Rychlá metoda kvantifikace volného a vázaného acetátu na základě alkylace a GC-MS analýzy

Popis metody

Vyvinuli jsme robustní a vysoce výkonnou metodu pro absolutní kvantifikaci acetátu v biologických vzorcích. Metoda je založena na derivatizaci pomocí zavedené reakce s methylchloroformiátem (MCF) . Po postupném přidání vnitřního standardu, 1-propanolu, pyridinu a hydroxidu sodného je derivatizační reakce zahájena co nejdříve přidáním MCF. Chemická modifikace probíhá za zásaditých podmínek díky přítomnosti hydroxidu sodného, zatímco pyridin udržuje reakční systém homogenní, protože MCF se nerozpouští v samotné vodě (obr. 1). 1-Propanol se používá jako spojovací činidlo k výrobě propyl-acetátu (obr. 2). Pokud se k ochlazenému vzorku bezprostředně před přidáním MCF přidá hydroxid sodný, nedochází k hydrolýze (viz níže). Alkylace acetátu pomocí MCF usnadňuje rychlou další modifikaci acetátu ve vodných podmínkách. V tomto případě je meziprodukt acetát-MCF (I) atakován alkoholem (1-propanolem) a vzniklý meziprodukt (II) podléhá dalším přeskupením, což vede ke vzniku propyl-acetátu. Takovéto derivatizační postupy využívající skupinu chloroformiátových činidel jsou dobře popsány. Pro kvantifikaci výtěžku derivatizace a následné extrakce do MTBE jsme porovnali intenzitu MS signálu 1 mM acetátu alkylovaného na propyl-acetát s ekvimolární koncentrací komerčně získaného propyl-acetátu v MTBE. Na základě toho jsme zjistili, že výtěžnost je 95,5 ± 1,57 % (Additional file 1: Table S1).

Derivatizační reakce s MCF je prudká a exotermická, přičemž vznikají plyny (chlorovodík, oxid uhličitý), které způsobují zvýšení tlaku ve zkumavce. Proto doporučujeme při provádění chemické derivatizace dodržovat obecná pravidla bezpečnosti a ochrany zdraví, tj. nosit laboratorní plášť, rukavice a ochranné brýle a reakci provádět v digestoři. Pro minimalizaci prudkosti reakce, a tedy i tlaku, je důležité vzorek před derivatizací inkubovat na ledu (5 min). Během vortexování doporučujeme držet víčko zavřené jedním prstem a poté zkumavku opatrně otevřít (může být slyšet „praskání“). Alternativně lze zkumavku během vortexování ponechat otevřenou, záleží na preferencích výzkumníka (zjistili jsme, že při opatrné manipulaci se obsah zkumavky nerozlévá). Poté lze derivatizovaný acetát (propyl-acetát) snadno extrahovat do organického rozpouštědla (MTBE) a následně provést analýzu GC-MS (obr. 1).

K derivatizaci lze použít i jiné primární alkoholy (např. methanol a ethanol, z nichž vzniká methyl-, resp. ethylacetát). Zjistili jsme však, že s naší středně polární GC kolonou (kterou považujeme za velmi vhodnou pro analýzu širokého spektra metabolitů) poskytuje propyl-acetát optimální tvar píku a retenční čas pro rychlou analýzu. Zde popsaný protokol přípravy vzorku je velmi rychlý s celkovou dobou derivatizace kratší než 1 min na vzorek. Spolu s krátkým programem GC-MS s celkovou dobou běhu 4 min na vzorek to usnadňuje vysoce výkonnou analýzu. Zatímco acetátové izotopology 12C-acetát, U-13C-acetát a 2H3-acetát mají téměř identické retenční časy, jejich píky lze snadno dekonvolutovat pomocí specifických iontů (obr. 3). Jak je obecně pozorováno při GC analýze deuterovaných analytů, derivát 2H3-acetátu má o něco kratší retenční čas v důsledku inverzního izotopového efektu . Ionty m/z 61, 63 a 64 pro 12C2-acetát, U-13C2-acetát a 2H3-acetát byly použity pro absolutní kvantifikaci a vykazovaly optimální lineární odezvu.

Validace metody

Pro posouzení opakovatelnosti přípravy vzorku a postupu analýzy jsme stanovili relativní směrodatnou odchylku (RSD) pro 12C- a U-13C-acetát v čerstvě připravených standardech při 50, 200 a 1000 μM pro příslušné izotopology acetátu. Metoda vykazovala vynikající opakovatelnost s RSD < 5 % pro standardy a < 10 % pro biologické vzorky (doplňkový soubor 1: tabulka S2). Lineární rozsah kvantifikace byl posouzen analýzou sériově ředěných standardů 12C- i U-13C-acetátu v rozsahu 2-2000 μM. Pro 12C-acetát se nám nepodařilo stanovit mez detekce (LOD), protože v našich vzorcích byl vždy přítomen signál acetátu v pozadí o hodnotě přibližně 15 μM, přestože byla použita pouze činidla nejvyšší čistoty. Zdá se, že acetát je běžnou stopovou kontaminující látkou v atmosféře a v činidlech, stejně jako v plastu a ve skle, podobně jako to bylo pozorováno u mastných kyselin s delším řetězcem. Abychom tuto skutečnost dále prozkoumali, snažili jsme se určit přesné zdroje acetátu v pozadí (doplňkový soubor 1: obrázek S1). Jelikož analyzujeme acetát v jeho derivatizované propyl-acetátové formě, signál pozadí, který běžně pozorujeme, může pocházet buď přímo z propyl-acetátu, nebo z acetátu pozadí, který je během přípravy vzorku derivatizován na propyl-acetát. Abychom zjistili přítomnost propyl-acetátu v pozadí, provedli jsme experiment v plastovém i skleněném nádobí, kde jsme analyzovali hladinu propyl-acetátu v činidlech použitých pro chemickou derivatizaci. Zjistili jsme, že 1-propanol má nejvyšší obsah propyl-acetátu na pozadí, ale že tvoří pouze ~ 10 % acetátu na pozadí pozorovaného ve slepých vzorcích postupu (PB, tj. slepých vzorcích, které byly podrobeny celému postupu přípravy vzorku a hmotnostní spec. analýzy), což naznačuje, že hlavním kontaminantem je volný acetát, nikoli propyl-acetát. Bohužel všechna činidla jsou potřebná pro derivatizaci, takže nejsme schopni určit, které činidlo obsahuje nejvíce acetátu v pozadí. Celý postup derivatizace a extrakce jsme však provedli na slepých vzorcích ve skleněných i plastových zkumavkách. Zjistili jsme, že v plastových zkumavkách je výsledné acetátové pozadí o ~ 50 % vyšší než ve skleněných. Vzhledem k jeho pohodlnosti stále dáváme přednost práci s plastovými zkumavkami a toto rozhodnutí ponecháváme na individuálním zkoušejícím.

Nezávisle na acetátovém pozadí, protože odezva se ukázala jako vysoce lineární, jsme byli schopni odečíst signál pozadí (acetátové pozadí kvantifikujeme pomocí slepých vzorků, které byly podrobeny celému postupu přípravy vzorku a hmotnostní spec. analýzy, tj. slepých vzorků postupu), což vedlo k lineárnímu dynamickému rozsahu od 2 do 2000 μM pro 12C-acetát i U-13C-acetát. Stanovený limit kvantifikace (LOQ) pro U-13C-acetát byl 0,1 μM. Aby se kontaminace 12C-acetátem snížila na minimum, doporučujeme pravidelně (každý týden) připravovat čerstvá činidla a také doporučujeme rutinně zařazovat slepé pokusy. Za zmínku stojí, že uživatelům doporučujeme kvantifikovat vlastní signál acetátového pozadí, protože závisí na použitých materiálech a činidlech, a proto je velmi pravděpodobné, že je specifický pro danou laboratoř.

Považujeme náš přístup za optimalizovanou alternativu k jiným publikovaným derivatizačním metodám, pro rychlé měření acetátu . Přístup založený na silylaci acetátu pomocí N-terc-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamidu (MTBSTFA) ukázal široký lineární rozsah pro kvantifikaci acetátu (0-3500 μM), vysokou opakovatelnost a nízkou relativní směrodatnou odchylku (RSD < 5 %) . Není však vhodná pro zpracování vzorků na bázi vody, vícenásobné extrakční kroky mohou vést k vysokým hladinám acetátu v pozadí a doba běhu MS je dlouhá pro analýzu samotného acetátu. Přístup založený na alkylaci pomocí propylchloroformiátu (PCF) je podobný našemu, pokud jde o metodiku a analytický výkon, ale používá větší objemy činidel (což zvyšuje riziko vysokých hladin acetátu na pozadí) a delší dobu běhu MS, protože nebyl optimalizován speciálně pro acetát, a neuvádí mravenčany. Publikovaný dolní limit kvantifikace byl srovnatelný s naší metodou (15 μM u současné metody oproti 16 μM, které uvádí Zheng et al. ). Zheng et al. uvedli širší rozsah lineární odezvy, tj. 16 μM-8 mM. My jsme netestovali více než 2 mM, protože jsme tak vysoké hladiny ve fyziologickém kontextu nepozorovali. Bylo zjištěno, že uváděná opakovatelnost je velmi podobná s 0,54 % RSD (n = 6), kterou uvádí Zheng et al. , a ~0,7 % RSD (n = 3) v závislosti na koncentraci acetátu, kterou uvádí současná metoda pro standardní vzorky (relativní směrodatné odchylky jsou shrnuty v doplňkovém souboru 1: tabulka S2). A konečně, další metoda založená na GC-MS pro analýzu mastných kyselin s krátkým řetězcem používala jako kondenzační činidla 2,4-difluoroanilin a 1,3-diklokarbodiimid, což vyžadovalo 1hodinový inkubační krok . Celkově lze říci, že předkládaná práce přináší kromě již publikovaných metod následující : (1) optimalizovanou metodu pro acetát a také upravenou metodu pro měření mravenčanu, (2) podrobnou diskusi o acetátu na pozadí, jeho možných zdrojích a o tom, jak se s ním prakticky vypořádat, a (3) přístup k měření nejen volného acetátu, ale také vázaného acetátu.

Protokol přípravy vzorku zahrnuje přídavek hydroxidu sodného pro usnadnění alkylační reakce. Ačkoli k tomu dochází bezprostředně před derivatizační reakcí a vzorky jsou chlazeny, mohlo by to potenciálně vést k nežádoucí hydrolýze acetylovaných biomolekul, což by vedlo ke zvýšení hladiny volného acetátu. Abychom otestovali, zda k tomu dochází, provedli jsme přípravu a analýzu vzorků na 10 mM roztocích N-acetyl-l-asparagové kyseliny (NAA) a N-acetyl-l-cysteinu (NAC), 1 g/l BSA a také na slepých vzorcích. Jelikož je acetylace aminokyselin nejhojnějším zdrojem vázaného acetátu a nepozorovali jsme výrazné zvýšení signálu, dospěli jsme k závěru, že příspěvek hydrolyzovaného vázaného acetátu je zanedbatelný (obr. 4).

Kvantifikace acetátu v biologických vzorcích

Po zjištění, že naše metoda dokáže přesně a reprodukovatelně kvantifikovat acetát, jsme dále chtěli zjistit, zda dokáže reprodukovat dříve zjištěné výsledky. Kvantifikovali jsme proto acetát v plazmě osmi zdravých jedinců. Koncentrace acetátu v plazmě se pohybovaly od 20 do 51 μM s mediánem koncentrace 34,1 ± 9,0 μM (údaje nejsou uvedeny). To spadá do dříve publikovaných hodnot 41,9 ± 15,1 μM a 30,4 ± 9,0 μM (Human Metabolome Database ).

Nedávno bylo v mnoha studiích zjištěno, že enzym acetyl-CoA syntetáza 2 (ACSS2) hraje důležitou roli při zprostředkování růstu nádorů během hypoxických a živinami omezených podmínek . ACSS2 „aktivuje“ acetát na AcCoA, aby mohl být využit pro navazující metabolické reakce, včetně lipogeneze. Přidání U-13C-acetátu do média kultivovaných nádorových buněk skutečně odhalilo zvýšené značení lipogenního AcCoA a následně mastných kyselin v hypoxických podmínkách oproti normoxickým . Do jaké míry je toto zvýšené značení způsobeno zvýšeným příjmem acetátu, však není známo. Abychom se touto otázkou zabývali, kultivovali jsme buňky karcinomu plic A549 v normoxických nebo hypoxických (1 % O2) podmínkách v médiu obsahujícím 500 μM U-13C-acetátu a sledovali jeho koncentraci v čase pomocí naší nové metody (obr. 5). V souladu s pozorovaným značením lipogenního AcCoA z U-13C-acetátu byla pozorována silná spotřeba U-13C-acetátu hypoxickými buňkami, o čemž svědčí zřetelný pokles v médiu. Překvapivě, zatímco značení lipogenního AcCoA v normoxických podmínkách je podstatně nižší než v hypoxii , normoxické buňky rovněž vykazovaly evidentní spotřebu U-13C-acetátu. Míra absorpce acetátu byla u hypoxických buněk s 2,5 ± 0,1 nmole/h/μl buněk (PCV) mírně vyšší než u normoxických buněk (1,9 ± 0,1 nmole/h/μl buněk). Tyto výsledky naznačují, že zvýšené značení lipogenního AcCoA z U-13C-acetátu při hypoxii (~3násobné zvýšení, údaje nejsou uvedeny) nelze plně vysvětlit zvýšeným vychytáváním acetátu. Místo toho je zvýšené značení pravděpodobně částečně způsobeno poklesem produkce lipogenního AcCoA z glukózy v hypoxických buňkách, což vede k inflaci relativního příspěvku acetátu. Tuto skutečnost právě dále zkoumáme.

Koncentrace volného acetátu v myších tkáních a tekutinách

Experimenty s izotopovým sledováním in vivo prokázaly využití exogenního acetátu nádory , což potvrzuje kritickou roli ACSS2 při zprostředkování růstu u různých druhů rakoviny. Dostupnost acetátu pro solidní nádory a její rozdílnost mezi jednotlivými hostitelskými orgány však zůstává z velké části neznámá. Ve snaze vyřešit tuto otázku jsme analyzovali tkáně z více myších (C57BL/6) orgánů (srdce, ledviny, játra, plíce, slinivka, slezina, brzlík) a také plazmu a moč (obr. 6). Ze všech analyzovaných orgánů obsahovala játra nejvyšší koncentraci volného acetátu s průměrnou koncentrací 1,0 ± 0,1 nmole acetátu na mg tkáně (tj. ~1 mM), což je více než dvakrát více než v jakékoli jiné tkáni. Živiny absorbované střevem nejprve projdou portální žilou játry. Bylo zjištěno, že vysoké milimolární koncentrace acetátu a dalších mastných kyselin s krátkým řetězcem jsou vytvářeny střevní mikrobiotou , což poskytuje důvod pro vysokou koncentraci acetátu v játrech. Vzhledem k tomu, že koncentrace acetátu v játrech je mnohem vyšší než v systémovém oběhu (tj. v plazmě) a v plicích, které obsahují první kapilární systém, který je po průchodu játry prokrven, zdá se, že játra zachycují značné množství acetátu pro metabolické využití. Acetát byl také výrazně obohacen ve slinivce břišní a ledvinách ve srovnání s plazmou, s koncentracemi 0,5 ± 0,04 a 0,4 ± 0,06 nmole/mg (~0,5 a 0,4 mM). Důvod vysokého obsahu acetátu ve slinivce břišní je třeba ještě objasnit. Jednou z funkcí ledvin je odstraňovat z krve nadbytečné nebo toxické metabolity rozpustné ve vodě a vzhledem k tomu, že koncentrace acetátu v moči je podstatně vyšší než v plazmě, může být acetát skutečně aktivně vylučován z těla jako metabolický „odpad“. Hladiny acetátu byly v ostatních tkáních podstatně nižší, přičemž nejnižší hodnota byla zjištěna ve slezině v koncentraci podobné plazmě. Tato pozorování společně zdůrazňují, že dostupnost acetátu se může v jednotlivých orgánech značně lišit, což má důsledky pro metabolismus nádorů.

Analýza vázaného acetátu v (sub)buněčných a histonových frakcích

AcCoA zaujímá centrální uzel v metabolismu a podílí se na syntéze biomasy, katabolických drahách a produkci energie. Z tohoto důvodu hraje AcCoA důležitou roli v regulaci metabolismu . K tomu dochází částečně prostřednictvím acetylace biomolekul, včetně řady proteinů . Například acetylace histonů podporuje transkripci genů a byla pozorována korelace mezi stupněm acetylace histonů a agresivitou nádorů . Další důkaz o významu homeostázy acetylace v progresi rakoviny pochází z pozorování, že narušení dynamiky acetylace inhibicí deacetyláz (tj. HDAC, sirtuinů) vede k silné indukci smrti nádorových buněk . Přestože je řada aspektů acetylace intenzivně studována, stále není mnoho známo o absolutní velikosti poolu a obratu acetátu vázaného na biomolekuly v různých buněčných kompartmentech, natož o tom, jak jsou ovlivněny nádorově relevantními podmínkami. Abychom se touto otázkou zabývali, zkombinovali jsme náš přístup s hydrolýzou v základních podmínkách. Zahřátím vzorků a jejich inkubací přes noc s hydroxidem sodným dochází k hydrolyzaci esterových vazeb a uvolnění volného acetátu, který lze následně derivatizovat a analyzovat jako dříve. Použití tohoto přístupu na extraktu celých buněk nám umožnilo kvantifikovat celkový (vázaný + volný) acetát v buňkách A549 při 0,38 μmol/mg celkového buněčného proteinu. Dále jsme si položili otázku, zda by bylo možné kvantifikovat vázaný acetát v oddělených buněčných kompartmentech. Pomocí komerčního kitu pro izolaci jader (viz oddíl „Metody“) jsme dosáhli téměř úplného oddělení jaderné a zbytkové buněčné frakce (kombinace cytosolu a organel jiných než jádro) (obr. 7b). Zjistili jsme, že obsah vázaného acetátu byl přibližně stejný pro jadernou a zbytkovou frakci (obr. 7c). Součet obou frakcí se rovnal ~80 % celobuněčného měření, což je s největší pravděpodobností způsobeno sníženou výtěžností během frakcionace, ale může být také způsobeno ztrátou volného acetátu. Vyjádření obsahu acetátu na mg proteinu v každé frakci ukázalo, že hustota acetylace v jádře je přibližně třikrát vyšší než ve zbytkové buněčné frakci (obr. 7d). Je známo, že histony jsou silně acetylovány, a abychom určili, jak velká část jaderného acetátu byla vázána na histony, porovnali jsme výsledky postupu izolace jader s publikovaným protokolem extrakce kyselých histonů (obr. 7e-g) . Oba přístupy poskytly velmi podobné hodnoty, což naznačuje, že téměř veškerý vázaný acetát v jaderné frakci je způsoben acetylací histonů. Samotná acetylace histonů tedy představuje polovinu celkového buněčného acetátu.

Tento přístup ke kvantifikaci acetátu vázaného na histony může pomoci lépe pochopit vliv acetylace histonů v různých studiích souvisejících s rakovinou. Abychom prokázali užitečnost tohoto přístupu, ošetřili jsme buňky A549 panobinostatem, inhibitorem pan-histon deacetylázy (HDAC). Krátká, 4hodinová inkubace s panobinostatem způsobila téměř zdvojnásobení množství acetátu vázaného na histony, což ukazuje, že obrat v acetylaci histonů je poměrně rychlý (obr. 7h).

Měření mravenčanu a dalších mastných kyselin s krátkým řetězcem

Modifikací derivatizačního činidla lze metodu snadno přizpůsobit dalším mastným kyselinám s krátkým řetězcem, včetně mravenčanu. Spojením mravenčanu s benzylalkoholem vzniká derivát mravenčanu (benzylformiát), který lze snadno analyzovat pomocí GC-MS (viz doplňkové experimentální postupy Additional file 1: S1). Již dříve jsme zmínili, že metoda GC-MS pro analýzu acetátu trvá pouze 4 min, přičemž hmotnostní detektor pracuje mezi 2,2 a 2,7 min. Stejná metoda je schopna analyzovat a kvantifikovat propionát a butyrát ve formě propyl-propionátu a propyl-butyrátu za použití stejného nastavení metody derivatizace vzorku jako pro acetát. Prodloužením doby provozu hmotnostního detektoru z 2,2 na 4 min jsme byli schopni detekovat píky propionátu a butyrátu eluující při 2,92, resp. 3,30 min. Pomocí iontů m/z 75, resp. 89 pro propionát a butyrát je možné tyto mastné kyseliny s krátkým řetězcem absolutně kvantifikovat

.