Attenuazione della virulenza
Engineering dei batteri per minimizzare la loro virulenza contro il sistema immunitario dell’ospite è anche essenziale46,47. Va notato che alcuni fattori di virulenza batterica possono essere responsabili della loro intrinseca attività antitumorale. Pertanto, l’attenuazione deve essere ottenuta senza ablazione della loro attività antitumorale. Per esempio, negli agenti patogeni umani, ceppi fatalmente tossici sono stati convertiti in ceppi ampiamente sicuri attraverso la delezione dei principali geni di virulenza2,10,21. VNP20009, un ceppo attenuato di S. Typhimurium, è stato generato tramite la delezione dei geni msbB e purI; questo ceppo è stato ampiamente studiato in topi portatori di tumore e mostra una promettente specificità di bersaglio tumorale ed effetti inibitori del tumore28,48,49,50. La delezione di msbB nel genere Salmonella si traduce nella miristoilazione della componente lipidica A di LPS, che si traduce in una significativa riduzione dell’induzione di TNF guidata da LPS e può ridurre il rischio di shock settico51. VNP20009 è stato successivamente testato in studi di fase I in pazienti umani affetti da cancro51,52,53,54. Deludentemente, VNP20009 mancava di specificità tumorale e non aveva un chiaro valore nel trattamento del tumore nei pazienti52,54,55. Questo fallimento potrebbe essere attribuito al lipide penta-acilato A prodotto da VNP20009, che è un antagonista TLR456. Per modificare la struttura del LPS per sostenere l’attività antitumorale, sono stati generati ceppi mutanti di Salmonella che producono un lipide A esa-acilato omologo, che ha un’alta affinità per TLR4, attraverso la delezione dei geni pagP, pagL e lpxR47,57,58. Queste mutazioni non hanno influenzato la virulenza nel background mutante msbB59. Le mutazioni in rfaG e rfaD provocano la produzione di LPS troncato, che risulta in una tossicità attenuata e in una specificità tumorale; tuttavia, anche gli effetti antitumorali di questi batteri sono diminuiti. L’integrazione cromosomica dei geni biosintetici LPS nel locus araBAD ha superato queste limitazioni e il ceppo mutante ha mostrato una virulenza attenuata ed effetti terapeutici60.
Un altro ceppo di Salmonella non tossico è stato ingegnerizzato downregolando l’espressione dei geni associati all’endotossina o inibendo la loro attività funzionale. I ceppi di Salmonella relA- e spoT-mutanti difettosi nella sintesi di ppGpp, una molecola di segnalazione coinvolta nell’espressione del gene della tossina, hanno mostrato una tossicità trascurabile. Il valore LD50 del ceppo ΔppGpp era aumentato fino a 105-106 volte rispetto a quelli dei ceppi wild-type61. Il ceppo ΔppGpp aveva un’eccellente attività antitumorale attraverso la sua capacità di attivare l’inflammasoma (NLRP3, IPAF) e indurre l’espressione di diverse citochine proinfiammatorie (IL-1β, IL-18, e TNF-α)21. La delezione dei geni phoP e phoQ non ha influenzato l’attività antitumorale di Salmonella, mentre le delezioni hanno ridotto la sua virulenza nei tessuti normali62. I ceppi con queste mutazioni sono stati utilizzati per produrre un eccellente vaccino e recentemente sono stati usati come sistema di consegna per le terapie tumorali63,64,65,66,67. La somministrazione orale di un ceppo mutante di S. Typhimurium carente nella sintesi del sistema di trasporto dello zinco ZnuABC può indurre un’efficace risposta immunitaria che protegge i topi dalle infezioni intestinali68. Le mutazioni nei geni che codificano l’adenina metilasi del DNA, l’adenilato ciclasi e la proteina recettore dell’adenosina monofosfato ciclico, che sono coinvolti in varie vie di regolazione genica patogena, potrebbero ridurre la tossicità batterica in vivo69. La delezione del gene gmd in Salmonella ha inibito la formazione di biofilm e ha indotto una risposta immunitaria in una fase iniziale dell’infezione28,57. Inoltre, la delezione di htrA, STM3120 e slyA ha ridotto significativamente la sopravvivenza batterica nei macrofagi e gli effetti anticancro dei batteri70. La delezione di geni coinvolti nell’invasione cellulare può attenuare la citotossicità di Listeria monocytogenes. La delezione di Hly causa difetti nel rilascio del fagolisosoma52,71,72. I ceppi mutanti di L. monocytogenes privi delle sequenze actA o ActA PEST-like mancano anche della capacità di diffusione intercellulare73,74, e i ceppi mutanti privi di inlA e inlB sono difettosi nell’invasione75,76.
L’introduzione di mutazioni specifiche dipendenti dai nutrienti nei batteri è un ulteriore approccio per migliorare la proliferazione tumorale specifica con attenuazione della virulenza. Il ceppo A1-R di Salmonella, che è auxotrofo per la leucina e l’arginina, colonizza preferenzialmente i tumori, mostra effetti antitumorali e aumenta la suscettibilità dei tumori alla chemioterapia22,77,78,79. Un ceppo di L. monocytogenes è stato ingegnerizzato per essere auxotrofico per il componente della parete cellulare d-alanina attraverso l’inattivazione del locus dal/dat. Questo ceppo mutante era altamente attenuato e poteva indurre linfociti T citotossici22,80. I ceppi di Salmonella SL3261 e SL7207, che portano una delezione aroA, e BRD509, che è un ceppo mutante doppio aroA/aroD che è auxotrofo per gli aminoacidi aromatici, sono altamente attenuati e non si disperdono liberamente nell’ospite29,57,81,82,83,84,85. Un altro ceppo di S. Typhimurium, YB1, che è stato derivato da SL7207 mettendo il gene essenziale asd sotto il controllo di un promotore indotto dall’ipossia, non potrebbe sopravvivere nei tessuti normali senza un apporto esogeno di acido diaminopimelico, anche se potrebbe ancora colonizzare i tumori ipossici; quindi, questo ceppo causa danni ridotti ai tessuti normali pur mantenendo la sua capacità di colpire i tumori21,47,86,87. Inoltre, la delezione dei geni purI e purD ha portato alla necessità di adenina esogena, che ha aumentato la capacità dei batteri di proliferare in modo efficiente in regioni ricche di purine, come il tessuto tumorale2,88. I ceppi batterici attenuati utilizzati per la terapia del cancro sono elencati nella Tabella 1.
Miglioramento del targeting tumorale
Gli approcci ingegneristici utilizzati per migliorare il targeting tumorale batterico possono anche aumentare sia la sicurezza che l’efficacia antitumorale. In un approccio per raggiungere questi risultati, il ceppo ppGpp-deficiente SHJ2037 è stato geneticamente ingegnerizzato per visualizzare i ligandi tumore-specifici sulla superficie cellulare. Un peptide Arg-Gly-Asp che si lega all’integrina αvβ3 è stato fuso alla proteina A della membrana esterna per guidare la sua espressione sulla superficie batterica89. Il ceppo risultante ha mostrato una maggiore specificità tumorale e una marcata attività antitumorale nelle cellule di cancro al seno MDA-MB-231 e negli xenotrapianti di melanoma MDA-MB-435 che sovraesprimono l’integrina αvβ3. I batteri sono stati anche ingegnerizzati per colpire antigeni associati al tumore, come l’antigene carcinoembrionale o l’antigene CD20 associato al linfoma. Questi ceppi avevano effetti antitumorali efficaci e riducevano l’accumulo non specifico di batteri nel fegato e nella milza90,91. Sfruttando il legame biotina-streptavidina, è stato costruito un ceppo di L. monocytogenes in cui le cellule erano rivestite da nanoparticelle caricate con plasmidi che esprimevano un gene della bioluminescenza. Questo ceppo, chiamato microrobot, consegnava molecole di acido nucleico funzionali ai tumori solidi e poteva essere rintracciato tramite imaging a bioluminescenza60,92,93. Un’alternativa intrigante che può aumentare la selettività del tumore è quella di visualizzare le adesine sintetiche (SA) sulla superficie di E. coli. Le SAs hanno una struttura modulare che consiste in un dominio β stabile richiesto per l’ancoraggio alla membrana esterna e domini immunoglobulinici esposti in superficie con alta affinità e specificità che possono essere selezionati da grandi librerie94. I ceppi probiotici hanno mostrato una migliore specificità tumorale aumentando la capacità di iniezione dei batteri senza attenuare le loro proprietà intrinseche95,96,97,98,99. Le cellule di E. coli Symbioflor-2 probiotiche sono state rimosse molto rapidamente dalla milza e dal fegato e sono sopravvissute solo in un tumore, indicando un efficiente targeting tumorale. I topi infettati con un ceppo probiotico di Salmonella hanno tollerato un grande carico batterico senza alcun sintomo patologico; tuttavia, sono necessari miglioramenti nel sistema di consegna del carico utile a causa dell’efficacia terapeutica inferiore del ceppo, nonostante la sua eccellente sicurezza in vivo57.
Strategie di espressione dei farmaci
La maggior parte dei carichi utili consegnati dai batteri che hanno come bersaglio il tumore sono tossici sia per le cellule tumorali che per quelle normali; pertanto, è preferibile uno stretto controllo della loro produzione rispetto all’espressione costitutiva. L’attivazione precisa dell’espressione del carico utile può massimizzare i suoi effetti terapeutici minimizzando la tossicità sistemica. Un sistema di espressione genica controllabile può essere teoricamente costruito inserendo una specifica sequenza di promotore a monte di un gene codificante il farmaco, conferendo così il controllo trascrizionale tramite segnali esterni. Un tale sistema permette di gestire la tempistica e la localizzazione della produzione del farmaco in vivo. Le strategie per questo tipo di regolazione genica, o innesco, appartengono per lo più alle seguenti tre categorie: innesco interno, autoinnesco (quorum sensing-QS) e innesco esterno100.
A differenza del tessuto normale, le TME hanno proprietà speciali, tra cui ipossia, acidosi e necrosi, che i batteri possono percepire e utilizzare per migliorare la specificità del tumore101. Per esempio, i promotori ipossia-inducibili come quelli di HIP-1 e pepT sono attivati dalla riduzione di fumarato e nitrato nell’ambiente ipossico all’interno del tessuto tumorale102,103,104. Questo sistema di espressione ipossia-inducibile è stato progettato per funzionare solo in condizioni anaerobiche per l’espressione di geni essenziali come asd105. Flentie et al. hanno identificato cinque sequenze di promotori specificamente attivati dai microambienti acidi associati alle cellule tumorali in vitro e ai tumori in vivo. I promotori specifici per l’acidosi sono stati identificati usando un promotore transposon reporter senza promotore progettato su misura che codifica la luciferasi batterica per vagliare una libreria di 7400 mutanti di inserimento transposon di Salmonella indipendenti in cocoltura con cellule di melanoma o carcinoma del colon. Un ceppo attenuato di Salmonella che esprime la tossina Shiga sotto il controllo di un promotore indotto dal basso pH ha mostrato una forte selettività tumorale e attività antitumorale106. Un sensore di glucosio è stato ingegnerizzato in E. coli attraverso la fusione sintetica del chemorecettore Trg con l’osmosensore EnvZ. In questo costrutto, Trg contribuisce i domini periplasmatici e transmembrana così come un breve segmento citoplasmatico, e EnvZ contribuisce il dominio citoplasmatico chinasi/fosfatasi. I batteri ingegnerizzati hanno percepito i livelli di glucosio nelle masse di cellule tumorali e hanno risposto all’attività metabolica del tumore, portando forse al suo effetto terapeutico. Queste caratteristiche sono probabilmente conservate in altri membri di questa famiglia di sensori107.
I batteri possono colonizzare e proliferare in TMEs ad un rapporto tumore-normale tessuto superiore a 10.000; così, QS può essere utilizzato come un interruttore di espressione genica108,109. Un utile sistema QS è regolato da un autoinduttore, la proteina sintetica LuxI, e la proteina regolatrice trascrizionale LuxR. L’acilomoserina lattone (AHL) prodotto da LuxI, che dipende dalla densità batterica, attiva LuxR e promuove la trascrizione dei suoi geni bersaglio. I sistemi QS dipendenti dalla concentrazione di AHL sono stati usati con successo per esprimere altamente proteine eterologhe in tumori colonizzanti i batteri90,109,110,111. L’approccio QS è stato utilizzato per introdurre una varietà di circuiti genici. Per esempio, l’introduzione di un circuito di lisi sincronizzato nei batteri ha migliorato l’efficacia anticancro consentendo il rilascio del farmaco attraverso l’introduzione periodica dell’autoinduttore (feedback positivo) e la conseguente attivazione di un gene di lisi del batteriofago (feedback negativo)108.
Oltre all’autoinnesco interno e all’autoinnesco, l’espressione dei circuiti genici può anche essere controllata da induttori esterni, comprese sostanze chimiche come l’l-arabinosio, l’acido salicilico (ASA) e la tetraciclina. La trascrizione dal promotore PBAD può essere controllata tramite un’interazione tra il repressore AraC e l’l-arabinosio5,112. In un ceppo attenuato di Salmonella, l’espressione guidata da pBAD di carichi utili terapeutici da un plasmide potrebbe essere regolata tramite somministrazione intravenosa o intraperitoneale di l-arabinosio20,21,113. Un ceppo di Salmonella con una mutazione nell’operone Ara, che risulta in un alterato metabolismo di l-arabinosio, mostra una forte attivazione del promotore PBAD114. Nel sistema di espressione ASA, la regolazione del gene è controllata dal promotore Pm dipendente da XylS2115,116,117. Un ceppo attenuato di Salmonella che ospita un sistema di espressione ASA su un plasmide o sul cromosoma ha permesso una regolazione efficiente dei geni che codificano gli enzimi di conversione dei farmaci (vedi sotto) e ha portato a una marcata riduzione della crescita tumorale115. Il sistema di espressione pTet è regolato simultaneamente dai promotori bidirezionali PtetA e PtetR, che sono indotti da tetraciclina o doxiciclina118. In uno studio preclinico, un gene reporter e un gene terapeutico sono stati inseriti sotto questi promotori bidirezionali per visualizzare il processo di targeting e consegnare farmaci terapeutici, rispettivamente7. Questo sistema chimicamente inducibile è regolato in un modo dipendente dalla dose e dal tempo119; Pertanto, imprecisioni nel tempo di somministrazione induttore o la dose dell’induttore può portare a espressione aspecifica o subottimale delle molecole bersaglio in TMEs. Un sistema alternativo inducibile utilizza il promotore recA inducibile da radiazioni48. Radiazione provoca danni al DNA che attiva la trascrizione dei geni sotto il controllo del promotore recA. Questo metodo combina gli effetti terapeutici della radioterapia con l’induzione dipendente dalle radiazioni dell’espressione genica anticancro120. L’induzione dell’espressione di TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) tramite una dose di 2 Gy di γ-irradiazione 48 ore dopo la somministrazione del ceppo di Salmonella ingegnerizzato significativamente ritardato la crescita delle cellule di cancro al seno 4T148. La radiazione è vantaggiosa perché può penetrare il tessuto tumorale ed essere utilizzato per il trattamento localizzato. Tuttavia, le radiazioni possono anche causare tossicità inducendo danni al DNA nelle cellule sane intorno al tumore e probabilmente causano mutazioni fatali nei batteri terapeutici che potrebbero attenuare il loro effetto terapeutico101.
Drug delivery
Nonostante gli studi sugli effetti antitumorali dei batteri, i batteri da soli sono spesso insufficienti a sopprimere completamente i tumori. Per migliorare i risultati positivi della terapia batterica del cancro, è stata esplorata l’utilità dei sistemi di espressione eucariotica e procariotica per la consegna di carichi utili terapeutici, compresi gli agenti citotossici, gli enzimi di conversione dei farmaci, i regolatori immunitari, le molecole che mirano allo stroma tumorale e i siRNA (elencati nella tabella 2). I sistemi di espressione procariotica discussi sopra sono l’approccio più comunemente usato, e questi sistemi dipendono dalla trasformazione di batteri con plasmidi procariotici che codificano i geni bersaglio 70,121,122; al contrario, i sistemi di espressione eucariotica coinvolgere trasduzione di cellule ospiti, come le cellule immunitarie o cellule tumorali, con plasmidi eucariotici che codificano i cDNA dei geni bersaglio 123.
Agenti citotossici
Gli agenti citotossici trasportati da batteri mirati ai tumori possono avere attività antitumorale intrinseca. In combinazione con l’uso di promotori inducibili, l’espressione degli agenti citotossici può essere strettamente controllata per ridurre i loro effetti tossici sui tessuti normali. La citolisina A (ClyA), una proteina emolitica con pori di 34 kDa prodotta da E. coli, S. Typhimurium e Paratyphi A, può essere trasportata sulla superficie batterica e secreta senza modifiche post-traslazionali. Diversi ceppi batterici, come E. coli e S. Typhimurium attenuato, sono stati ingegnerizzati per esprimere ClyA da un promotore costitutivo5 o da promotori inducibili attivati da arabinosio5 o doxiciclina7, e questi ceppi hanno mostrato eccellenti effetti di inibizione del tumore.
L’induzione dell’apoptosi nelle cellule tumorali è una promettente strategia di terapia del cancro. Apoptin, una proteina derivata dal virus dell’anemia del pollo, induce selettivamente l’apoptosi in un gran numero di tipi di cellule tumorali umane attraverso un percorso p53-indipendente e Bcl-2-insensibile, senza effetti sul tessuto normale124. Trasformando un plasmide di espressione eucariotica codificante apoptin (pCDNA3.1) in un ceppo S. Typhimurium attenuato, Wen et al. osservato una significativa regressione del tumore con tossicità sistemica minima in topi umani portatori di cancro alla laringe65. Altri agenti citotossici che possono essere utilizzati in modo simile per indurre l’apoptosi includono tre membri della famiglia TNF-α (TNF-α, TRAIL e il ligando Fas); tuttavia, a causa della loro breve emivita ed epatotossicità, l’utilità di questi ligandi citotossici è limitata dalla loro insufficiente esposizione tumorale e dagli effetti dannosi sulla funzione epatica125. Per migliorare la biodisponibilità e la sostenibilità di queste proteine, i batteri sono stati utilizzati per consegnarli direttamente alla regione tumorale48,78,126,127. Forbes et al. hanno ingegnerizzato un ceppo di S. Typhimurium non patogeno che esprime TRAIL murino sotto il controllo del promotore recA inducibile dalle radiazioni. Dopo l’irradiazione, TRAIL è stato secreto, dove ha ritardato la crescita del tumore mammario in modo significativo e ha ridotto il rischio di morte48.
Invasin, una proteina di superficie di Yersinia, può legarsi all’integrina β1 in modo selettivo per innescare l’ingresso del batterio nelle cellule ospiti. Utilizzando un ceppo di E. coli non patogeno e ricombinante invasivo che coesprime l’invasina e l’antigene modello ovalbumina e LLO, Critchley-Thorne et al. hanno dimostrato che il ceppo ingegnerizzato potrebbe invadere le cellule che esprimono l’integrina β1 e fornire proteine ai tumori per produrre effetti terapeutici nei topi128. Azurin, una proteina redox a basso peso molecolare, può essere internalizzata in modo efficiente per avviare l’apoptosi delle cellule tumorali aumentando i livelli intracellulari di p53 e Bax per indurre il rilascio del citocromo c mitocondriale nel citosol. L’efficacia della consegna dell’azurina basata su E. coli nel sopprimere la crescita del melanoma del topo B16 e del cancro al seno del topo 4T1 è stata dimostrata da Nissle nel 1917; inoltre, questo approccio ha anche impedito la metastasi polmonare e stimolato le risposte infiammatorie29.
Ezimi di conversione dei farmaci
L’espressione degli enzimi di conversione dei farmaci può convertire i farmaci in agenti citotossici specificamente nella regione tumorale. L’utilità di questa strategia per migliorare l’efficacia del trattamento del cancro e ridurre gli effetti collaterali associati alla somministrazione sistemica è stata esplorata. Diversi enzimi di conversione dei farmaci sono stati forniti da batteri96,129,130,131. La citosina deaminasi (CD) converte la non tossica 5-fluorocitosina (5-FC) nell’agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU). Il 5-FU è altamente tossico perché viene ulteriormente metabolizzato in un prodotto che interferisce con la sintesi di DNA e RNA132,133,134,135. Alla co-somministrazione di un ceppo attenuato di S. Typhimurium (VNP20009) che esprime il CD di E. coli e 5-FC nei pazienti, è stata osservata la conversione di 5-FC in 5-FU, indicando la produzione batterica di CD funzionale nel tumore54.
Il sistema del virus dell’herpes simplex tipo I timidina chinasi/ganciclovir (HSV1-TK/GCV) è un’altra combinazione enzima/farmaco che è stata ampiamente studiata per l’uso nella terapia del tumore. L’espressione HSV1-TK specifica del tessuto tumorale può convertire il precursore non tossico ganciclovir in ganciclovir-3-fosfato, una sostanza tossica che uccide le cellule tumorali. Liu et al. hanno testato l’efficacia in vivo di un ceppo di Bifidobacterium infantis che esprime HSV1-TK e GCV per la terapia prodrugale in un modello di tumore alla vescica del ratto. I risultati hanno mostrato che questo approccio mirato potrebbe inibire efficacemente la crescita del tumore alla vescica di ratto aumentando l’espressione della caspasi 3 e inducendo l’apoptosi131. Un altro ceppo di consegna dell’enzima di conversione dei farmaci, E. coli DH5α che esprime la β-glucuronidasi, che idrolizza il glucuronide del farmaco 9ACG nell’inibitore della topoisomerasi I 9-aminocamptothecin (9AC), ha mostrato un’efficiente inibizione del tumore129. L’uso di S. Typhimurium attenuato VNP20009 come vettore per consegnare la carbossipeptidasi G2 ha mostrato una maggiore efficacia antitumorale in combinazione con la somministrazione di un profarmaco130.
Immunomodulatori
Le citochine possono ottenere effetti antitumorali facilitando la proliferazione, attivazione e differenziazione delle cellule immunitarie, inducendo l’apoptosi nelle cellule tumorali e attraverso effetti antiangiogenetici sulla vascolarizzazione tumorale. Diverse citochine, tra cui GM-CSF, IL-12 e IL-18, sono entrati in studi clinici per la terapia del cancro136. Le citochine espresse da batteri tumore-targeting sono stati consegnati specificamente alla regione del tumore, dove hanno aumentato la risposta immunitaria antitumorale nel TME20,29,49,62,137,138,139,140. La somministrazione endovenosa di un ceppo attenuato di S. Typhimurium che esprime IL-18 ha inibito la crescita del tumore primario nei topi, ha indotto una massiccia infiltrazione di leucociti (soprattutto granulociti) e ha aumentato il reclutamento di cellule T NK e CD4+ ma non di cellule T CD8+. Inoltre, questo approccio ha anche aumentato la produzione di citochine nella regione tumorale, compresa quella di IL-1β, TNF-α, IFN-γ e GM-CSF49. IL-2 è la citochina più studiata nel contesto dei sistemi di consegna batterica. La somministrazione orale di un ceppo S. Typhimurium Ty21a che esprime IL-2 ha inibito il carcinoma epatocellulare (HCC) in modelli murini23,29. Flagellin, che attiva il sistema immunitario innato attraverso TLR5, è stato stabilito come un eccellente adiuvante immunoterapia141. Il nostro gruppo ha trattato topi portatori di cancro al colon con un ceppo attenuato di S. Typhimurium ΔppGpp che esprime la flagellina eterologa e ha dimostrato che ha migliorato l’immunità antitumorale attraverso la cooperazione con le vie di segnalazione TLR4 e TLR5. Questo approccio promuove anche uno spostamento da M2 a M1 nei macrofagi e aumenta i livelli di ossido nitrico nei tumori20.
Batteri ingegnerizzati che esprimono antigeni associati al tumore possono sensibilizzare le TME e superare l’auto tolleranza suscitata dalle cellule T regolatorie, suscitando così risposte delle cellule T effettrici e di memoria verso le cellule tumorali che producono antigeni142,143. Sono stati riportati numerosi antigeni associati al cancro alla prostata. Vaccini a base di batteri contro l’antigene specifico della prostata (PSA) sono stati testati in diversi modelli murini139,144. La consegna del gene PSA endogeno usando S. Typhimurium SL7207 attenuato ha alleviato la tolleranza immunitaria agli antigeni delle cellule staminali della prostata murina e ha ritardato significativamente la crescita tumorale84. Approcci di terapia genica usando antigeni contro HER-2/neu143, NY-ESO-183, survivin88, e Mage-b145 hanno anche mostrato promettenti effetti di inibizione del tumore.
Grande interesse si è sviluppato nel campo della terapia del cancro con blocco del checkpoint immunitario (ICB). Nonostante il successo della terapia ICB negli studi clinici, solo alcuni pazienti beneficiano di questo trattamento. Ci sono diverse ragioni per la resistenza dell’ospite alla base di questo effetto, di cui il TME immunosoppressivo è il più importante146,147. Gli studi dimostrano che la colonizzazione del tumore da parte dei batteri può indurre reazioni proinfiammatorie che coinvolgono l’espressione elevata di IL-1β, TNF-α e IFN-γ, così come l’attivazione delle cellule NK e T; quindi, una combinazione di ICB e terapie batteriche può superare la resistenza dell’ospite131.
Targeting dello stroma tumorale
L’angiogenesi gioca un ruolo importante nella crescita tumorale e nelle metastasi. Prendere di mira la neovascolarizzazione tumorale fornisce una direzione promettente per la terapia del cancro. L’endostatina è un frammento C-terminale di 20 kDa del collagene di tipo XVIII che può inibire la generazione di vasi tumorali in modo dose-dipendente senza effetti collaterali evidenti o resistenza ai farmaci148,149. Xu et al. hanno clonato l’endostatina e un siRNA contro il trasduttore di segnale e l’attivatore della trascrizione 3 (Stat3) in un ceppo S. Typhimurium attenuato. Hanno poi testato l’efficacia terapeutica del ceppo nell’HCC ortotropo e hanno dimostrato che poteva inibire la proliferazione tumorale e le metastasi, ridurre la quantità di microvasculatura tumorale, aumentare le popolazioni di cellule T CD4+/CD8+ e i livelli di espressione di diverse citochine infiammatorie (compresi IFN-γ e TNF-α), e downregolare l’espressione del TGF-β, delle cellule T regolatorie e del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)149. Il VEGF e il suo recettore (VEGFR) regolano l’angiogenesi tumorale121,145. La somministrazione orale di S. Typhimurium SL3261 attenuato che esprime il dominio extracellulare VEGFR2 ha inibito la crescita tumorale, la neovascolarizzazione e la metastasi polmonare. Inoltre, anche le percentuali di cellule T CD4+ e CD8+ nella regione tumorale sono aumentate significativamente121. Endoglin (CD105) è un membro della famiglia dei recettori TGF-β. Il TGF-β1 e l’ipossia possono upregolare il promotore del gene endoglin, e questo promotore è altamente attivo nelle cellule endoteliali tumorali. Pertanto, endoglin è stato considerato un bersaglio per la terapia del cancro150. Paterson et al. utilizzato vaccini basati su Listeria contro CD105, Lm-LLO-CD105A e Lm-LLO-CD105B per trattare il cancro al seno in un modello di topo. I vaccini hanno stimolato un robusto effetto antiangiogenesi e una risposta immunitaria antitumorale che ha inibito i tumori primari e metastatici151.
Silenziamento genico
siRNA, una classe di RNA a doppio filo lunghi 20-25 paia di basi che mediano il silenziamento di specifici geni target, hanno fornito un approccio promettente alla terapia del cancro. Tuttavia, la più grande barriera alla terapia di interferenza RNA è la necessità di consegna specifica di siRNAs alla regione del tumore. Sistemi di consegna basati su batteri per siRNA contro Stat363,122,149,152, IDO153,154, survivin155, Sox230, e la polo-like kinase 1 (PLK1) associata al ciclo cellulare57 sono stati testati in modelli tumorali murini. La somministrazione orale di un ceppo attenuato di S. Typhimurium che porta un plasmide di espressione eucariotica che codifica il siRNA-Stat3 ha migliorato l’attività delle cellule NK e la funzione dei linfociti T e ha aumentato la percentuale di cellule T CD8+, mentre ha diminuito il numero di cellule T regolatrici CD4+ CD25+ nel tumore; questi effetti hanno portato all’inibizione della crescita tumorale e alla sopravvivenza prolungata dei topi portatori di tumore122 . Il silenziamento dell’espressione IDO dell’ospite usando un ceppo di S. Typhimurium VNP20009 che esprime shIDO ha provocato una significativa infiltrazione tumorale da parte dei neutrofili polimorfonucleati che generano ROS, che ha promosso la morte cellulare intratumorale e il controllo sostanziale dei melanomi B16F10153 e dei tumori colorettali CT26 o MC38156.