L’un des facteurs les plus importants pour la réussite du séquençage automatisé de l’ADN est la conception correcte des amorces. Ce document décrit les étapes de ce processus et les principaux pièges à éviter.
**** Utiliser un ordinateur pour concevoir des amorces ****
Nous recommandons fortement d’utiliser un ordinateur pendant la conception des amorces afin de vérifier certains défauts de conception fatals. De nombreux programmes sont capables d’effectuer cette analyse. Par exemple, recherchez ‘Primer3’ sur le web.
Quelques concepts de base : Si vous êtes confus par les brins et l’orientation des amorces, lisez ceci.
Les amorces de séquençage doivent être capables de s’hybrider à l’ADN cible à un endroit prévisible et sur un brin prévisible. Elles doivent en outre être capables d’extension par l’ADN polymérase Taq.
Certaines personnes ne savent pas comment examiner une séquence d’ADN pour choisir une séquence d’amorce appropriée. Voici quelques éléments à retenir pour les novices :
- Les séquences sont toujours écrites de 5′ à 3′. Cela inclut la séquence de votre ADN matrice (si elle est connue), la séquence de l’ADN vecteur dans lequel il est inséré, et la séquence des amorces proposées. N’écrivez jamais une séquence d’amorce à l’envers ou vous ne ferez que vous embrouiller vous-même et les autres.
- La polymérase prolonge toujours l’extrémité 3′ de l’amorce, et la séquence que vous lirez sera du même brin (sens ou anti-sens) que l’amorce elle-même.
- Ainsi, si vous choisissez une séquence d’amorce que vous pouvez lire dans votre séquence source (par exemple, dans le vecteur), la séquence que vous obtiendrez s’étendra à partir de l’extrémité droite (3′) de l’amorce.
- A l’inverse, si vous choisissez une amorce du brin opposé à ce que lit votre séquence ‘source’, la séquence obtenue se lira vers la gauche.
Voici quelques exemples :
Supposons que vous ayez un vecteur avec la séquence suivante autour du site de clonage multiple (le ‘MCS’) :
TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI
Si vous avez cloné votre ADN d’intérêt entre les sites BamHI et EcoRI, vous pourriez séquencer en utilisant l’amorce ‘CTTGATGCTAGTACTACATC’ (rappelez-vous – cela s’écrit de 5′ à 3′) et vous obtiendrez la séquence suivante à partir du noyau :
TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)
Que faire si vous voulez plutôt une séquence à partir de l’autre brin – Eco à Bam ? Dans ce cas, vous devez sélectionner une séquence sur la droite, puis la compléter de manière inverse avant de demander l’oligo. Sélection d’une séquence dans la figure ci-dessus :
CTGATGCTCATATGTTAATA
Ce n’est PAS la séquence d’amorce – elle est copiée mot pour mot de la séquence ci-dessus. En fait, si vous utilisiez cette séquence pour une amorce, le séquençage se ferait vers la droite, loin de votre insert. Au lieu de cela, complétez à l’envers cette séquence :
TATTAACATATGAGCATCAG
Cela devrait produire la séquence du brin opposé :
CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)
Quelques petits caractères : Ce n’est que rarement que le séquençage montre réellement les nucléotides immédiatement en aval de l’amorce. J’ai pris une certaine licence didactique dans les exemples ci-dessus.
Concepts plus avancés : Comment concevoir une amorce qui fonctionne.
Généralement, vous commencez avec une petite quantité de séquence connue que vous souhaitez étendre. Voici comment procéder :
I. Concevez des amorces uniquement à partir de données de séquence précises. Le séquençage automatisé (et en fait tout séquençage) a une probabilité finie de produire des erreurs. La séquence obtenue trop loin de l’amorce doit être considérée comme douteuse. Pour déterminer ce qui est « trop loin », nous suggérons fortement à nos clients de lire le mémo Interprétation des chromatogrammes de séquençage, qui décrit comment évaluer la validité des données obtenues à partir des séquenceurs ABI. Sélectionnez une région pour le placement des amorces où la possibilité d’erreur de séquence est faible. II. Limitez votre recherche aux régions qui reflètent le mieux vos objectifs.
Vous pouvez être intéressé à maximiser les données de séquence obtenues, ou vous pouvez seulement avoir besoin d’examiner la séquence à un endroit très spécifique du modèle. De tels besoins dictent des placements d’amorces très différents.
- Maximiser la séquence obtenue tout en minimisant le potentiel d’erreurs:
Généralement, vous devriez concevoir l’amorce aussi loin vers le 3′ que vous pouvez gérer tant que vous avez confiance dans l’exactitude de la séquence à partir de laquelle l’amorce est tirée. Les amorces sur les brins opposés doivent être placées en quinconce autant que possible. - Séquençage ciblé d’une région spécifique:
Positionnez l’amorce de façon à ce que la séquence désirée tombe dans la région la plus précise du chromatogramme. Les données de séquence sont souvent plus précises à environ 80-150 nucléotides de l’amorce. Ne comptez pas voir une bonne séquence à moins de 50 nucléotides de l’amorce ou à plus de 300 nt (bien que nous obtenions souvent une séquence commençant immédiatement après l’amorce, et que nous retournions souvent 700 nt de séquence précise).
III. Localiser les amorces candidates :
Identifiez les amorces de séquençage potentielles qui produisent un appariement de bases stable avec l’ADN matrice dans des conditions appropriées pour le séquençage du cycle. Il est fortement suggéré d’utiliser un ordinateur à cette étape. Caractéristiques suggérées des amorces :
- La longueur doit être comprise entre 18 et 30 nt, l’optimum étant de 20-25 nt. (Bien que nous ayons eu quelques succès avec des amorces plus longues que 30 et plus courtes que 18).
- Une teneur en G-C de 40-60% est souhaitable.
- Le Tm doit être compris entre 55 C et 75 C. Attention : la vieille règle « 4 degrés pour chaque G-C, 2 degrés pour chaque A-T » fonctionne mal, surtout pour les oligos plus courts que 20 ou plus longs que 25 nt. Au lieu de cela, essayez :
Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)
Il y a un calculateur de Tm basé sur le web que vous pouvez essayer à http://www.rnature.com/oligonucleotide.html.
IV. Ecartez les amorces candidates qui présentent une auto-hybridation indésirable.
Les amorces qui peuvent s’auto-hybrider seront indisponibles pour l’hybridation au modèle. Évitez généralement les amorces qui peuvent former 4 liaisons consécutives ou plus avec elle-même, ou 8 liaisons ou plus au total. Exemple d’une amorce marginalement problématique:
5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'
Cet oligo forme un dimère sensiblement stable avec lui-même, avec quatre liaisons consécutives à deux endroits et un total de huit liaisons inter-brins.
Les amorces dont les extrémités 3′ s’hybrident même transitoirement s’allongeront sous l’action de la polymérase, ce qui ruinera l’amorce et générera de fausses bandes. Soyez un peu plus rigoureux pour éviter les dimères 3′. Par exemple, l’amorce suivante s’auto-dimérise avec une hybridation 3′ parfaite sur elle-même :
5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'
L’oligo ci-dessus est assez mauvais, et presque garanti pour causer des problèmes. Notez que la polymérase va étendre l’extrémité 3′ pendant la réaction de séquençage, donnant une séquence très forte ACTATGC. Ces bandes apparaîtront au début de vos données ‘réelles’ comme d’immenses pics, occultant la séquence correcte. La plupart des programmes de conception d’amorces repéreront correctement de telles amorces auto-dimérisantes et vous avertiront de les éviter.
Notez cependant qu’aucun programme informatique ou évaluation de règle d’or ne peut prédire avec précision le succès ou l’échec d’une amorce. Une amorce qui semble marginale peut donner de bons résultats, tandis qu’une autre qui semble irréprochable peut ne pas fonctionner du tout. Évitez les problèmes évidents, concevez les meilleures amorces que vous pouvez, mais en cas de pincement si vous avez peu d’options, essayez simplement quelques amorces candidates, indépendamment des défauts potentiels.
V. Vérifiez la spécificité du site de l’amorce. Effectuez une recherche d’homologie de séquence (par exemple, comparaison d’homologie par points) à travers toute la séquence modèle connue pour vérifier les sites d’amorçage alternatifs. Éliminez toute amorce qui présente une tendance « significative » à se lier à de tels sites. Nous ne pouvons fournir que des indications approximatives sur ce qui est « significatif ». Évitez les amorces où des sites alternatifs sont présents avec (1) plus de 90% d’homologie avec le site primaire ou (2) plus de 7 nucléotides homologues consécutifs à l’extrémité 3′ ou (3) une abondance supérieure à 5 fois celle du site d’amorçage prévu. VI. Choisir parmi les amorces candidates .
Si à ce stade vous avez plusieurs amorces candidates, vous pourriez en sélectionner une ou quelques-unes qui sont plus riches en A-T à l’extrémité 3′. Celles-ci ont tendance à être légèrement plus spécifiques dans leur action, selon certains chercheurs. Vous voudrez peut-être utiliser plus d’une amorce, ce qui maximisera les chances de succès.
Si vous n’avez pas de candidats qui ont survécu aux critères ci-dessus, alors vous serez peut-être obligé de relâcher la rigueur des exigences de sélection. En fin de compte, le test d’une bonne amorce est seulement dans son utilisation, et ne peut pas être prédit avec précision par ces règles simplistes de pouce.
Avec de la chance, cependant, vous avez beaucoup d’options pour les amorces. Pour un projet d’assemblage de séquences, concevez plus d’amorces que vous pensez avoir réellement besoin, de sorte que si la séquence n’est pas aussi longue que vous l’espériez, vous pourriez quand même obtenir suffisamment de données de chevauchement pour vous assurer d’un bon consensus de séquence. Nous vous recommandons de séquencer les deux brins, pour une meilleure confirmation. Sur un brin, espacez les amorces de 500 à 700 nt (un espacement plus court est plus sûr !). Sur le brin opposé, placez les amorces en quinconce en vous éloignant des amorces du premier brin, comme illustré ci-dessous :
