Virulenssin heikentäminen
Bakteerien kehittäminen siten, että niiden virulenssia isännän immuunijärjestelmää vastaan voidaan minimoida, on myös olennaista46,47. On huomattava, että jotkin bakteerien virulenssitekijät voivat olla vastuussa niiden luontaisesta kasvainvastaisesta aktiivisuudesta. Sen vuoksi on saavutettava heikentäminen ilman, että niiden kasvainvastainen aktiivisuus katoaa. Esimerkiksi ihmisen patogeeneissä tappavan myrkylliset kannat on muutettu suurelta osin turvallisiksi kannoiksi poistamalla tärkeimmät virulenssigeenit2,10,21. VNP20009, heikennetty S. Typhimurium -kanta, luotiin poistamalla msbB- ja purI-geenit; tätä kantaa on tutkittu laajasti kasvaimia kantavilla hiirillä, ja se on osoittanut lupaavaa kasvaimiin kohdistuvaa spesifisyyttä ja kasvaimia estäviä vaikutuksia28,48,49,50. Salmonella-suvun msbB:n poistaminen johtaa LPS:n lipidin A-komponentin myristoylaatioon, mikä vähentää merkittävästi LPS:n aiheuttamaa TNF:n induktiota ja voi vähentää septisen sokin riskiä51. VNP20009:ää testattiin myöhemmin vaiheen I tutkimuksissa syöpäpotilailla51,52,53,54. Pettymykseksi VNP20009:ltä puuttui kasvainspesifisyys eikä sillä ollut selvää arvoa potilaiden kasvainten hoidossa52,54,55. Tämä epäonnistuminen saattaa johtua VNP20009:n tuottamasta penta-asyloituneesta lipidistä A, joka on TLR4-antagonisti56. LPS:n rakenteen muuttamiseksi niin, että kasvainvastainen aktiivisuus säilyisi, tuotettiin mutanttisia Salmonella-kantoja, jotka tuottavat homologista hesta-asyloidattua lipidiä A, jolla on suuri affiniteetti TLR4:ään, poistamalla pagP-, pagL- ja lpxR-geenit47,57,58. Nämä mutaatiot eivät vaikuttaneet virulenssiin msbB-mutaatiotaustassa59. Mutaatiot rfaG:ssä ja rfaD:ssä johtavat typistetyn LPS:n tuotantoon, mikä johtaa heikentyneeseen toksisuuteen ja kasvainspesifisyyteen; kuitenkin myös näiden bakteerien kasvainvastainen vaikutus väheni. LPS:n biosynteesigeenien kromosomaalinen integrointi araBAD-lokukseen voitti nämä rajoitukset, ja mutanttikanta osoitti heikentynyttä virulenssia ja terapeuttisia vaikutuksia60.
Toinen myrkytön Salmonella-kanta muokattiin alentamalla endotoksiiniin liittyvien geenien ilmentymistä tai estämällä niiden toiminnallinen aktiivisuus. Salmonellan relA- ja spoT-mutanttikannoilla, joilla oli puutteita toksiinigeenien ilmentymiseen osallistuvan signaalimolekyylin ppGpp:n synteesissä, oli vähäinen toksisuus. ΔppGpp-kannan LD50-arvo oli jopa 105-106-kertainen villityypin kantoihin verrattuna61. ΔppGpp-kannalla oli erinomainen kasvainvastainen aktiivisuus, koska se kykeni aktivoimaan inflammasomia (NLRP3, IPAF) ja indusoimaan useiden proinflammatoristen sytokiinien (IL-1β, IL-18 ja TNF-α) ilmentymistä21. phoP- ja phoQ-geenien poistaminen ei vaikuttanut Salmonellan kasvainvastaiseen aktiivisuuteen, mutta poistot vähensivät sen virulenssia normaalissa kudoksessa62. Näitä mutaatioita sisältäviä kantoja on käytetty erinomaisen rokotteen tuottamiseen, ja niitä on äskettäin käytetty kasvainlääkkeiden kuljetusjärjestelmänä63,64,65,66,67. S. Typhimurium -mutanttikannan, jolla on puutteita ZnuABC-sinkinkinkuljetusjärjestelmän synteesissä, antaminen suun kautta voi saada aikaan tehokkaan immuunivasteen, joka suojaa hiiriä suolistoinfektioita vastaan68. Mutaatiot DNA:n adeniinimetylaasia, adenylaattisyklaasia ja syklistä adenosiinimonofosfaattireseptoriproteiinia koodaavissa geeneissä, jotka osallistuvat erilaisiin patogeenisten geenien säätelyreitteihin, voisivat vähentää bakteerien toksisuutta in vivo69. Salmonellan gmd-geenin poistaminen esti biofilmin muodostumisen ja aiheutti immuunivasteen infektion varhaisessa vaiheessa28,57. Lisäksi htrA:n, STM3120:n ja slyA:n poistaminen vähensi merkittävästi bakteerien selviytymistä makrofageissa sekä bakteerien syöpää ehkäiseviä vaikutuksia70. Soluinvaasioon osallistuvien geenien poistaminen voi heikentää Listeria monocytogenesin sytotoksisuutta. Hly:n deleetio aiheuttaa vikoja fagolysosomin vapautumisessa52,71,72. L. monocytogenes -mutanttikannoista, joista puuttuu actA:ta tai ActA:n PEST:n kaltaisia sekvenssejä, puuttuu myös solujenvälinen diffuusiokyky73,74, ja inlA:ta ja inlB:tä puuttuvat mutanttikannat ovat invasiovirheellisiä75,76.
Spesifisten ravintoaineesta riippuvaisten mutaatioiden tuominen bakteereihin on yksi lisämenetelmä, jonka avulla voidaan tehostaa kasvainspesifistä proliferaatiota virulenssia heikentäen. A1-R-salmonellakanta, joka on auxotrofinen leusiinille ja arginiinille, kolonisoi mieluiten kasvaimia, sillä on kasvainvastaisia vaikutuksia ja se lisää kasvainten herkkyyttä kemoterapialle22,77,78,79. L. monocytogenes -kanta muutettiin soluseinäkomponentin d-alaniinin suhteen auxotrofiseksi dal/dat-lokuksen inaktivoinnin avulla. Tämä mutanttikanta oli erittäin heikentynyt ja pystyi indusoimaan sytotoksisia T-lymfosyyttejä22,80. Salmonellakannat SL3261 ja SL7207, joissa on aroA-deleetio, ja BRD509, joka on aromaattisia aminohappoja auxotrofisesti tuottava aroA/aroD-kaksoismutanttikanta, ovat erittäin heikentyneitä eivätkä leviä vapaasti isännässä29,57,81,82,83,84,85. Toinen S. Typhimurium -kanta, YB1, joka on johdettu SL7207:stä sijoittamalla välttämätön asd-geeni hypoksia-indusoidun promoottorin kontrolliin, ei selviytynyt normaalissa kudoksessa ilman diaminopimeliinihapon eksogeenista saantia, vaikka se pystyi silti kolonisoimaan hypoksisia kasvaimia; näin ollen tämä kanta aiheuttaa vähemmän vahinkoa normaalille kudokselle säilyttäen samalla kasvaimiin kohdistuvan kykynsä21,47,86,87. Lisäksi purI- ja purD-geenien poistaminen johti eksogeenisen adeniinin tarpeeseen, mikä lisäsi bakteerien kykyä lisääntyä tehokkaasti puriinipitoisilla alueilla, kuten kasvainkudoksessa2,88. Syöpähoidossa käytetyt heikennetyt bakteerikannat on lueteltu taulukossa 1.
Tuumorikohdistuvuuden parantaminen
Bakteerien tuumorikohdistuvuuden parantamiseen käytetyillä insinööriteknisillä lähestymistavoilla voidaan parantaa sekä turvallisuutta että kasvaimen vastaista tehoa. Eräässä lähestymistavassa näiden tulosten saavuttamiseksi ppGpp-puutteellinen SHJ2037-kanta muokattiin geneettisesti siten, että sen solupinnalla näkyi kasvainspesifisiä ligandeja. Arg-Gly-Asp-peptidi, joka sitoutuu αvββ3-integriiniin, fuusioitiin ulkokalvoproteiini A:han, jotta sen ilmentyminen bakteerien pinnalla saatiin aikaan89. Tuloksena saatu kanta osoitti lisääntynyttä kasvainspesifisyyttä ja selvästi lisääntynyttä kasvainvastaista aktiivisuutta MDA-MB-231-rintasyöpäsoluissa ja MDA-MB-435-melanooma-ksenotransplanteissa, jotka yliekspressoivat αvββ3-integriiniä. Bakteereja kehitettiin myös kohdistumaan kasvaimeen liittyviin antigeeneihin, kuten karsinoembryoniseen antigeeniin tai lymfoomaan liittyvään antigeeniin CD20. Näillä kannoilla oli tehokkaita syövänvastaisia vaikutuksia ja ne vähensivät epäspesifistä bakteerien kertymistä maksaan ja pernaan90,91. Hyödyntämällä biotiini-streptavidiinisidosta rakennettiin L. monocytogenes -kanta, jossa solut oli päällystetty plasmidilla ladatuilla nanohiukkasilla, jotka ilmentävät bioluminesenssigeeniä. Tämä mikrorobotiksi kutsuttu kanta toimitti funktionaalisia nukleiinihappomolekyylejä kiinteisiin kasvaimiin ja sitä voitiin seurata bioluminesenssikuvauksen avulla60,92,93. Kiehtova vaihtoehto, joka voi lisätä kasvainten selektiivisyyttä, on synteettisten adheesiinien (SA) esittäminen E. colin pinnalla. SA:illa on modulaarinen rakenne, joka koostuu vakaasta β-domeenista, jota tarvitaan ulomman kalvon ankkurointiin, ja pinnalle altistuvista immunoglobuliinidomeeneista, joilla on korkea affiniteetti ja spesifisyys ja jotka voidaan valita suurista kirjastoista94. Probioottiset kannat osoittivat parempaa kasvainspesifisyyttä lisäämällä bakteerien injektiokapasiteettia heikentämättä niiden luontaisia ominaisuuksia95,96,97,98,99. Probioottiset E. coli Symbioflor-2 -solut poistuivat hyvin nopeasti pernasta ja maksasta ja säilyivät hengissä vain kasvaimessa, mikä osoittaa tehokasta kasvaimen kohdentumista. Hiiret, jotka infektoitiin probioottisella Salmonella-kannalla, sietivät suuren bakteerikuorman ilman patologisia oireita; hyötykuorman toimitusjärjestelmään tarvitaan kuitenkin parannuksia, koska kannan terapeuttinen teho oli huonompi, vaikka sen turvallisuus in vivo oli erinomainen57.
Lääkkeiden ilmentämisstrategiat
Useimmat hyötykuormat, joita kasvaimiin kohdistuvat bakteerit toimittavat, ovat myrkyllisiä sekä kasvainsoluille että normaaleille soluille; näin ollen niiden tuotantoa kontrolloidaan tiukasti mieluummin kuin niitä ilmentää konstitutiivisesti. Hyötykuorman ekspression tarkalla laukaisemisella voidaan maksimoida sen terapeuttiset vaikutukset ja minimoida systeeminen toksisuus. Hallittavissa oleva geeniekspressiojärjestelmä voidaan teoriassa rakentaa lisäämällä erityinen promoottorisekvenssi lääkeaineita koodaavan geenin yläjuoksulle ja antamalla siten transkriptiokontrolli ulkoisten signaalien avulla. Tällaisen järjestelmän avulla voidaan hallita lääkkeen tuotannon ajoitusta ja sijaintia in vivo. Tämäntyyppisen geenisäätelyn eli laukaisun strategiat kuuluvat useimmiten seuraaviin kolmeen luokkaan: sisäinen laukaisu, itse laukaisu (quorum sensing-QS) ja ulkoinen laukaisu100.
Toisin kuin normaaleilla kudoksilla, TME:llä on erityisominaisuuksia, kuten hypoksia, asidoosi ja nekroosi, joita bakteerit voivat aistia ja joita ne pystyvät hyödyntämään parantaakseen kasvaimen spesifisyyttä101. Esimerkiksi hypoksiaan indusoituvat promoottorit, kuten HIP-1:n ja pepT:n promoottorit, aktivoituvat fumaraatin ja nitraatin pelkistymisen seurauksena kasvainkudoksen hypoksisessa ympäristössä102,103,104. Tämä hypoksia-indusoituva ekspressiojärjestelmä on suunniteltu toimimaan ainoastaan anaerobisissa olosuhteissa välttämättömien geenien, kuten asd:n, ilmentymiseksi105. Flentie et al. tunnistivat viisi promoottorisekvenssiä, jotka aktivoituvat spesifisesti happamissa mikroympäristöissä, jotka liittyvät syöpäsoluihin in vitro ja kasvaimiin in vivo. Happamuusspesifiset promoottorit tunnistettiin käyttämällä räätälöityä promoottoria sisältämätöntä transposonireportteria, joka koodaa bakteerilusiferaasia, seulomalla 7400:n salmonellan transposoni-insertiomutaation kirjastoa yhteisviljelyssä melanooma- tai paksusuolen karsinoomasolujen kanssa. Heikennetty Salmonella-kanta, joka ilmentää Shiga-toksiinia alhaisen pH:n indusoiman promoottorin ohjaamana, osoitti voimakasta kasvainselektiivisyyttä ja kasvainvastaista aktiivisuutta106. Glukoosisensori kehitettiin E. coli -bakteerissa synteettisellä fuusiolla, jossa Trg-kemoreseptori yhdistettiin EnvZ-osmosensoriin. Tässä konstruktiossa Trg:llä on periplasminen ja transmembraaninen domeeni sekä lyhyt sytoplasminen segmentti ja EnvZ:llä sytoplasminen kinaasi/fosfataasidomeeni. Muokatut bakteerit havaitsivat glukoositasot kasvainsolumassoissa ja reagoivat kasvaimen metaboliseen aktiivisuuteen, mikä mahdollisesti johti niiden terapeuttiseen vaikutukseen. Nämä ominaisuudet ovat todennäköisesti konservoituneet muissa tämän sensoriperheen jäsenissä107.
Bakteerit voivat kolonisoitua ja lisääntyä TME:ssä yli 10 000:n kasvaimen ja normaalin kudoksen välisellä suhteella, joten QS:ää voidaan käyttää geeniekspression kytkimenä108,109. Erästä käyttökelpoista QS-järjestelmää säätelevät autoinduktori, synteettinen LuxI-proteiini ja transkriptiota säätelevä LuxR-proteiini. LuxI:n tuottama asyylihomoseriinilaktoni (AHL), joka riippuu bakteerin tiheydestä, aktivoi LuxR:n ja edistää sen kohdegeenien transkriptiota. AHL-konsentraatiosta riippuvia QS-järjestelmiä on käytetty menestyksekkäästi heterologisten proteiinien korkeaan ekspressioon bakteerikolonisoivissa kasvaimissa90,109,110,111. QS-menetelmää on käytetty erilaisten geenipiirien käyttöönottoon. Esimerkiksi synkronoidun lyysipiirin tuominen bakteereihin paransi syöpälääkkeen tehoa sallimalla lääkeaineen vapautumisen autoinduktorin (positiivinen takaisinkytkentä) ajoittaisen tuomisen ja siitä johtuvan bakteriofaagin lyysi-geenin (negatiivinen takaisinkytkentä) aktivoitumisen kautta108.
Sisäisen ja itsestään tapahtuvan laukaisun lisäksi geenipiirien ilmentymistä voidaan kontrolloida myös ulkoisilla induktoreilla, mukaan luettuina kemikaalit, kuten l-arabinoosi, salisyylihappo (ASA), ja tetrasykliini. Transkriptiota PBAD-promoottorista voidaan kontrolloida AraC-repressorin ja l-arabinoosin välisen vuorovaikutuksen avulla5,112. Heikennetyssä Salmonella-kannassa pBAD-plasmidista peräisin olevien terapeuttisten hyötykuormien pBAD-ohjattua ilmentymistä voidaan säädellä laskimonsisäisellä tai vatsansisäisellä l-arabinoosin antamisella20,21,113. Salmonellakannassa, jossa on mutaatio Ara-operonissa, joka johtaa heikentyneeseen l-arabinoosimetaboliaan, PBAD-promoottori aktivoituu voimakkaasti114. ASA-ekspressiojärjestelmässä geenin säätelyä ohjaa XylS2-riippuvainen Pm-promoottori115,116,117. Heikennetty Salmonella-kanta, jossa ASA-ekspressiojärjestelmä on plasmidilla tai kromosomissa, mahdollisti tehokkaan säätelyn aihiolääkkeitä konvertoivia entsyymejä koodaaville geeneille (ks. jäljempänä) ja johti kasvainten kasvun huomattavaan vähenemiseen115. PTet-ekspressiojärjestelmää säätelevät samanaikaisesti kaksisuuntaiset PtetA- ja PtetR-promoottorit, jotka indusoituvat tetrasykliinillä tai doksisykliinillä118. Prekliinisessä tutkimuksessa näiden kaksisuuntaisten promoottoreiden alle lisättiin reportterigeeni ja terapeuttinen geeni kohdentamisprosessin visualisoimiseksi ja terapeuttisten lääkkeiden toimittamiseksi7. Tätä kemiallisesti indusoituvaa järjestelmää säädellään annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla119 , joten epätarkkuudet induktorin antoajankohdassa tai induktorin annoksessa voivat johtaa kohdemolekyylien epäspesifiseen tai suboptimaaliseen ilmentymiseen TME:ssä. Vaihtoehtoisessa indusoituvassa järjestelmässä käytetään säteilyyn indusoituvaa recA-promoottoria48. Säteily aiheuttaa DNA-vaurioita, jotka aktivoivat recA-promoottorin valvonnassa olevien geenien transkription. Tässä menetelmässä yhdistyvät sädehoidon terapeuttiset vaikutukset ja säteilystä riippuvainen syövänvastaisen geeniekspression induktio120. TNF:ään liittyvän apoptoosia indusoivan ligandin (TRAIL) ilmentymisen indusoiminen 2 Gy:n γ-säteilyannoksella 48 tuntia muunnellun Salmonella-kannan antamisen jälkeen viivästytti merkittävästi 4T1-rintasyöpäsolujen kasvua48. Säteily on edullista, koska se voi tunkeutua kasvainkudokseen ja sitä voidaan käyttää paikallishoitoon. Säteily voi kuitenkin aiheuttaa myös toksisuutta aiheuttamalla DNA-vaurioita kasvaimen ympärillä olevissa terveissä soluissa ja todennäköisesti aiheuttaa terapeuttisissa bakteereissa kohtalokkaita mutaatioita, jotka voivat heikentää niiden terapeuttista vaikutusta101.
Lääkkeiden toimittaminen
Bakteerien kasvainvastaista vaikutusta koskevista tutkimuksista huolimatta bakteerit yksinään eivät useinkaan riitä tukahduttamaan kasvaimia kokonaan. Bakteeriperäisen syöpähoidon myönteisten tulosten parantamiseksi on tutkittu eukaryoottisten ja prokaryoottisten ekspressiojärjestelmien käyttökelpoisuutta terapeuttisten hyötykuormien, kuten sytotoksisten aineiden, aihiolääkkeitä konvertoivien entsyymien, immuunisäätäjien, kasvaimen stroomaan kohdistuvien molekyylien ja siRNA:iden, toimittamiseen (lueteltu taulukossa 2). Edellä käsitellyt prokaryoottiset ilmentymisjärjestelmät ovat yleisimmin käytetty lähestymistapa, ja nämä järjestelmät perustuvat bakteerien muuntamiseen kohdegeenejä koodaavilla prokaryoottisilla plasmideilla70,121,122. Sen sijaan eukaryoottisissa ilmentymisjärjestelmissä siirretään isäntäsoluja, kuten immuunisoluja tai kasvainsoluja, eukaryoottisilla plasmideilla, jotka koodaavat kohdegeenien cDNA:ta123.
Sytotoksiset aineet
Kasvaimiin kohdistuvien bakteerien kuljettamilla sytotoksisilla aineilla voi olla luontainen kasvainvaikutus. Yhdessä indusoituvien promoottorien käytön kanssa sytotoksisten aineiden ilmentymistä voidaan kontrolloida tiukasti niiden toksisten vaikutusten vähentämiseksi normaaliin kudokseen. Sytolysiini A (ClyA), 34 kDa:n huokosta muodostava hemolyyttinen proteiini, jota E. coli, S. Typhimurium ja Paratyphi A tuottavat, voidaan kuljettaa bakteerin pinnalle ja erittää ilman posttranslationaalista modifiointia. Useita bakteerikantoja, kuten E. coli ja heikennetty S. Typhimurium, on muunnettu ilmentämään ClyA:ta konstitutiiviselta promoottorilta5 tai indusoitavilta promoottoreilta, jotka aktivoidaan arabinoosilla5 tai doksisykliinillä7 , ja nämä kannat ovat osoittaneet erinomaisia kasvaimia estäviä vaikutuksia.
Apoptoosin indusoiminen kasvainsoluissa on lupaava syöpähoitostrategia. Apoptiini, kana-anemiaviruksesta peräisin oleva proteiini, indusoi selektiivisesti apoptoosia monissa ihmisen syöpäsolutyypeissä p53:sta riippumattoman, Bcl-2:n suhteen herkän reitin kautta, eikä sillä ole vaikutuksia normaaliin kudokseen124. Kun apoptiinia koodaava eukaryoottinen ekspressioplasmidi (pCDNA3.1) muunnettiin heikennettyyn S. Typhimurium -kantaan, Wen et al. havaitsivat merkittävää kasvaimen taantumista minimaalisella systeemisellä toksisuudella ihmisen kurkunpään syöpää kantavilla hiirillä65. Muita sytotoksisia aineita, joita voidaan vastaavasti käyttää apoptoosin indusoimiseen, ovat TNF-α-perheen kolme jäsentä (TNF-α, TRAIL ja Fas-ligandi); niiden lyhyen puoliintumisajan ja maksatoksisuuden vuoksi näiden sytotoksisten ligandien käyttökelpoisuutta rajoittaa kuitenkin niiden riittämätön altistuminen kasvaimelle ja haitalliset vaikutukset maksan toimintaan125. Näiden proteiinien biologisen hyötyosuuden ja kestävyyden parantamiseksi on käytetty bakteereja niiden toimittamiseksi suoraan kasvainalueelle48,78,126,127. Forbes et al. kehittivät ei-patogeenisen S. Typhimurium -kannan, joka ilmentää hiiren TRAIL:ää säteilyyn indusoituvan recA-promoottorin ohjaamana. Säteilytyksen jälkeen TRAIL erittyi, minkä jälkeen se viivästytti merkittävästi maitorauhaskasvaimen kasvua ja vähensi kuolemanriskiä48.
Invasiini, Yersinian pintaproteiini, voi sitoutua β1-integriiniin selektiivisesti laukaistakseen bakteerin pääsyn isäntäsoluihin. Käyttämällä ei-patogeenista, rekombinanttista invasiivista E. coli -kantoja, jotka yhdessä ilmentävät invasiineja ja malliantigeenia ovalbumiinia sekä LLO:ta, Critchley-Thorne et al. osoittivat, että muokattu kanta pystyi tunkeutumaan β1-integriiniä ilmentäviin soluihin ja kuljettamaan proteiineja kasvaimiin terapeuttisten vaikutusten aikaansaamiseksi hiirissä128. Atsuriini, pienimolekyylipainoinen redox-proteiini, voidaan sisäistää tehokkaasti syöpäsolujen apoptoosin käynnistämiseksi nostamalla solunsisäisiä p53- ja Bax-tasoja mitokondriaalisen sytokromi c:n vapautumisen indusoimiseksi sytosoliin. Nissle osoitti vuonna 1917 E. coli -pohjaisen atsuriinin annostelun tehokkuuden B16-hiiren melanooman ja 4T1-hiiren rintasyövän kasvun tukahduttamisessa; lisäksi tämä lähestymistapa esti myös keuhkometastasointia ja stimuloi tulehdusreaktioita29.
Prodrug-converting enzymes
Prodrug-converting entsyymien ilmentymällä prodrug-converting entsyymit voivat muuntaa prodrugs-solunsalpaajia sytotoksisiksi aineiksi spesifisesti kasvainalueella. Tämän strategian käyttökelpoisuutta syövän hoidon tehokkuuden parantamiseksi ja systeemiseen antoon liittyvien sivuvaikutusten vähentämiseksi on tutkittu. Useita aihiolääkkeitä konvertoivia entsyymejä on tuotettu bakteerien avulla96,129,130,131. Sytosiinideaminaasi (CD) muuntaa myrkyttömän 5-fluorosytosiinin (5-FC) kemoterapeuttiseksi aineeksi 5-fluorourasiiliksi (5-FU). 5-FU on erittäin myrkyllinen, koska se metaboloituu edelleen tuotteeksi, joka häiritsee DNA- ja RNA-synteesiä132,133,134,135. Kun potilaille annettiin samanaikaisesti heikennettyä S. Typhimurium -kantaa (VNP20009), joka ilmentää E. coli CD:tä, ja 5-FC:tä, havaittiin 5-FC:n muuntumista 5-FU:ksi, mikä osoitti, että bakteerit tuottivat toiminnallista CD:tä kasvaimessa54.
Herpes simplex -viruksen tyypin I tymidiinikinaasi/ganisikloviiri (HSV1-TK/GCV) -järjestelmä on toinen aihiolääkettä konvertoiva entsyymi/ aihiolääkeyhdistelmä, jota on tutkittu laajalti käytettäväksi kasvainten hoidossa. Kasvainkudospesifinen HSV1-TK-ekspressio voi muuntaa myrkyttömän esiasteen gansikloviirin gansikloviiri-3-fosfaatiksi, myrkylliseksi aineeksi, joka tappaa kasvainsoluja. Liu ym. testasivat HSV1-TK:ta ja GCV:tä ilmentävän Bifidobacterium infantis -kannan in vivo -tehoa aihiolääkehoitoa varten rotan virtsarakon kasvainmallissa. Tulokset osoittivat, että tämä kohdennettu lähestymistapa pystyi tehokkaasti estämään rotan virtsarakon kasvaimen kasvua lisäämällä kaspaasi 3:n ilmentymistä ja indusoimalla apoptoosia131. Toinen aihiolääkkeitä konvertoivan entsyymin toimituskanta, E. coli DH5α, joka ilmentää β-glukuronidaasia, joka hydrolysoi glukuronidien aihiolääkkeen 9ACG topoisomeraasi I -inhibiittoriksi 9-aminokamptotesiiniksi (9AC), osoitti tehokasta kasvainten estoa129. Heikennetyn S. Typhimurium VNP20009:n käyttö vektorina karboksipeptidaasi G2:n levittämiseen osoitti tehostettua kasvainvastaista tehoa yhdessä aihiolääkkeen antamisen kanssa130.
Immunomodulaattorit
Sytokiinit voivat saada aikaan kasvainvastaista vaikutusta helpottamalla immuunisolujen proliferaatiota, aktivaatiota ja erilaistumista, indusoimalla apoptoosia kasvainsolujen soluihin ja antiangiogeneesiä edistävillä vaikutuksilla kasvaimen verisuonistossa. Useat sytokiinit, kuten GM-CSF, IL-12 ja IL-18, ovat tulleet kliinisiin tutkimuksiin syövän hoidossa136. Kasvaimeen kohdistuvien bakteerien ilmentämiä sytokiineja toimitettiin erityisesti kasvaimen alueelle, jossa ne lisäsivät kasvaimen vastaista immuunivastetta TME:ssä20,29,49,62,137,138,139,140. IL-18:aa ilmentävän heikennetyn S. Typhimurium -kannan laskimonsisäinen anto esti hiirillä primaarikasvaimen kasvua, aiheutti massiivisen leukosyytti-infiltraation (pääasiassa granulosyyttejä) ja lisäsi NK- ja CD4+ T-solujen mutta ei CD8+ T-solujen rekrytointia. Lisäksi tämä lähestymistapa lisäsi myös sytokiinituotantoa kasvaimen alueella, mukaan lukien IL-1β:n, TNF-α:n, IFN-γ:n ja GM-CSF:n49 tuotanto. IL-2 on laajimmin tutkittu sytokiini bakteerien toimitusjärjestelmien yhteydessä. IL-2:ta ilmentävän S. Typhimurium Ty21a -kannan oraalinen anto esti hepatosellulaarista karsinoomaa (HCC) hiirimalleissa23,29. Flagelliini, joka aktivoi synnynnäistä immuunijärjestelmää TLR5:n kautta, on todettu erinomaiseksi immunoterapian adjuvantiksi141. Ryhmämme hoiti paksusuolisyöpää kantavia hiiriä heikennetyllä ΔppGpp S. Typhimurium -kannalla, joka ilmentää heterologista flagelliinia, ja osoitti, että se tehostaa kasvainvastaista immuniteettia TLR4- ja TLR5-signalointireittien yhteistyön kautta. Tämä lähestymistapa edistää myös M2-M1-siirtymää makrofageissa ja lisää typpioksidipitoisuuksia kasvaimissa20.
Kasvaimiin liittyviä antigeenejä ilmentävät keinotekoiset bakteerit voivat herkistää TME:t ja voittaa säätelytoimintaa harjoittavien T-solujen herättämän itsetoleranssin, jolloin ne saavat aikaan efektori- ja muisti-T-soluvasteet antigeenejä tuottavia kasvainsoluja kohtaan142,143. On raportoitu useita eturauhassyöpään liittyviä antigeenejä. Bakteeripohjaisia rokotteita eturauhaspesifistä antigeenia (PSA) vastaan on testattu useissa hiirimalleissa139,144. Endogeenisen PSA-geenin toimittaminen heikennetyn S. Typhimurium SL7207 -geenin avulla poisti immuunitoleranssin hiiren eturauhasen kantasolujen antigeeneille ja hidasti merkittävästi kasvaimen kasvua84. HER-2/neu143-, NY-ESO-183-, survivin-88- ja Mage-b145-antigeenejä käyttävät geeniterapiamenetelmät ovat myös osoittaneet lupaavia kasvaimen estovaikutuksia.
Suuri kiinnostus on kehittynyt immuunitarkistuspisteitä estävän (ICB) syöpähoidon alalla. Huolimatta ICB-hoidon menestyksestä kliinisissä tutkimuksissa vain osa potilaista hyötyy tästä hoidosta. Tämän vaikutuksen taustalla olevaan isännän vastustuskykyyn on useita syitä, joista immunosuppressiivinen TME on tärkein146,147. Tutkimukset osoittavat, että bakteerien aiheuttama kasvainkolonisaatio voi indusoida proinflammatorisia reaktioita, joihin liittyy IL-1β:n, TNF-α:n ja IFN-γ:n kohonnut ilmentyminen sekä NK- ja T-solujen aktivoituminen; siksi ICB- ja bakteerihoitojen yhdistelmällä voidaan voittaa isännän resistenssi131.
Kasvaimen stroomaan kohdistaminen
Angiogeneesillä on tärkeä merkitys kasvaimen kasvussa ja etäpesäkkeiden muodostuksessa. Kasvaimen neovaskularisaatioon kohdistaminen tarjoaa lupaavan suunnan syöpähoidolle. Endostatiini on tyypin XVIII kollageenin 20 kDa:n C-terminaalinen fragmentti, joka voi estää kasvaimen verisuonten muodostumista annosriippuvaisesti ilman ilmeisiä sivuvaikutuksia tai lääkeresistenssiä148,149. Xu et al. kloonasivat endostatiinin ja siRNA:n transkription signaalinmuuntimen ja aktivaattorin 3 (Stat3) vastaan heikennetyssä S. Typhimurium -kannassa. Sen jälkeen he testasivat kannan terapeuttista tehoa ortotrooppisessa HCC:ssä ja osoittivat, että se pystyi estämään kasvaimen proliferaatiota ja metastaasien muodostumista, vähentämään kasvaimen mikrovaskulaation määrää, lisäämään CD4+/CD8+ T-solupopulaatioita ja useiden tulehduksellisten sytokiinien ilmentymistasoja (mukaan luettuina IFN-γ ja TNF-α) sekä alentamaan TGF-β:n, säätelytoimintaa harjoittavien T-solujen ja vaskulaarisen endoteelisolujen kasvutekijän ilmentymää (VEGF)149. VEGF ja sen reseptori (VEGFR) säätelevät kasvainten angiogeneesiä121,145. Solunulkoista VEGFR2-domeenia ilmentävän heikennetyn S. Typhimurium SL3261:n oraalinen anto esti kasvaimen kasvua, neovaskularisaatiota ja keuhkometastasointia. Lisäksi CD4+- ja CD8+-T-solujen prosenttiosuudet kasvaimen alueella kasvoivat merkittävästi121. Endogliini (CD105) kuuluu TGF-β-reseptoriperheeseen. TGF-β1 ja hypoksia voivat säätää endogliinigeenin promoottoria ylöspäin, ja tämä promoottori on erittäin aktiivinen kasvainendoteelisoluissa. Siksi endogliiniä on pidetty syöpähoidon kohteena150. Paterson ym. käyttivät Listeria-pohjaisia rokotteita CD105:tä, Lm-LLO-CD105A:ta ja Lm-LLO-CD105B:tä vastaan rintasyövän hoitoon hiirimallissa. Rokotteet stimuloivat voimakasta antiangiogeneesivaikutusta ja kasvaimen vastaista immuunivastetta, joka esti primaarisia ja metastaattisia kasvaimia151.
geenin vaimentaminen
siRNA:t, luokka 20-25 emäsparin pituisia kaksijuosteisia RNA:ita, jotka välittävät spesifisten kohdegeenien vaimentamista, ovat tarjonneet lupaavan lähestymistavan syövän hoitoon. RNA-interferenssihoidon suurin este on kuitenkin se, että siRNA:t on toimitettava spesifisesti kasvaimen alueelle. Hiirten kasvainmalleissa on testattu bakteeripohjaisia siirtojärjestelmiä stat363,122,149,152, IDO153,154, survivin155, Sox230 ja solusykliin liittyvää polo-like-kinaasi 1:tä (PLK1)57 vastaan suunnatuille siRNA:ille. Heikennetyn S. Typhimurium -kannan, jossa on siRNA-Stat3:aa koodaava eukaryoottinen ekspressioplasmidi, oraalinen anto paransi NK-solujen aktiivisuutta ja T-lymfosyyttien toimintaa ja lisäsi CD8+ T-solujen prosenttiosuutta, kun taas se vähensi CD4+ CD25+ säätelytyypin T-solujen lukumäärää kasvaimessa; nämä vaikutukset johtivat kasvaimen kasvun hidastumiseen ja kasvainta kantavien hiirten eloonjäämisajan pidentymiseen122. Isännän IDO-ekspression vaimentaminen shIDO:ta ilmentävällä S. Typhimurium VNP20009 -kannalla sai aikaan ROS:ia tuottavien polymorfonukleaaristen neutrofiilien merkittävän kasvaininfiltraation, mikä edisti kasvainsisäistä solukuolemaa ja B16F10-melanoomien153 ja CT26- tai MC38-paksusuolisyöpien merkittävää hallintaa156.