Come posso progettare i miei primer?

Uno dei fattori più importanti per il successo del sequenziamento automatizzato del DNA è la corretta progettazione dei primer. Questo documento descrive i passi coinvolti in questo processo e le principali insidie da evitare.

I primer di sequenziamento devono essere capaci di anneal al DNA target in una posizione prevedibile e su un filamento prevedibile. Inoltre devono essere in grado di essere estesi dalla Taq DNA Polymerase.

Alcune persone sono confuse su come esaminare una sequenza di DNA per scegliere una sequenza di primer appropriata. Ecco alcune cose da ricordare per i novizi:

• Le sequenze sono sempre scritte da 5′ a 3′. Questo include la sequenza del vostro DNA modello (se noto), la sequenza del DNA vettore in cui è inserito, e la sequenza dei primer proposti. Non scrivere mai una sequenza di primer invertita o confonderai solo te stesso e gli altri.
• La polimerasi estende sempre l’estremità 3′ del primer, e la sequenza che leggerai sarà lo stesso filamento (senso o antisenso) del primer stesso.
• Quindi, se scegliete una sequenza di primer che potete leggere nella vostra sequenza sorgente (per esempio, nel vettore), la sequenza che otterrete si estenderà dall’estremità destra (3′) del primer.
• Conversamente, se scegliete un primer dal filamento opposto a quello che legge la vostra sequenza ‘sorgente’, la sequenza risultante sarà letta verso sinistra.

Ecco un paio di esempi:

Supponiamo di avere un vettore con la seguente sequenza intorno al Multiple Cloning Site (il ‘MCS’):

 TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI

Se hai clonato il tuo DNA di interesse tra i siti BamHI e EcoRI, potresti sequenziare usando il primer ‘CTTGATGCTAGTACTACATC’ (ricorda – è scritto da 5′ a 3′) e otterrai la seguente sequenza dal Core:

 TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)

E se invece volessi una sequenza dall’altro filamento – da Eco a Bam -? In questo caso, dovete selezionare qualche sequenza sulla destra e poi invertire il complemento prima di richiedere l’oligo. Scegliendo qualche sequenza dalla figura sopra:

 CTGATGCTCATATGTTAATA

Questa NON è la sequenza del primer – è copiata testualmente dalla sequenza sopra. Infatti, se usaste questa sequenza per un primer, il sequenziamento procederebbe verso destra, lontano dal vostro inserto. Invece, invertire la sequenza:

 TATTAACATATGAGCATCAG

Ora questo dovrebbe produrre la sequenza del filamento opposto:

 CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)

Alcuni dettagli: Solo raramente il sequenziamento mostra effettivamente i nucleotidi immediatamente a valle del primer. Mi sono preso qualche licenza didattica negli esempi precedenti.

Concetti più avanzati: Come progettare un primer che funzioni.

Generalmente, si inizia con una piccola quantità di sequenza nota che si desidera estendere. Ecco come procedere:

I. Progettare primer solo a partire da dati di sequenza accurati. Il sequenziamento automatico (e in effetti qualsiasi sequenziamento) ha una probabilità finita di produrre errori. La sequenza ottenuta troppo lontana dal primer deve essere considerata discutibile. Per determinare cosa sia “troppo lontano”, suggeriamo vivamente ai nostri clienti di leggere il memo Interpretation of Sequencing Chromatograms, che descrive come valutare la validità dei dati ottenuti dai sequenziatori ABI. Selezionare una regione per il posizionamento del primer dove la possibilità di errore di sequenza è bassa. II. Limita la tua ricerca alle regioni che meglio riflettono i tuoi obiettivi.

Potresti essere interessato a massimizzare i dati di sequenza ottenuti, o potresti aver bisogno di esaminare la sequenza solo in una posizione molto specifica nel modello. Tali esigenze dettano posizionamenti di primer molto diversi.

1. Massimizzare la sequenza ottenuta minimizzando il potenziale di errori:
   Generalmente, si dovrebbe progettare il primer il più lontano al 3′ come si può gestire fino a quando si ha fiducia nella precisione della sequenza da cui il primer è tratto. I primer su filamenti opposti dovrebbero essere posizionati in modo sfalsato il più possibile.
2. Sequenziamento mirato di una regione specifica:
   Posizionare il primer in modo che la sequenza desiderata cada nella regione più accurata del cromatogramma. I dati di sequenza sono spesso più accurati a circa 80-150 nucleotidi di distanza dal primer. Non contare di vedere una buona sequenza a meno di 50 nucleotidi dal primer o a più di 300 nt di distanza (anche se spesso otteniamo una sequenza che inizia immediatamente dopo il primer, e spesso restituiamo 700 nt di sequenza accurata).

III. Individuare i primer candidati:

Identifica i potenziali primer di sequenziamento che producono un accoppiamento di base stabile con il DNA modello in condizioni appropriate per il sequenziamento del ciclo. E’ fortemente suggerito che tu usi un computer in questo passo. Caratteristiche suggerite del primer:

1. La lunghezza dovrebbe essere compresa tra 18 e 30 nt, con l’optimum di 20-25 nt. (Anche se abbiamo avuto alcuni successi con primer più lunghi di 30 e più corti di 18).
2. Il contenuto di G-C del 40-60% è desiderabile.
3. La Tm dovrebbe essere tra 55 C e 75 C. Attenzione: la vecchia regola “4 gradi per ogni G-C, 2 gradi per ogni A-T” funziona male, specialmente per oligo più corti di 20 o più lunghi di 25 nt. Invece, prova:

    Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)

   C’è un calcolatore Tm basato sul web che potresti provare a http://www.rnature.com/oligonucleotide.html.

IV. Scartare i primer candidati che mostrano un’autoibridazione indesiderata.

I primer che possono auto-ibridarsi non saranno disponibili per l’ibridazione al modello. Generalmente evitare primer che possono formare 4 o più legami consecutivi con se stessi, o 8 o più legami totali. Esempio di un primer marginalmente problematico:

 5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'

Questo oligo forma un dimero sostanzialmente stabile con se stesso, con quattro legami consecutivi in due punti e un totale di otto legami inter-strand.

I primer con estremità 3′ che si ibridizzano anche transitoriamente si estenderanno a causa dell’azione della polimerasi, rovinando così il primer e generando false bande. Siate un po’ più rigorosi nell’evitare dimeri 3′. Per esempio, il seguente primer si autodimerizza con una perfetta ibridazione in 3′ su se stesso:

 5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'

L’oligo di cui sopra è piuttosto cattivo, e quasi garantito per causare problemi. Si noti che la polimerasi estenderà l’estremità 3′ durante la reazione di sequenziamento, dando una sequenza molto forte ACTATGC. Queste bande appariranno all’inizio dei vostri dati ‘reali’ come picchi immensi, occludendo la sequenza corretta. La maggior parte dei programmi di progettazione dei primer individuerà correttamente tali primer autodimerizzanti e vi avvertirà di evitarli.

Nota comunque che nessun programma per computer o regola del pollice può prevedere con precisione il successo o il fallimento di un primer. Un primer che sembra marginale può funzionare bene, mentre un altro che sembra essere impeccabile può non funzionare affatto. Evitate problemi evidenti, progettate i migliori primer che potete, ma in caso di necessità, se avete poche opzioni, provate solo alcuni primer candidati, indipendentemente dai potenziali difetti.

V. Verificate la sito-specificità del primer. Esegui una ricerca di omologia di sequenza (ad esempio, confronto di omologia dot-plot) attraverso tutte le sequenze di template conosciute per verificare la presenza di siti di priming alternativi. Scartare qualsiasi primer che mostri una tendenza “significativa” a legarsi a tali siti. Possiamo fornire solo linee guida approssimative su cosa sia “significativo”. Evitare i primer in cui sono presenti siti alternativi con (1) più del 90% di omologia con il sito primario o (2) più di 7 nucleotidi consecutivi omologhi all’estremità 3′ o (3) abbondanza maggiore di 5 volte rispetto al sito di priming previsto. VI. Scegliere tra i primer candidati.

Se a questo punto avete diversi primer candidati, potreste selezionarne uno o alcuni che sono più ricchi di A-T all’estremità 3′. Questi tendono ad essere leggermente più specifici in azione, secondo alcuni ricercatori. Potreste voler usare più di un primer, massimizzando le probabilità di successo.

Se non avete candidati che sono sopravvissuti ai criteri di cui sopra, allora potreste essere costretti ad allentare la severità dei requisiti di selezione. In definitiva, la prova di un buon primer è solo nel suo uso, e non può essere accuratamente prevista da queste semplicistiche regole del pollice.

Con un po’ di fortuna, però, avete molte opzioni per i primer. Per un progetto di assemblaggio di sequenze, progettate più primer di quelli di cui pensate di avere realmente bisogno, in modo che se la sequenza non è così lunga come speravate, potreste comunque ottenere dati di sovrapposizione sufficienti ad assicurarvi un buon consenso di sequenza. Ti consigliamo di sequenziare entrambi i filamenti, per una migliore conferma. Su un filamento, spaziate i primer da 500 a 700 nt (una spaziatura più corta è più sicura!). Sul filamento opposto, posiziona i primer in modo sfalsato rispetto ai primer del primo filamento, come illustrato di seguito: