Opis metody
Opracowaliśmy solidną i wysokowydajną metodę ilościowego oznaczania octanu w próbkach biologicznych. Metoda oparta jest na derywatyzacji przy użyciu ustalonej reakcji z chloroformanem metylu (MCF). Po sekwencyjnym dodaniu wzorca wewnętrznego, 1-propanolu, pirydyny i wodorotlenku sodu, reakcja derywatyzacji jest inicjowana przez dodanie MCF tak szybko, jak to możliwe. Modyfikacja chemiczna zachodzi w warunkach zasadowych dzięki obecności wodorotlenku sodu, natomiast pirydyna utrzymuje homogeniczność układu reakcyjnego, ponieważ MCF nie rozpuszcza się w samej wodzie (Rys. 1). Jako odczynnika sprzęgającego używa się 1-Propanolu w celu otrzymania octanu propylu (Rys. 2). Gdy do schłodzonej próbki bezpośrednio przed dodaniem MCF doda się wodorotlenek sodu, hydroliza nie zachodzi (patrz niżej). Alkilacja octanu za pomocą MCF ułatwia szybką dalszą modyfikację octanu w warunkach wodnych. W tym przypadku, pośredni acetat-MCF (I) jest atakowany przez alkohol (1-propanol), a powstały pośredni (II) ulega dalszym rearanżacjom, prowadzącym do powstania octanu propylu. Takie metody derywatyzacji z wykorzystaniem odczynników z rodziny chloroformianów są dobrze opisane. Aby określić wydajność derywatyzacji i późniejszej ekstrakcji do MTBE, porównaliśmy intensywność sygnału MS 1 mM octanu alkilowanego do octanu propylu z równomolowym stężeniem komercyjnie otrzymanego octanu propylu w MTBE. Na tej podstawie stwierdziliśmy, że odzysk wynosi 95,5 ± 1,57 % (Dodatkowy plik 1: Tabela S1).
Schematyczne przedstawienie przebiegu pracy do szybkiego oznaczania ilościowego octanu. Podzielna część próbki była mieszana z wewnętrznym standardem 2H3-octanem sodu, pirydyną (Py) i 1-propanolem (1-PrOH), a następnie derywatyzowana przez dodanie wodorotlenku sodu i chloroformianu metylu (MCF). Po derywatyzacji, próbkę mieszano z eterem metylowo-tert-butylowym (MTBE) i worteksowano w celu wyekstrahowania pochodnej octanowej (octanu propylu). Następnie próbkę odwirowano, a górną warstwę MTBE przeniesiono do fiolki GC w celu dalszej analizy GC-MS
Chemiczna derywatyzacja octanu. Używając chloroformianu metylu (MCF), grupa karboksylowa octanu jest przekształcana w ester propylowy: octan najpierw atakuje MCF, a powstały w ten sposób półprodukt (I) jest następnie atakowany przez alkohol (1-propanol), generując drugi półprodukt (II), który ulega dalszym rearanżacjom tworząc octan propylu
Reakcja derywatyzacji z MCF jest energiczna i egzotermiczna, wytwarza gazy (gaz solny, dwutlenek węgla), które powodują wzrost ciśnienia w probówce. Dlatego zalecamy przestrzeganie ogólnych zasad BHP podczas przeprowadzania derywatyzacji chemicznej, tj. noszenie fartucha laboratoryjnego, rękawic i okularów ochronnych oraz przeprowadzanie reakcji w dygestorium. Aby zminimalizować gwałtowność reakcji i tym samym ciśnienie, ważne jest, aby przed derywatyzacją inkubować próbkę na lodzie (5 min). Zalecamy trzymanie zamkniętej pokrywki jednym palcem podczas worteksowania, a następnie ostrożne otwarcie probówki (może być słyszalny dźwięk „popping”). Alternatywnie, probówka może być otwarta podczas worteksowania, w zależności od preferencji badacza (uważamy, że zawartość probówki nie rozlewa się przy ostrożnym obchodzeniu się z nią). Następnie, derywatyzowany octan (octan propylu) może być łatwo ekstrahowany do rozpuszczalnika organicznego (MTBE), po którym następuje analiza GC-MS (Rys. 1).
Inne alkohole pierwszorzędowe (np. metanol i etanol wytwarzające odpowiednio octan metylu i etylu) również mogą być użyte do derywatyzacji. Jednakże stwierdziliśmy, że w przypadku naszej średnio-polarnej kolumny GC (którą uważamy za bardzo odpowiednią do analizy szerokiego zakresu metabolitów), octan propylu zapewnia optymalny kształt piku i czas retencji dla szybkiej analizy. Opisany tutaj protokół przygotowania próbki jest bardzo szybki, a całkowity czas derywatyzacji wynosi mniej niż 1 min na próbkę. W połączeniu z krótkim programem GC-MS o całkowitym czasie trwania 4 min na próbkę, ułatwia to analizę o wysokiej wydajności. Podczas gdy izotopologi octanowe 12C-octan, U-13C-octan i 2H3-octan mają prawie identyczne czasy retencji, ich piki mogą być łatwo zdekonwolutowane przy użyciu specyficznych jonów (Rys. 3). Jak to zwykle obserwuje się w analizie GC deuterowanych analitów, pochodna 2H3-octanu ma nieco krótszy czas retencji ze względu na odwrotny efekt izotopowy. Jony m/z 61, 63 i 64 dla 12C2-octanu, U-13C2-octanu i 2H3-octanu, odpowiednio, zostały użyte do bezwzględnej kwantyfikacji i wykazały optymalną odpowiedź liniową.
Chromatogram GC dla pochodnej octanowej (octan propylu). a Chromatogram jonów całkowitych. b-d Chromatogramy wyekstrahowanych jonów odpowiednio dla 12C-, U-13C-, i 2H3-octanu. Jony m/z 61, 63, i 64 (struktura jonów jest wskazana) zostały użyte do bezwzględnej kwantyfikacji
Weryfikacja metody
Aby ocenić powtarzalność procedury przygotowania próbki i analizy, określiliśmy względne odchylenie standardowe (RSD) dla 12C- i U-13C-octanu w świeżo przygotowanych standardach przy 50, 200, i 1000 μM dla odpowiednich izotopologów octanu. Metoda wykazała doskonałą powtarzalność z RSD < 5 % dla standardów i < 10 % dla próbek biologicznych (plik dodatkowy 1: Tabela S2). Zakres liniowy kwantyfikacji został oceniony przez analizę seryjnie rozcieńczonych standardów zarówno 12C-, jak i U-13C-octanu w zakresie 2-2000 μM. Nie byliśmy w stanie określić granicy wykrywalności (LOD) dla 12C-octanu, ponieważ sygnał tła octanowego o wartości około 15 μM był zawsze obecny w naszych próbkach, nawet jeśli używaliśmy tylko odczynników o najwyższej czystości. Wydaje się, że octan jest powszechnym zanieczyszczeniem śladowym w atmosferze i odczynnikach, jak również w plastikowych i szklanych naczyniach, podobnie do tego, co zostało zaobserwowane dla kwasów tłuszczowych o dłuższym łańcuchu. Aby zbadać to dalej, staraliśmy się określić dokładne źródła octanu tła (Dodatkowy plik 1: Rysunek S1). Ponieważ analizujemy octan w jego pochodnej formie octanu propylu, sygnał tła, który powszechnie obserwujemy, może pochodzić albo bezpośrednio z octanu propylu, albo z octanu tła, który jest pochodną octanu propylu podczas przygotowywania próbki. Aby sprawdzić obecność propyl-octanu w tle, przeprowadziliśmy eksperyment zarówno w plastikowych jak i szklanych naczyniach, gdzie analizowaliśmy poziom propyl-octanu w odczynnikach używanych do derywatyzacji chemicznej. Zaobserwowaliśmy, że 1-propanol ma najwyższy poziom octanu propylu w tle, ale stanowi on tylko ~10% octanu tła obserwowanego w ślepych próbkach procedury (PB, tj. ślepych próbkach, które zostały poddane całej procedurze przygotowania próbki i analizy metodą spektroskopii masowej), co wskazuje, że wolny octan, a nie octan propylu jest głównym zanieczyszczeniem. Niestety, wszystkie odczynniki są potrzebne do derywatyzacji, więc nie jesteśmy w stanie określić, który odczynnik zawiera najwięcej octanu w tle. Przeprowadziliśmy jednak całą procedurę derywatyzacji i ekstrakcji na próbkach zerowych zarówno w szklanych, jak i plastikowych probówkach. Stwierdziliśmy, że w plastikowych, wynikowe tło octanowe jest o ~50% wyższe niż w szklanych. Ze względu na wygodę, nadal wolimy pracować z plastikowymi probówkami i pozostawiamy tę decyzję indywidualnemu badaczowi.
Niezależnie od octanowego tła, ponieważ odpowiedź okazała się wysoce liniowa, byliśmy w stanie odjąć sygnał tła (kwantyfikujemy tło octanowe przy użyciu ślepych próbek, które zostały poddane całej procedurze przygotowania próbki i analizy metodą spektroskopii masowej, tj. ślepych procedur), co skutkowało liniowym zakresem dynamicznym od 2 do 2000 μM zarówno dla 12C-octanu, jak i U-13C-octanu. Wyznaczona granica oznaczalności (LOQ) dla octanu U-13C wynosiła 0,1 μM. Aby utrzymać zanieczyszczenie 12C-octanem na minimalnym poziomie, zalecamy regularne (cotygodniowe) przygotowywanie świeżych odczynników, a także rutynowe wykonywanie ślepych prób. Zwracamy uwagę, że sugerujemy użytkownikom, aby sami określali ilościowo sygnał tła octanu, ponieważ zależy on od użytych materiałów i odczynników, a zatem jest bardzo prawdopodobne, że jest specyficzny dla danego laboratorium.
Uważamy, że nasze podejście jest zoptymalizowaną alternatywą dla innych opublikowanych metod derywatyzacji, do szybkiego pomiaru octanu. Podejście oparte na sililowaniu octanu za pomocą N-tert-butyldimetylosililo-N-metylo-trifluoroacetamidu (MTBSTFA) wykazało szeroki zakres liniowy dla kwantyfikacji octanu (0-3500 μM), wysoką powtarzalność i niskie względne odchylenie standardowe (RSD < 5 %). Nie jest ona jednak odpowiednia do przetwarzania próbek na bazie wody, wielokrotne etapy ekstrakcji mogą prowadzić do wysokiego poziomu octanów w tle, a czas przebiegu MS jest długi w przypadku analizy samych octanów. Podejście oparte na alkilacji przy użyciu chloroformianu propylu (PCF) jest podobne do naszego pod względem metodologii i wydajności analitycznej, ale wykorzystuje większe objętości odczynników (co zwiększa ryzyko wysokich poziomów tła octanu) i dłuższe czasy pracy MS, ponieważ nie zostało zoptymalizowane specjalnie dla octanu i nie wymienia mrówczanu. Opublikowana dolna granica oznaczalności była porównywalna z naszą metodą (15 μM dla obecnej metody w porównaniu z 16 μM podaną przez Zheng et al.) Zheng i wsp. podali szerszy zakres odpowiedzi liniowej, tj. 16 μM-8 mM. Nie testowaliśmy powyżej 2 mM, ponieważ nie zaobserwowaliśmy tak wysokich poziomów w kontekście fizjologicznym. Zgłoszona powtarzalność była bardzo podobna do 0,54 % RSD (n = 6) zgłoszonej przez Zheng et al. i ~0,7 % RSD (n = 3) w zależności od stężenia octanu, zgłoszonej w obecnej metodzie dla standardowych próbek (względne odchylenia standardowe podsumowane w pliku dodatkowym 1: Tabela S2). Wreszcie, inna metoda oparta na GC-MS do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych wykorzystywała 2,4-difluoroanilinę i 1,3-dicyklokarbodiimid jako odczynniki kondensacyjne, co wymagało 1-godzinnego etapu inkubacji. Ogólnie rzecz biorąc, praca przedstawiona tutaj wnosi następujące elementy, oprócz już opublikowanych metod: (1) zoptymalizowana metoda dla octanu, jak również dostosowana metoda do pomiaru mrówczanu, (2) dogłębna dyskusja na temat octanu w tle, jego potencjalnych źródeł i jak sobie z nim poradzić w praktyczny sposób, oraz (3) podejście do pomiaru nie tylko wolnego octanu, ale także związanego octanu.
Protokół przygotowania próbki obejmuje dodanie wodorotlenku sodu w celu ułatwienia reakcji alkilacji. Chociaż dzieje się to bezpośrednio przed reakcją derywatyzacji, a próbki są schładzane, może to potencjalnie spowodować niepożądaną hydrolizę acetylowanych biomolekuł, prowadząc do zwiększenia poziomu wolnego octanu. Aby sprawdzić, czy tak się dzieje, przeprowadziliśmy przygotowanie próbek i analizę 10 mM roztworów kwasu N-acetylo-l-asparaginowego (NAA) i N-acetylo-l-cysteiny (NAC), 1 g/L BSA, jak również ślepych prób. Ponieważ acetylacja aminokwasów jest najbardziej obfitym źródłem związanego octanu i nie zaobserwowaliśmy znaczącego wzrostu sygnału, wnioskujemy, że wkład z hydrolizowanego związanego octanu jest nieistotny (ryc. 4).
Wpływ wodorotlenku sodu dodanego podczas derywatyzacji na hydrolizę związanego octanu. Wykres wiskera dla względnego tła octanowego pochodzącego z procedury ślepej i N-acetylowanych biomolekuł-BSA, N-acetylo-l-asparaginianu (NAA) i N-acetylo-l-cysteiny (NAC). Podczas procedury derywatyzacji nie zachodzi znacząca deacetylacja. Dane są średnimi ± SD z n = 5 dla wszystkich warunków. Linia pozioma i kropka na wykresie pudełkowym odpowiadają odpowiednio wartościom mediany i wartościom odstającym. Górny i dolny koniec pionowej linii na wykresie pudełkowym to odpowiednio maksymalna i minimalna ustalona wartość
Ilościowe oznaczanie octanu w próbkach biologicznych
Ustaliwszy, że nasza metoda może dokładnie i powtarzalnie oznaczać ilościowo octan, chcieliśmy następnie określić, czy może ona odtworzyć wcześniej ustalone wyniki. Dlatego też oznaczyliśmy ilościowo octan w osoczu ośmiu zdrowych osób. Stężenia octanu w osoczu wahały się od 20 do 51 μM z medianą stężenia 34.1 ± 9.0 μM (dane nie pokazane). Mieści się to w poprzednio opublikowanych wartościach 41,9 ± 15,1 μM i 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).
Ostatnio wiele badań zidentyfikowało ważną rolę enzymu syntetazy acetylo-CoA 2 (ACSS2) w pośredniczeniu we wzroście guza podczas warunków niedotlenienia i ograniczenia składników odżywczych . ACSS2 „aktywuje” octan do AcCoA, aby mógł być użyty do dalszych reakcji metabolicznych, w tym lipogenezy. Rzeczywiście, dodanie U-13C-octanu do pożywki hodowanych komórek nowotworowych wykazało zwiększone znakowanie lipogennego AcCoA, a w konsekwencji kwasów tłuszczowych, w warunkach hipoksji w stosunku do normoksji. Jednakże, w jakim stopniu to zwiększone znakowanie jest spowodowane wzrostem wychwytu octanu pozostaje nieznane. Aby rozwiązać ten problem, hodowaliśmy komórki raka płuc A549 w warunkach normoksycznych lub hipoksycznych (1% O2) w pożywce zawierającej 500 μM U-13C-octanu i śledziliśmy jego stężenie w czasie przy użyciu naszej nowej metody (Rys. 5). Zgodnie z obserwowanym znakowaniem lipogennego AcCoA z U-13C-octanu, zaobserwowano silne zużycie U-13C-octanu przez komórki w warunkach hipoksji, o czym świadczy wyraźna redukcja w medium. Co zaskakujące, podczas gdy znakowanie lipogennego AcCoA w warunkach normoksji jest znacznie mniejsze niż w hipoksji, komórki normoksyczne również wykazywały duże zużycie octanu U-13C. Tempo wychwytu octanu dla komórek hipoksycznych było 2.5 ± 0.1 nmole/h/μL komórek (PCV) nieznacznie wyższe niż dla komórek normoksycznych (1.9 ± 0.1 nmole/h/μL komórek). Wyniki te sugerują, że zwiększone znakowanie lipogennego AcCoA z octanu U-13C w niedotlenieniu (~3-krotny wzrost, dane nie pokazane) nie może być w pełni wyjaśnione przez zwiększony wychwyt octanu. Zamiast tego, zwiększone znakowanie jest prawdopodobnie częściowo spowodowane spadkiem produkcji lipogennego AcCoA z glukozy w niedotlenionych komórkach, co prowadzi do inflacji względnego wkładu z octanu. Jesteśmy w trakcie dalszego badania tej kwestii.
Pobór octanu przez normoksyczne i hipoksyczne komórki nowotworowe. Profil stężeń U-13C-octanu w medium komórek A549 w warunkach a normoksycznych i b hipoksycznych (1% O2) oraz c wskaźniki wychwytu obliczone na podstawie (a, b). Values are mean ± SD (n = 3)
Free acetate concentration in mouse tissues and fluids
In vivo isotope tracing experiments demonstrated the utilization of exogenous acetate by tumors , confirming a critical role for ACSS2 in mediating growth in various cancers . Jednakże, dostępność octanu dla guzów litych i jak to się różni między organami gospodarza pozostaje w dużej mierze nieznana. Próbując rozwiązać ten problem, analizowaliśmy tkanki z wielu narządów myszy (C57BL/6) (serce, nerki, wątroba, płuca, trzustka, śledziona, grasica), jak również osocze i mocz (ryc. 6). Spośród wszystkich analizowanych narządów wątroba zawierała najwyższe stężenie wolnego octanu ze średnim stężeniem 1,0 ± 0,1 nmola octanu na mg tkanki (tj. ~1 mM), ponad dwukrotnie więcej niż jakakolwiek inna tkanka. Składniki odżywcze wchłonięte przez jelito przechodzą najpierw przez wątrobę za pośrednictwem żyły wrotnej. Wysokie milimolarne stężenia octanu i innych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych są generowane przez mikrobiotę jelitową, co uzasadnia wysokie stężenie octanu w wątrobie. Ponieważ stężenie octanu w wątrobie jest znacznie wyższe niż w krążeniu systemowym (tj. osoczu) i płucach, które zawierają pierwszy system kapilarny perfundowany przez krew po przejściu wątroby, wydaje się, że wątroba przechwytuje znaczne ilości octanu do wykorzystania metabolicznego. Octan był również znacznie wzbogacony w trzustce i nerkach w stosunku do osocza, ze stężeniem 0,5 ± 0,04 i 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 i 0,4 mM), odpowiednio. Przyczyna wysokiej zawartości octanu w trzustce pozostaje do wyjaśnienia. Jedną z funkcji nerek jest usuwanie z krwi rozpuszczalnych w wodzie nadmiarów lub toksycznych metabolitów, a biorąc pod uwagę, że stężenie octanu w moczu jest znacznie wyższe niż w osoczu, octan może być faktycznie aktywnie wydalany z organizmu jako „odpad” metaboliczny. Poziom octanu był znacznie niższy w innych tkankach, przy czym najniższą wartość stwierdzono w śledzionie w stężeniu zbliżonym do osocza. Łącznie, obserwacje te podkreślają, że dostępność octanu może się znacznie różnić między organami, co ma implikacje dla metabolizmu guza.
Stężenie wolnego octanu w próbkach myszy. Wykresy wiskerów dla (a) serca, nerek, wątroby, płuc, trzustki, śledziony i grasicy, jak również dla (b) osocza i moczu uzyskano od myszy C57BL/6. Zamrożone tkanki zostały rozdrobnione, a podwielokrotności tkanek zostały użyte do kwantyfikacji wolnego octanu. Dane są średnimi ± SD próbek tkanek (n = 7) i płynów (n = 5). Linia pozioma i kropka na wykresie pudełkowym odpowiadają odpowiednio wartościom mediany i wartościom odstającym. Górny i dolny koniec pionowej linii wykresu pudełkowego to odpowiednio maksymalna i minimalna oznaczona wartość. Górna i dolna linia pozioma pola to odpowiednio 3. i 1. kwartyl
Analiza związanego octanu we frakcjach (pod)komórkowych i histonowych
AcCoA zajmuje centralny węzeł w metabolizmie i jest zaangażowany w syntezę biomasy, szlaki kataboliczne i produkcję energii. Z tego powodu, AcCoA odgrywa ważną rolę w regulacji metabolizmu. Dzieje się to częściowo poprzez acetylację biomolekuł, w tym różnych białek. Na przykład, acetylacja histonów promuje transkrypcję genów i zaobserwowano korelację pomiędzy stopniem acetylacji histonów a agresywnością nowotworów. Dalsze dowody na znaczenie homeostazy acetylacji w progresji nowotworu pochodzą z obserwacji, że zaburzenie dynamiki acetylacji poprzez zahamowanie deacetylaz (tj. HDAC, sirtuiny) prowadzi do silnej indukcji śmierci komórek nowotworowych. Podczas gdy wiele aspektów acetylacji jest szeroko badanych, wiele pozostaje nieznanych na temat absolutnej wielkości puli i obrotu octanu związanego z biocząsteczkami w różnych przedziałach komórkowych, nie mówiąc już o tym, jak wpływają na nie warunki związane z nowotworem. Aby rozwiązać ten problem, połączyliśmy nasze podejście z hydrolizą w warunkach podstawowych. Podgrzewając próbki i inkubując je przez noc z wodorotlenkiem sodu, wiązania estrowe hydrolizują, uwalniając wolny octan, który może być następnie derywatyzowany i analizowany jak poprzednio. Zastosowanie tego podejścia do ekstraktu całokomórkowego pozwoliło nam na ilościowe oznaczenie całkowitego (związanego + wolnego) octanu w komórkach A549 na poziomie 0.38 μmole/mg całkowitego białka komórkowego. Następnie zapytaliśmy, czy możliwe będzie oznaczenie ilościowe związanego octanu w oddzielnych przedziałach komórkowych. Uzyskaliśmy prawie całkowite oddzielenie frakcji jądrowej i reszt komórkowych (połączenie cytozolu i organelli innych niż jądro) przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji jądrowej (patrz sekcja „Metody”) (Rys. 7b). Stwierdziliśmy, że zawartość związanego octanu była w przybliżeniu równa dla frakcji jądrowej i resztkowej (Rys. 7c). Suma obu frakcji równała się ~80% pomiaru dla całej komórki, co jest najprawdopodobniej spowodowane zmniejszonym odzyskiem podczas frakcjonowania, ale może być również spowodowane utratą wolnego octanu. Wyrażenie zawartości octanu na mg białka w każdej frakcji ujawniło, że gęstość acetylacji w jądrze jest około trzykrotnie wyższa niż we frakcji komórek resztkowych (Rys. 7d). Wiadomo, że histony są silnie acetylowane i aby określić, ile octanu jądrowego było związanego z histonami, porównaliśmy wyniki metody izolacji jądrowej z opublikowanym protokołem ekstrakcji kwaśnych histonów (Rys. 7e-g). Oba podejścia dały bardzo podobne wartości, wskazując, że prawie cały związany octan we frakcji jądrowej jest spowodowany acetylacją histonów. Zatem sama acetylacja histonów odpowiada za połowę całkowitego octanu komórkowego.
Kwantyfikacja (pod)komórkowego całkowitego octanu. a Schemat wskazujący, jakie frakcje były analizowane. b Western-blot pokazujący jakość rozdziału frakcji jądrowej (TBP) i reszt komórkowych (tubulina). c Całkowity octan w ekstrakcie całokomórkowym lub frakcji jądrowej i reszt komórkowych. e Histony (czerwone sfery) są silnie acetylowane, a acetylacja kontroluje ekspresję genów. f Western blot histonów po ekstrakcji kwasowej, barwionych Ponceau S. g Ilość całkowitego octanu z histonów ekstrahowanych kwasem lub frakcji jądrowej. h Wpływ inhibitora HDAC, panobinostatu, na poziom octanu związanego z histonami. Values are mean ± SD (n = 3)
This approach towards quantifying histone bound acetate may help to better understand the effect of histone acetylation in various cancer-related studies. Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, potraktowaliśmy komórki A549 panobinostatem, inhibitorem deacetylazy histonowej (HDAC). Krótka, 4-godzinna inkubacja z panobinostatem spowodowała prawie dwukrotny wzrost ilości octanu związanego z histonami, wykazując, że obrót acetylacji histonów jest dość szybki (ryc. 7h).
Pomiar mrówczanu i innych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych
Modyfikując czynnik derywatyzujący, metodę można łatwo dostosować do innych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, w tym mrówczanu. Sprzęganie mrówczanu z alkoholem benzylowym generuje pochodną mrówczanu (mrówczan benzylu), która może być łatwo analizowana przez GC-MS (patrz uzupełniające procedury eksperymentalne Dodatkowy plik 1: S1). Wspomnieliśmy wcześniej, że metoda GC-MS do analizy octanu trwa tylko 4 min, z detektorem mas pracującym od 2.2 do 2.7 min. Ta sama metoda jest w stanie analizować i oznaczać ilościowo propionian i maślan w postaci propylopropionianu i propylomaślanu przy zastosowaniu tego samego zestawu metod derywatyzacji próbki jak dla octanu. Poprzez wydłużenie czasu pracy detektora mas z 2.2 do 4 min, byliśmy w stanie wykryć piki propionianu i maślanu eluujące odpowiednio w 2.92 i 3.30 min. Używając jonów m/z 75 i 89 dla propionianu i maślanu, odpowiednio, możliwe jest całkowite oznaczenie ilościowe tych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.