¿Cómo puedo diseñar mis propios cebadores?

**** Use a Computer to Design Primers ****

Es muy recomendable utilizar un ordenador durante el diseño de los cebadores para comprobar que no haya ciertos fallos fatales en el diseño. Existen numerosos programas capaces de realizar este análisis. Por ejemplo, busque ‘Primer3’ en la web.

Los cebadores de secuenciación deben ser capaces de recocer en el ADN diana en un lugar y una hebra predecibles. Además, deben ser capaces de ser extendidos por la Taq ADN Polimerasa.

Algunas personas están confundidas sobre cómo examinar una secuencia de ADN para elegir una secuencia de cebador apropiada. Aquí hay algunas cosas para que los novatos recuerden:

• Las secuencias siempre se escriben de 5′ a 3′. Esto incluye la secuencia de su ADN molde (si se conoce), la secuencia del ADN del vector en el que se inserta, y la secuencia de los cebadores propuestos. No escriba nunca la secuencia de un cebador al revés o sólo se confundirá a sí mismo y a los demás.
• La polimerasa siempre extiende el extremo 3′ del cebador, y la secuencia que leerá será la misma hebra (sentido o antisentido) que el propio cebador.
• Así, si elige una secuencia de cebador que pueda leer en su secuencia fuente (por ejemplo, en el vector), la secuencia que obtendrá se extenderá desde el extremo derecho (3′) del cebador.
• A la inversa, si elige un cebador de la hebra opuesta a la que lee su secuencia «fuente», la secuencia resultante se leerá hacia la izquierda.

Aquí hay un par de ejemplos:

Suponga que tiene un vector con la siguiente secuencia alrededor del Sitio de Clonación Múltiple (el ‘MCS’):

 TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI

Si clonó su ADN de interés entre los sitios BamHI y EcoRI, podría secuenciar utilizando el cebador ‘CTTGATGCTAGTACTACATC’ (recuerde – que se escribe 5′ a 3′) y obtendrá la siguiente secuencia del Núcleo:

 TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)

¿Y si en cambio quisiera la secuencia de la otra cadena -Eco a Bam-? En ese caso, tienes que seleccionar alguna secuencia de la derecha y luego complementarla de forma inversa antes de solicitar el oligo. Seleccionando alguna secuencia de la figura anterior:

 CTGATGCTCATATGTTAATA

Esta NO es la secuencia del primer – está copiada textualmente de la secuencia anterior. De hecho, si se utiliza esta secuencia para un cebador, la secuenciación procedería hacia la derecha, lejos de su inserción. En lugar de eso, complemente esa secuencia de forma inversa:

 TATTAACATATGAGCATCAG

Ahora esto debería producir la secuencia de la cadena opuesta:

 CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)

Algo de letra pequeña: Sólo en raras ocasiones la secuenciación muestra realmente los nucleótidos inmediatamente posteriores al cebador. Me he tomado algunas licencias didácticas en los ejemplos anteriores.

Más conceptos avanzados: Cómo diseñar un cebador que funcione.

Generalmente, se parte de una pequeña cantidad de secuencia conocida que se desea ampliar. He aquí cómo proceder:

I. Diseñe cebadores sólo a partir de datos de secuencia precisos. La secuenciación automatizada (y de hecho cualquier secuenciación) tiene una probabilidad finita de producir errores. La secuencia obtenida demasiado lejos del cebador debe considerarse cuestionable. Para determinar qué es «demasiado lejos», sugerimos encarecidamente a nuestros clientes que lean el memo Interpretación de los cromatogramas de secuenciación, que describe cómo evaluar la validez de los datos obtenidos con los secuenciadores ABI. Seleccione una región para la colocación del cebador en la que la posibilidad de error en la secuencia sea baja. II. Restrinja su búsqueda a las regiones que mejor reflejen sus objetivos.

Puede que le interese maximizar los datos de secuencia obtenidos, o que sólo necesite examinar la secuencia en un lugar muy específico de la plantilla. Tales necesidades dictan colocaciones de cebadores muy diferentes.

1. Maximice la secuencia obtenida al tiempo que minimiza el potencial de errores:
   En general, debería diseñar el cebador tan lejos de los 3′ como pueda, siempre que confíe en la precisión de la secuencia de la que se extrae el cebador. Los cebadores de hebras opuestas deben colocarse de forma escalonada en la medida de lo posible.
2. Secuenciación dirigida de una región específica:
   Coloque el cebador de forma que la secuencia deseada caiga en la región más precisa del cromatograma. Los datos de la secuencia suelen ser más precisos a unos 80-150 nucleótidos de distancia del cebador. No cuente con ver una buena secuencia a menos de 50 nucleótidos del cebador o a más de 300 nt de distancia (aunque a menudo obtenemos una secuencia que comienza inmediatamente después del cebador, y a menudo devolvemos 700 nt de secuencia precisa).

III. Localizar los cebadores candidatos:

Identifique los posibles cebadores de secuenciación que produzcan un emparejamiento de bases estable con el ADN molde en condiciones adecuadas para la secuenciación del ciclo. Se sugiere encarecidamente que utilice un ordenador en este paso. Características sugeridas de los cebadores:

1. La longitud debe estar entre 18 y 30 nt, siendo la óptima 20-25 nt. (Aunque hemos tenido algunos éxitos con cebadores más largos de 30 y más cortos de 18).
2. El contenido de G-C del 40-60% es deseable.
3. La Tm debe estar entre 55 C y 75 C. Advertencia: la vieja regla de «4 grados por cada G-C, 2 grados por cada A-T» funciona mal, especialmente para oligos más cortos de 20 o más largos de 25 nt. En su lugar, pruebe:

    Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)

   Hay una calculadora de Tm en la web que puede probar en http://www.rnature.com/oligonucleotide.html.

IV. Descartar los cebadores candidatos que muestren una autohibridación indeseable.

Los cebadores que pueden autohibridarse no estarán disponibles para la hibridación con el molde. En general, evite los cebadores que puedan formar 4 o más enlaces consecutivos consigo mismo, u 8 o más enlaces en total. Ejemplo de un cebador marginalmente problemático:

 5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'

Este oligo forma un dímero sustancialmente estable consigo mismo, con cuatro enlaces consecutivos en dos lugares y un total de ocho enlaces entre cadenas.

Los cebadores con extremos 3′ que se hibridan incluso transitoriamente se extenderán debido a la acción de la polimerasa, arruinando así el cebador y generando bandas falsas. Sea algo más estricto para evitar los dímeros 3′. Por ejemplo, el siguiente cebador se autodimeriza con una hibridación 3′ perfecta sobre sí mismo:

 5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'

El oligo anterior es bastante malo, y casi garantiza que causará problemas. Tenga en cuenta que la polimerasa extenderá el extremo 3′ durante la reacción de secuenciación, dando una secuencia muy fuerte ACTATGC. Estas bandas aparecerán al principio de sus datos «reales» como picos inmensos, ocluyendo la secuencia correcta. La mayoría de los programas de diseño de cebadores detectarán correctamente este tipo de cebadores autodimerizantes y le advertirán que los evite.

Tenga en cuenta, sin embargo, que ningún programa informático ni ninguna regla de evaluación puede predecir con exactitud el éxito o el fracaso de un cebador. Un cebador que parece marginal puede funcionar bien, mientras que otro que parece impecable puede no funcionar en absoluto. Evite los problemas obvios, diseñe los mejores cebadores que pueda, pero en un apuro, si tiene pocas opciones, pruebe unos cuantos cebadores candidatos, independientemente de los posibles defectos.

V. Verifique la especificidad del sitio del cebador. Realice una búsqueda de homología de secuencias (por ejemplo, una comparación de homología de puntos) a través de toda la secuencia conocida de la plantilla para comprobar si hay sitios de cebado alternativos. Descarte cualquier cebador que muestre una tendencia «significativa» a unirse a dichos sitios. Sólo podemos dar unas pautas aproximadas sobre lo que es «significativo». Evite los cebadores en los que haya sitios alternativos con (1) más del 90% de homología con el sitio primario o (2) más de 7 nucleótidos homólogos consecutivos en el extremo 3′ o (3) una abundancia superior a 5 veces la del sitio de cebado previsto. VI. Elección entre los cebadores candidatos.

Si en este punto tiene varios cebadores candidatos, puede seleccionar uno o varios que sean más ricos en A-T en el extremo 3′. Estos tienden a ser ligeramente más específicos en su acción, según algunos investigadores. Es posible que quiera utilizar más de un cebador, para maximizar la probabilidad de éxito.

Si no tiene ningún candidato que sobreviva a los criterios anteriores, entonces puede verse obligado a relajar la rigurosidad de los requisitos de selección. En última instancia, la prueba de un buen cebador sólo está en su uso, y no puede predecirse con exactitud mediante estas reglas simplistas.

Sin embargo, con suerte, tiene muchas opciones de cebadores. Para un proyecto de ensamblaje de secuencias, diseñe más cebadores de los que cree que realmente necesita, de modo que si la secuencia no es tan larga como esperaba, aún pueda obtener suficientes datos de solapamiento para asegurarse un buen consenso de secuencia. Le recomendamos que secuencie ambas cadenas, para una mejor confirmación. En una hebra, espacie los cebadores entre 500 y 700 nt (¡un espaciado menor es más seguro!). En la hebra opuesta, coloque los cebadores de forma escalonada con respecto a los cebadores de la primera hebra, como se muestra a continuación: