Hvordan designer jeg mine egne primere?

En af de vigtigste faktorer for en vellykket automatiseret DNA-sekventering er et korrekt primerdesign. Dette dokument beskriver de trin, der indgår i denne proces, og de vigtigste faldgruber, der skal undgås.

Sequencing primere skal kunne annealere til mål-DNA’et på et forudsigeligt sted og på en forudsigelig streng. De skal desuden være i stand til at blive forlænget af Taq DNA-polymerase.

Nogle mennesker er forvirrede over, hvordan de skal undersøge en DNA-sekvens for at vælge en passende primersekvens. Her er et par ting, som nybegyndere skal huske:

• Sekvenser skrives altid fra 5′ til 3′. Dette omfatter sekvensen af dit skabelon-DNA (hvis den er kendt), sekvensen af det vektor-DNA, som det indsættes i, og sekvensen af de foreslåede primere. Skriv aldrig en primersekvens omvendt, ellers vil du kun forvirre dig selv og andre.
• Polymerase forlænger altid 3′-enden af primeren, og den sekvens, du vil aflæse, vil være den samme streng (sense eller anti-sense) som selve primeren.
• Hvis du således vælger en primersekvens, som du kan aflæse i din kildesekvens (f.eks. i vektoren), vil den sekvens, du får, strække sig fra primerens højre (3′)-ende.
• Omvendt, hvis du vælger en primer fra den streng, der er modsat af den, som din “kilde”-sekvens læser, vil den resulterende sekvens læses mod venstre.

Her er et par eksempler:

Sæt, at du har en vektor med følgende sekvens omkring det multiple kloningssted (“MCS”):

 TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI

Hvis du klonede dit DNA af interesse mellem BamHI- og EcoRI-stederne, kunne du sekventere ved hjælp af primeren ‘CTTGATGCTAGTACTACTACATC’ (husk – det er skrevet 5′ til 3′), og du vil få følgende sekvens fra kernen:

 TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)

Hvad nu, hvis du i stedet ønskede sekvens fra den anden streng – Eco til Bam – i stedet? I så fald skal du vælge en sekvens til højre og derefter reverse-komplementere den, inden du anmoder om oligoen. Udvælgelse af en sekvens fra figuren ovenfor:

 CTGATGCTCATATGTTAATA

Dette er IKKE primersekvensen – den er ordret kopieret fra ovenstående sekvens. Hvis du brugte denne sekvens til en primer, ville sekventeringen faktisk fortsætte mod højre, væk fra dit insert. I stedet skal du omvendt komplimentere denne sekvens:

 TATTAACATATGAGCATCAG

Nu skulle dette give sekvensen for den modsatte streng:

 CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)

Nogle fine print: Det er kun sjældent, at sekventering faktisk viser nukleotiderne umiddelbart nedstrøms fra primeren. Jeg har taget mig en vis didaktisk frihed i eksemplerne ovenfor.

Mere avancerede koncepter:

Generelt starter man med en lille mængde kendt sekvens, som man ønsker at udvide. Her er, hvordan du skal gå frem:

I. Design kun primere ud fra nøjagtige sekvensdata. Automatiseret sekventering (og i virkeligheden enhver sekventering) har en begrænset sandsynlighed for at producere fejl. Den sekvens, der er opnået for langt væk fra primeren, må betragtes som tvivlsom. For at afgøre, hvad der er “for langt”, anbefaler vi på det kraftigste, at vores kunder læser notatet Interpretation of Sequencing Chromatograms, som beskriver, hvordan man vurderer gyldigheden af data, der er opnået fra ABI-sequencere. Vælg et område til primerplacering, hvor muligheden for sekvensfejl er lille. II. Begræns din søgning til de regioner, der bedst afspejler dine mål.

Du er måske interesseret i at maksimere de opnåede sekvensdata, eller du har måske kun brug for at undersøge sekvensen på et meget specifikt sted i skabelonen. Sådanne behov dikterer meget forskellige primerplaceringer.

1. Maximér den opnåede sekvens, samtidig med at du minimerer risikoen for fejl:
   Generelt set bør du designe primeren så langt ud til 3′ som muligt, så længe du har tillid til nøjagtigheden af den sekvens, som primeren er udtaget fra. Primere på modsatte strenge bør så vidt muligt placeres forskudt.
2. Målrettet sekventering af et specifikt område:
   Positioner primeren, så den ønskede sekvens falder i det mest nøjagtige område af kromatogrammet. Sekvensdata er ofte mest nøjagtige omkring 80-150 nukleotider væk fra primeren. Regn ikke med at se en god sekvens mindre end 50 nukleotider væk fra primeren eller mere end 300 nt væk (selv om vi ofte får sekvenser, der starter umiddelbart efter primeren, og vi får ofte 700 nt nøjagtig sekvens tilbage)

III. Lokalisering af kandidatprimere:

Identificer potentielle sekventeringsprimere, der frembringer stabil baseparring med skabelon-DNA’et under forhold, der er egnede til cyklus-sekventering. Det anbefales på det kraftigste, at du bruger en computer til dette trin. Foreslåede primeregenskaber:

1. Længden bør ligge mellem 18 og 30 nt, idet den optimale længde er 20-25 nt. (Vi har dog haft succes med primere, der er længere end 30 nt og kortere end 18 nt).
2. G-C-indhold på 40-60% er ønskeligt.
3. Tm bør ligge mellem 55 C og 75 C. Advarsel: Den gamle “4 grader for hver G-C, 2 grader for hver A-T”-regel fungerer dårligt, især for oligoer, der er kortere end 20 eller længere end 25 nt. Prøv i stedet:

    Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)

   Der findes en webbaseret Tm-beregner, som du kan prøve på http://www.rnature.com/oligonucleotide.html.

IV. Kassér kandidatprimer, der viser uønsket selvhybridisering.

Primere, der kan selfhybridisere, vil ikke være tilgængelige for hybridisering til skabelonen. Generelt undgås primere, der kan danne 4 eller flere på hinanden følgende bindinger med sig selv eller 8 eller flere bindinger i alt. Eksempel på en marginalt problematisk primer:

 5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'

Denne oligo danner en væsentlig stabil dimer med sig selv med fire på hinanden følgende bindinger to steder og i alt otte bindinger mellem strengene.

Primere med 3′-ender, der hybridiserer selv forbigående, vil blive forlænget som følge af polymerasepåvirkning, hvorved primeren ødelægges og der dannes falske bånd. Vær noget mere stringent med hensyn til at undgå 3′-dimere. For eksempel selvdimeriserer følgende primer med en perfekt 3′-hybridisering på sig selv:

 5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'

Den ovenstående oligo er temmelig dårlig og vil næsten med garanti give problemer. Bemærk, at polymerasen vil forlænge 3′-enden under sekventeringsreaktionen, hvilket giver en meget stærk sekvens ACTATGC. Disse bånd vil fremstå i starten af dine “rigtige” data som enorme toppe, der dækker over den korrekte sekvens. De fleste primerdesignprogrammer vil korrekt opdage sådanne selvdimeriserende primere og vil advare dig om at undgå dem.

Bemærk dog, at intet computerprogram eller nogen tommelfingerregelvurdering præcist kan forudsige hverken succes eller fiasko for en primer. En primer, der ser marginal ud, kan fungere godt, mens en anden, der ser ud til at være fejlfri, måske slet ikke fungerer. Undgå indlysende problemer, design de bedste primere, du kan, men i en nødsituation, hvis du har få muligheder, skal du bare prøve et par kandidatprimere, uanset potentielle fejl.

V. Kontroller primerens stedsspecificitet. Udfør en sekvenshomologisøgning (f.eks. dot-plot homologisammenligning) gennem alle kendte skabelonsekvenser for at kontrollere, om der findes alternative primersteder. Bortskaf alle primere, der viser en “betydelig” tendens til at binde til sådanne steder. Vi kan kun give grove retningslinjer for, hvad der er “signifikant”. Undgå primere, hvor der findes alternative steder med (1) mere end 90 % homologi med det primære sted eller (2) mere end 7 på hinanden følgende homologe nukleotider i 3′-enden eller (3) en hyppighed, der er mere end 5 gange højere end det tilsigtede primingsted. VI. Valg mellem kandidatprimere.

Hvis man på dette tidspunkt har flere kandidatprimere, kan man vælge en eller nogle få, som er mere A-T-rige i 3′-enden. Disse har tendens til at være lidt mere specifikke i deres virkning, ifølge nogle forskere. Det kan være, at du ønsker at bruge mere end én primer for at maksimere sandsynligheden for succes.

Hvis du ikke har nogen kandidater, der overlevede ovenstående kriterier, kan du blive tvunget til at lempe strengheden i udvælgelseskravene. I sidste ende er testen af en god primer kun i dens anvendelse, og den kan ikke forudsiges nøjagtigt ved hjælp af disse forsimplede tommelfingerregler.

Med held har du dog masser af muligheder for primere. I forbindelse med et sekvenssamlingsprojekt skal du designe flere primere, end du tror, du virkelig har brug for, så hvis sekvensen ikke er så lang, som du håbede, kan du stadig få tilstrækkeligt med overlappende data til at sikre dig en god sekvenskonsensus. Vi anbefaler, at du sekvenserer begge strenge for at opnå en bedre bekræftelse. På den ene streng skal primerne have en afstand på 500 til 700 nt (kortere afstand er mere sikkert!). På den modsatte streng placeres primerne forskudt væk fra primerne på den første streng, som vist nedenfor: