o acetato U-13C foi de 0,1 μM. Para manter a contaminação de 12C-acetato a um mínimo, recomendamos preparar reagentes frescos regularmente (semanalmente), e também recomendamos incluir rotineiramente o procedimento em branco. É de notar que sugerimos aos utilizadores que quantifiquem o seu próprio sinal de acetato de fundo, pois depende dos materiais e reagentes utilizados e, portanto, é muito provável que seja específico do laboratório.

Consideramos a nossa abordagem como uma alternativa optimizada a outros métodos de derivatização publicados, para a medição rápida do acetato . Uma abordagem baseada na sililação do acetato com N-tert-Butyldimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) mostrou uma ampla faixa linear para quantificação do acetato (0-3500 μM), alta repetibilidade e baixo desvio padrão relativo (RSD <5 %) . No entanto, não é adequado para o processamento de amostras à base de água, as múltiplas etapas de extração podem levar a altos níveis de acetato de fundo, e o tempo de execução da EM é longo para análise apenas do acetato. Uma abordagem baseada na alquilação utilizando cloroformato de propilo (PCF) é semelhante à nossa em relação à metodologia e desempenho analítico, mas utiliza maiores volumes de reagentes (o que aumenta o risco de altos níveis de fundo de acetato) e maiores tempos de execução de MS, uma vez que não foi otimizado para o acetato especificamente, e não menciona formate . O limite inferior de quantificação publicado foi comparável ao nosso método (15 μM para o método atual versus 16 μM relatado por Zheng et al. ). Zheng et al. relataram uma maior amplitude de resposta linear, ou seja, 16 μM-8 mM. Não testamos além de 2 mM, pois não observamos níveis tão altos em um contexto fisiológico. A repetibilidade relatada foi muito semelhante com 0,54% de DSR (n = 6) relatada por Zheng et al. , e ~0,7% de DSR (n = 3) dependendo da concentração de acetato, relatada no método atual para amostras padrão (desvios padrão relativos resumidos no arquivo adicional 1: Tabela S2). Finalmente, outro método baseado em GC-MS para a análise de ácidos graxos de cadeia curta utilizou 2,4-difluoroanilina e 1,3-diciclocarbodiimida como reagentes de condensação, o que exigiu a etapa de incubação 1-h. Em geral, o trabalho aqui apresentado contribui com o seguinte, além dos métodos já publicados : (1) um método otimizado para o acetato, bem como um método adaptado para medir a formação, (2) uma discussão aprofundada sobre o acetato de fundo, suas fontes potenciais e como lidar com ele de forma prática, e (3) uma abordagem para medir não apenas o acetato livre, mas também o acetato ligado.

O protocolo de preparação da amostra inclui a adição de hidróxido de sódio para facilitar a reação de alquilação. Embora isto aconteça imediatamente antes da reação de derivatização e as amostras sejam resfriadas, isto poderia potencialmente resultar na hidrólise indesejada de biomoléculas acetiladas, levando ao aumento dos níveis de acetato livre. Para testar se isso ocorre, realizamos o preparo da amostra e análise em soluções de 10 mM de ácido N-acetil-l-aspártico (NAA) e N-acetil-l-cisteína (NAC), 1 g/L de BSA, assim como o procedimento em branco. Como a acetilação de aminoácidos é a fonte mais abundante de acetato ligado, e não observamos um aumento significativo no sinal, concluímos que a contribuição do acetato ligado hidrolisado é desprezível (Fig. 4).

Quantificação do acetato em amostras biológicas

A partir do princípio que o nosso método pode quantificar o acetato de forma precisa e reprodutível, queremos determinar a seguir se ele pode reproduzir resultados previamente estabelecidos. Assim, quantificamos o acetato em plasma de oito indivíduos saudáveis. As concentrações de acetato plasmático variaram de 20 a 51 μM com uma concentração mediana de 34,1 ± 9,0 μM (dados não mostrados). Isto se enquadra nos valores previamente publicados de 41,9 ± 15,1 μM e 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

Recentemente, múltiplos estudos identificaram um papel importante da enzima acetil-CoA sintetase 2 (ACSS2) na mediação do crescimento tumoral durante condições hipóxicas e nutricionalmente limitadas . ACSS2 “ativa” acetato para AcCoA para que possa ser usado para reações metabólicas a jusante, incluindo a lipogênese. De fato, a adição de acetato U-13C ao meio de células cancerosas cultivadas revelou aumento da rotulagem de AcCoA lipogênico e, consequentemente, de ácidos graxos, em condições hipóxicas em relação a condições normoxicais . No entanto, até que ponto este aumento da rotulagem é causado por um aumento na absorção de acetato permanece desconhecido. Para resolver este problema, cultivamos células do carcinoma pulmonar A549 em condições normóxicas ou hipóxicas (1 % O2) em meio contendo 500 μM U-13C-acetate, e seguimos sua concentração ao longo do tempo usando nosso novo método (Fig. 5). Consistente com a rotulagem observada de AcCoA lipogênico de U-13C-acetate, foi observado um consumo robusto de U-13C-acetate por células hipóxicas, como evidenciado por uma clara redução no meio. Surpreendentemente, enquanto a rotulagem do AcCoA lipogênico em condições de normóxia é consideravelmente menor que em hipóxia, as células normoxicais também exibiram um consumo ávido de U-13C-acetato. As taxas de absorção de acetato pelas células hipóxicas foram com 2,5 ± 0,1 nmole/h/μL células (PCV) modestamente superiores às das células normoxicas (1,9 ± 0,1 nmole/h/μL células). Esses resultados sugerem que o aumento da marcação do AcCoA lipogênico de U-13C-acetate em hipoxia (~3 vezes mais, dados não mostrados) não pode ser totalmente explicado pelo aumento da absorção de acetato. Em vez disso, o aumento da rotulagem é provavelmente causado em parte por uma queda na produção de AcCoA lipogênico a partir da glicose em células hipóxicas, levando à inflação da contribuição relativa do acetato. Estamos em processo de investigação mais aprofundada.

Concentração livre de acetato nos tecidos e fluidos do rato

Experiências de rastreamento de isótopos in vivo demonstraram a utilização de acetato exógeno por tumores , confirmando um papel crítico do ACSS2 na mediação do crescimento em vários cancros . Entretanto, a disponibilidade de acetato para tumores sólidos e como isso varia entre os órgãos do hospedeiro permanece em grande parte desconhecida. Na tentativa de resolver este problema, analisamos tecidos de múltiplos órgãos do rato (C57BL/6) (coração, rim, fígado, pulmão, pâncreas, baço, timo) bem como plasma e urina (Fig. 6). De todos os órgãos analisados, o fígado continha a maior concentração de acetato livre com uma concentração média de 1,0 ± 0,1 nmole de acetato por mg de tecido (ou seja, ~1 mM), mais do dobro do que qualquer outro tecido. Os nutrientes absorvidos pelo intestino passam primeiro pelo fígado através da veia porta. Altas concentrações milimolares de acetato e outros ácidos gordos de cadeia curta têm sido relatadas como sendo geradas por microbiota intestinal, e isto fornece uma razão para a alta concentração de acetato no fígado. Como a concentração de acetato no fígado é muito maior do que na circulação sistêmica (ou seja, no plasma) e nos pulmões, que contêm o primeiro sistema capilar a ser perfurado pelo sangue após a passagem do fígado, o fígado parece capturar quantidades substanciais de acetato para uso metabólico. O acetato também foi consideravelmente enriquecido no pâncreas e nos rins em relação ao plasma, com concentrações de 0,5 ± 0,04 e 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 e 0,4 mM), respectivamente. O motivo da presença de acetato elevado no pâncreas ainda não foi esclarecido. Uma das funções dos rins é limpar o excesso solúvel em água ou metabolitos tóxicos do sangue e considerando que a concentração de acetato na urina é substancialmente maior do que no plasma, o acetato pode na verdade ser ativamente excretado do corpo como “resíduo” metabólico. Os níveis de acetato foram consideravelmente menores em outros tecidos com o menor valor encontrado no baço em uma concentração semelhante à do plasma. Juntas, estas observações destacam que a disponibilidade de acetato pode variar consideravelmente entre órgãos, o que tem implicações no metabolismo tumoral.

Análise de acetato ligado em frações (sub)celulares e histônicas

AcCoA ocupa um nó central no metabolismo e está envolvido na síntese de biomassa, vias catabólicas e produção de energia. Devido a isso, AcCoA desempenha um papel importante na regulação metabólica. Isto ocorre em parte através da acetilação de biomoléculas, incluindo uma variedade de proteínas . Por exemplo, a acetilação das histonas promove a transcrição de genes e tem sido observada uma correlação entre o grau de acetilação das histonas e a agressividade tumoral. Outras evidências da importância da homeostase de acetilação na progressão do câncer vêm da observação de que a interrupção da dinâmica de acetilação pela inibição das diacetilases (isto é, HDACs, sirtuinas) leva a uma potente indução da morte das células cancerosas . Enquanto vários aspectos da acetilação estão sendo amplamente estudados, muito permanece desconhecido sobre o tamanho absoluto do pool e a rotatividade do acetato ligado a biomoléculas nos vários compartimentos celulares, e muito menos sobre como elas são afetadas por condições relevantes ao tumor. Para resolver isto, combinamos a nossa abordagem com a hidrólise em condições básicas. Aquecendo amostras e incubando-as durante a noite com hidróxido de sódio, hidrólise de ligações ésteres, liberando acetato livre, que pode então ser derivatizado e analisado como antes. A utilização desta abordagem em um extrato celular completo nos permitiu quantificar o acetato total (ligado + livre) em células A549 a 0,38 μmole/mg de proteína celular total. Em seguida perguntamos se seria possível quantificar o acetato ligado em compartimentos celulares separados. Conseguimos uma separação quase completa das frações celulares nucleares e residuais (combinação de citosol e organelas diferentes do núcleo) utilizando um kit comercial de isolamento nuclear (ver seção “Métodos”) (Fig. 7b). Verificamos que o conteúdo de acetato ligado foi aproximadamente igual para as frações nuclear e residual (Fig. 7c). A soma de ambas as frações foi igual a ~80 % da medida de célula inteira, o que é muito provavelmente causado por uma recuperação reduzida durante o fracionamento, mas também pode ser causado pela perda de acetato livre. A expressão do conteúdo de acetato por mg de proteína em cada fração revelou que a densidade de acetilação no núcleo é aproximadamente três vezes maior do que na fração celular residual (Fig. 7d). Sabe-se que os histones são fortemente acetilados, e para determinar quanto do acetato nuclear estava ligado ao histone, comparamos os resultados da abordagem de isolamento nuclear com um protocolo de extração de histone ácido publicado (Fig. 7e-g) . Ambas as abordagens deram valores muito semelhantes, indicando que quase todo o acetato ligado na fração nuclear é devido à acetilação do histone. Assim, a acetilação histórica por si só é responsável pela metade do acetato celular total.

Esta abordagem para quantificar o acetato ligado a histona pode ajudar a compreender melhor o efeito da acetilação da histona em vários estudos relacionados ao câncer. Para demonstrar a utilidade da abordagem, tratamos células A549 com panobinostato, um inibidor da deacetilase pan-histonal (HDAC). Uma incubação curta de 4-h com panobinostato causou uma quase duplicação na quantidade de acetato ligado à história, demonstrando que o turnover da acetilação da história é bastante rápido (Fig. 7h).

Formato de medição e outros ácidos graxos de cadeia curta

Modificando o agente de derivatização, o método é facilmente adaptável a outros ácidos graxos de cadeia curta, incluindo o formate. Acoplando formate com álcool benzílico gera formate derivado (formate benzílico), que pode ser prontamente analisado pelo GC-MS (ver procedimentos experimentais suplementares Arquivo adicional 1: S1). Mencionamos anteriormente que o método GC-MS para análise de acetato leva apenas 4 min, com detector de massa operando entre 2,2 e 2,7 min. O mesmo método é capaz de analisar e quantificar propionato e butirato na forma de propilpropionato e propil-butirato usando o mesmo método de derivatização de amostra configurado para o acetato. Ao estender o tempo de operação do detector de massa de 2,2 para 4 min, fomos capazes de detectar os picos de propionato e butirato eluindo a 2,92 e 3,30 min, respectivamente. Usando iões m/z 75 e 89 para propionato e butirato, respectivamente, é possível quantificar absolutamente estes ácidos gordos de cadeia curta.