Virulensdæmpning
Det er også vigtigt at konstruere bakterier, så deres virulens over for værtens immunsystem minimeres46,47. Det skal bemærkes, at nogle bakterielle virulensfaktorer kan være ansvarlige for deres iboende antitumoraktivitet. Derfor skal der opnås en dæmpning, uden at deres antitumoraktivitet fjernes. I humane patogener er f.eks. dødeligt giftige stammer blevet omdannet til stort set sikre stammer ved at slette de vigtigste virulensgener2,10,21. VNP20009, en svækket S. Typhimurium-stamme, blev genereret ved at slette msbB- og purI-generne; denne stamme er blevet undersøgt indgående i tumorbærende mus og viser lovende tumormålretningsspecificitet og tumorhæmmende virkninger28,48,49,50. Deletion af msbB i Salmonella-slægten resulterer i myristoylering af lipid A-komponenten af LPS, hvilket resulterer i en betydelig reduktion i LPS-drevet induktion af TNF og kan reducere risikoen for septisk chok51. VNP20009 blev efterfølgende testet i fase I-forsøg på humane kræftpatienter51,52,53,54. Skuffende nok manglede VNP20009 tumorspecificitet og havde ingen klar værdi i tumorbehandling hos patienterne52,54,55. Denne fiasko kan tilskrives den pentaacylerede lipid A, der produceres af VNP20009, som er en TLR4-antagonist56. For at ændre LPS-strukturen for at opretholde antitumoraktivitet blev der genereret muterede Salmonella-stammer, der producerer en homolog hexa-acyleret lipid A, som har en høj affinitet for TLR4, via deletion af pagP-, pagL- og lpxR-generne47,57,58. Disse mutationer havde ingen indflydelse på virulensen i msbB-mutantbaggrunden59. Mutationer i rfaG og rfaD resulterer i produktion af trunkeret LPS, hvilket resulterer i dæmpet toksicitet og tumorspecificitet; dog var disse bakteriers antitumoreffekter også nedsat. Kromosomal integration af de LPS-biosyntetiske gener i araBAD-lokussen overvandt disse begrænsninger, og mutantstammen viste dæmpet virulens og terapeutiske virkninger60.
En anden ikke-toksisk Salmonella-stamme blev konstrueret ved at nedregulere ekspressionen af endotoksin-associerede gener eller ved at hæmme deres funktionelle aktivitet. Salmonella relA- og spoT-mutantstammer, der er defekte i syntesen af ppGpp, et signalmolekyle, der er involveret i ekspression af toksingene, udviste en ubetydelig toksicitet. LD50-værdien af ΔppGpp-stammen blev forøget op til 105-106 gange i forhold til vildtypestammerne61. ΔppGpp-stammen havde fremragende antitumoraktivitet via sin evne til at aktivere inflammasomet (NLRP3, IPAF) og inducere ekspressionen af flere proinflammatoriske cytokiner (IL-1β, IL-18 og TNF-α)21. Deletion af phoP- og phoQ-generne havde ingen indflydelse på Salmonellas antitumoraktivitet, mens deletionerne reducerede dens virulens i normalt væv62. Stammer med disse mutationer er blevet anvendt til fremstilling af en fremragende vaccine og er for nylig blevet anvendt som et leveringssystem for tumorterapeutika63,64,65,65,66,67. Oral indgift af en S. Typhimurium-mutantstamme, der er mangelfuld til at syntetisere ZnuABC-zinktransportsystemet, kan fremkalde et effektivt immunrespons, der beskytter mus mod tarminfektioner68. Mutationer i generne, der koder for DNA-adeninmethylase, adenylatcyklase og cyklisk adenosinmonofosfatreceptorprotein, som er involveret i forskellige patogene genreguleringsveje, kunne reducere bakteriel toksicitet in vivo69. Sletning af gmd-genet i Salmonella hindrede biofilmdannelse og inducerede et immunrespons i et tidligt stadium af infektionen28,57. Endvidere reducerede deletion af htrA, STM3120 og slyA signifikant bakteriel overlevelse i makrofager samt bakteriernes kræftbekæmpende virkninger70. Deletion af gener, der er involveret i celleinvasion, kan dæmpe Listeria monocytogenes cytotoksicitet. Hly-deletion forårsager defekter i frigivelse af phagolysosomer52,71,72. L. monocytogenes mutantstammer, der mangler actA eller ActA PEST-lignende sekvenser, mangler også intercellulær diffusionsevne73,74, og mutantstammer, der mangler inlA og inlB, er invasionsdefekte75,76.
Indførelse af specifikke næringsstofafhængige mutationer i bakterier er en yderligere tilgang til at forbedre tumorspecifik proliferation med virulensdæmpning. A1-R Salmonella-stammen, som er auxotrof for leucin og arginin, koloniserer fortrinsvis tumorer, udviser antitumorvirkninger og øger tumorers modtagelighed over for kemoterapi22,77,78,79. En L. monocytogenes-stamme blev manipuleret til at være auxotrofisk for cellevægskomponenten d-alanin via inaktivering af dal/dat-lokussen. Denne mutantstamme var stærkt svækket og kunne fremkalde cytotoksiske T-lymfocytter22,80. Salmonella-stammerne SL3261 og SL7207, som bærer en aroA-deletion, og BRD509, som er en aroA/aroD-dobbeltmutantstamme, der er auxotrofisk for aromatiske aminosyrer, er stærkt svækkede og spredes ikke frit i værten29,57,81,82,83,84,85. En anden S. Typhimurium-stamme, YB1, som blev afledt af SL7207 ved at placere det essentielle gen asd under kontrol af en hypoxi-induceret promotor, kunne ikke overleve i normalt væv uden en exogen tilførsel af diaminopimelinsyre, selv om den stadig kunne kolonisere hypoxiske tumorer; denne stamme forårsager således mindre skade på normalt væv, samtidig med at den bevarer sin evne til at ramme tumorer21,47,86,87. Endvidere resulterede deletion af purI- og purD-generne i et behov for eksogent adenin, hvilket øgede bakteriernes evne til effektivt at proliferere i purinrige områder, såsom tumorvæv2,88. De svækkede bakteriestammer, der anvendes til kræftbehandling, er opført i tabel 1.
Forbedring af tumormålretning
De tekniske tilgange, der anvendes til at forbedre bakteriel tumormålretning, kan også øge både sikkerheden og antitumoreffektiviteten. I en tilgang til at opnå disse resultater blev den ppGpp-deficiente stamme SHJ2037 genetisk manipuleret til at vise tumorspecifikke ligander på celleoverfladen. Et Arg-Gly-Asp-peptid, der binder til αvβ3-integritin, blev fused til ydre membranprotein A for at drive dets ekspression på bakterieoverfladen89. Den resulterende stamme viste øget tumorspecificitet og markant øget antitumoraktivitet i MDA-MB-231 brystkræftceller og MDA-MB-435 melanom xenografts, der overudtrykker αvβ3-integritin. Bakterier blev også konstrueret til at angribe tumorassocierede antigener som f.eks. carcinoembryonalt antigen eller det lymfom-associerede antigen CD20. Disse stammer havde effektive kræftbekæmpende virkninger og reducerede uspecifik bakterieakkumulering i leveren og milten90,91. Ved at udnytte biotin-streptavidinbinding blev der konstrueret en L. monocytogenes-stamme, hvor cellerne var belagt med plasmidbelagte nanopartikler, der udtrykte et bioluminescensgen. Denne stamme, kaldet en mikrorobot, leverede funktionelle nukleinsyremolekyler til solide tumorer og kunne spores via bioluminescens-billeddannelse60,92,93. Et spændende alternativ, der kan øge tumorselektiviteten, er at vise syntetiske adhesiner (SA’er) på overfladen af E. coli. SA’er har en modulær struktur bestående af en stabil β-domæne, der er nødvendig for forankring i den ydre membran, og overfladeeksponerede immunoglobulindomæner med høj affinitet og specificitet, der kan udvælges fra store biblioteker94. Probiotiske stammer viste forbedret tumorspecificitet ved at øge bakteriernes injektionskapacitet uden at svække deres iboende egenskaber95,96,97,98,99. Probiotiske E. coli Symbioflor-2-celler blev meget hurtigt fjernet fra milt og lever og overlevede kun i en tumor, hvilket tyder på effektiv tumormålretning. Mus, der er inficeret med en probiotisk Salmonella-stamme, tolererede en stor bakteriel belastning uden patologiske symptomer; der er dog behov for forbedringer af nyttelasttilførselssystemet på grund af stammens ringere terapeutiske effektivitet på trods af dens fremragende sikkerhed in vivo57.
Drugsekspressionsstrategier
De fleste nyttelaster, der leveres af tumormålrettede bakterier, er toksiske for både tumorceller og normale celler; derfor foretrækkes streng kontrol med deres produktion frem for konstitutiv ekspression. Præcis udløsning af ekspression af nyttelast kan maksimere dens terapeutiske virkninger og samtidig minimere systemisk toksicitet. Et kontrollerbart genekspressionssystem kan teoretisk set konstrueres ved at indsætte en specifik promotorsekvens opstrøms for et lægemiddelkodende gen, hvorved der opnås transkriptionskontrol via eksterne signaler. Et sådant system gør det muligt at styre timingen og placeringen af lægemiddelproduktionen in vivo. Strategierne for denne type genregulering, eller udløsning, hører for det meste til følgende tre kategorier: intern udløsning, selvudløsende (quorum sensing-QS) og ekstern udløsning100.
I modsætning til normalt væv har TME’er særlige egenskaber, herunder hypoxi, acidose og nekrose, som bakterier kan opfatte og udnytte til at forbedre tumorspecificiteten101. For eksempel aktiveres hypoxi-inducerbare promotorer såsom HIP-1 og pepT ved fumarat- og nitratreduktion i det hypoxiske miljø i tumorvæv102,103,104. Dette hypoxi-inducerbare ekspressionssystem blev designet til kun at fungere under anaerobe forhold til ekspression af essentielle gener som f.eks. asd105. Flentie et al. identificerede fem promotorsekvenser, der specifikt aktiveres af de sure mikromiljøer, der er forbundet med kræftceller in vitro og med tumorer in vivo. Acidose-specifikke promotorer blev identificeret ved at bruge en specialudviklet promotorløs transposon-reporter, der koder for bakteriel luciferase, til at screene et bibliotek af 7400 uafhængige Salmonella transposon-indsættelsesmutanter i samdyrkning med melanom- eller koloncarcinomceller. En svækket Salmonella-stamme, der udtrykker Shiga-toksin under kontrol af en promotor induceret af lav pH, viste stærk tumorselektivitet og antitumoraktivitet106. Der blev udviklet en glukosesensor i E. coli via syntetisk fusion af Trg kemoreceptoren med EnvZ osmosensoren. I denne konstruktion bidrager Trg med de periplasmatiske og transmembran-domæner samt et kort cytoplasmatisk segment, og EnvZ bidrager med det cytoplasmatiske kinase/phosphatase-domæne. De manipulerede bakterier registrerede glukoseniveauet i tumorcellemasser og reagerede på tumorens metaboliske aktivitet, hvilket muligvis førte til den terapeutiske virkning. Disse egenskaber er sandsynligvis bevaret i andre medlemmer af denne sensorfamilie107.
Bakterier kan kolonisere og proliferere i TME’er ved et tumor-til-normalt væv-forhold på over 10 000; QS kan således anvendes som en genekspressions switch108,109. Et nyttigt QS-system reguleres af en autoinducer, det syntetiske LuxI-protein, og det transkriptionelle regulatoriske protein LuxR. Det acylhomoserinlacton (AHL), der produceres af LuxI, og som afhænger af bakterietætheden, aktiverer LuxR og fremmer transkriptionen af dets målgener. AHL-koncentrationsafhængige QS-systemer er blevet anvendt med succes til i høj grad at udtrykke heterologe proteiner i bakteriekoloniserende tumorer90,109,110,111. QS-tilgangen er blevet anvendt til at indføre en række forskellige genkredsløb. F.eks. forbedrede indførelsen af et synkroniseret lysis-kredsløb i bakterier den kræftbekæmpende effekt ved at muliggøre frigivelse af lægemidler via periodisk indførelse af autoinducer (positiv feedback) og den deraf følgende aktivering af et bakteriofaglysisgen (negativ feedback)108.
Ud over intern og selvudløsende kan ekspressionen af genkredsløb også styres af eksterne induktorer, herunder kemikalier som f.eks. l-arabinose, salicylsyre (ASA) og tetracyklin. Transkription fra PBAD-promotoren kan styres via et samspil mellem AraC-repressoren og l-arabinose5,112. I en svækket Salmonella-stamme kunne pBAD-drevet ekspression af terapeutiske nyttelast fra et plasmid reguleres via intravenøs eller intraperitoneal indgivelse af l-arabinose20,21,113. En Salmonella-stamme med en mutation i Ara-operonet, som resulterer i nedsat l-arabinose-metabolisme, udviser en stærk aktivering af PBAD-promotoren114. I ASA-ekspressionssystemet styres genregulering af den XylS2-afhængige Pm-promotor115,116,117. En svækket Salmonella-stamme med et ASA-ekspressionssystem på et plasmid eller på kromosomet muliggjorde en effektiv regulering af gener, der koder for prodrug-converterende enzymer (se nedenfor), og førte til en markant reduktion i tumorvækst115. pTet-ekspressionssystemet reguleres samtidig af de bidirektionelle promotorer PtetA og PtetR, som induceres af tetracyclin eller doxycyclin118. I en præklinisk undersøgelse blev der indsat et reportergen og et terapeutisk gen under disse bidirektionelle promotorer for at visualisere målretningsprocessen og levere terapeutiske lægemidler7. Dette kemisk inducerbare system reguleres på en dosis- og tidsafhængig måde119; derfor kan unøjagtigheder i tidspunktet for indgivelse af inducerende stoffer eller i inducerende stoffers dosis føre til uspecifik eller suboptimal ekspression af målmolekylerne i TME’er. Et alternativt inducerbart system anvender den stråleinducerbare recA-promotor48. Stråling forårsager DNA-skader, som aktiverer transkriptionen af generne under kontrol af recA-promotoren. Denne metode kombinerer de terapeutiske virkninger af strålebehandling med stråleafhængig induktion af kræftbekæmpende genekspression120. Induktion af ekspression af TNF-relateret apoptose-inducerende ligand (TRAIL) via en dosis γ-stråling på 2 Gy 48 timer efter indgift af den manipulerede Salmonella-stamme forsinkede væksten af 4T1 brystkræftceller betydeligt48. Stråling er fordelagtig, fordi den kan trænge ind i tumorvævet og anvendes til lokaliseret behandling. Stråling kan imidlertid også forårsage toksicitet ved at inducere DNA-skader i de sunde celler omkring tumoren og forårsager sandsynligvis fatale mutationer i de terapeutiske bakterier, som kan svække deres terapeutiske virkning101.
Levering af lægemidler
Trods undersøgelser af bakteriers antitumorvirkninger er bakterier alene ofte utilstrækkelige til at undertrykke tumorer fuldstændigt. For at forbedre de positive resultater af bakteriel kræftterapi har man undersøgt nytten af eukaryote og prokaryote ekspressionssystemer til levering af terapeutiske nyttelastninger, herunder cytotoksiske stoffer, prodrugskonverterende enzymer, immunregulatorer, tumorstroma-målmolekyler og siRNA’er (anført i tabel 2). De prokaryote ekspressionssystemer, der er omtalt ovenfor, er den mest almindeligt anvendte tilgang, og disse systemer afhænger af transformation af bakterier med prokaryote plasmider, der koder for målgener70,121,122; i modsætning hertil indebærer eukaryote ekspressionssystemer transduktion af værtsceller, f.eks. immunceller eller tumorceller, med eukaryote plasmider, der koder for cDNA’erne for målgenerne123.
Cytotoksiske stoffer
Cytotoksiske stoffer, der bæres af bakterier, der er rettet mod tumorer, kan have en iboende antitumoraktivitet. Kombineret med brugen af inducerbare promotorer kan ekspressionen af cytotoksiske stoffer kontrolleres nøje for at reducere deres toksiske virkninger på normalt væv. Cytolysin A (ClyA), et 34 kDa poredannende hæmolytisk protein, der produceres af E. coli, S. Typhimurium og Paratyphi A, kan transporteres til bakterieoverfladen og udskilles uden posttranslationel modifikation. Flere bakteriestammer, såsom E. coli og svækket S. Typhimurium, er blevet manipuleret til at udtrykke ClyA fra en konstitutiv promotor5 eller fra inducerbare promotorer aktiveret af arabinose5 eller doxycyclin7 , og disse stammer har vist fremragende tumorhæmmende virkninger.
Induktion af apoptose i tumorceller er en lovende strategi til kræftbehandling. Apoptin, et protein, der stammer fra kyllingeanæmivirus, inducerer selektivt apoptose i et stort antal humane kræftcelletyper gennem en p53-uafhængig, Bcl-2-insensitiv vej uden nogen virkninger på normalt væv124. Ved at transformere et apoptin-kodende eukaryotisk ekspressionsplasmid (pCDNA3.1) i en svækket S. Typhimurium-stamme observerede Wen et al. en betydelig tumorregression med minimal systemisk toksicitet hos mus med human larynxcancer65. Andre cytotoksiske stoffer, der på samme måde kan anvendes til at fremkalde apoptose, omfatter tre medlemmer af TNF-α-familien (TNF-α, TRAIL og Fas-liganden); på grund af deres korte halveringstid og hepatotoksicitet er disse cytotoksiske liganders anvendelighed dog begrænset af deres utilstrækkelige tumoreksponering og skadelige virkninger på leverfunktionen125 . For at forbedre biotilgængeligheden og bæredygtigheden af disse proteiner er der blevet anvendt bakterier til at levere dem direkte til tumorområdet48,78,126,127. Forbes et al. fremstillede en ikke-patogen S. Typhimurium-stamme, der udtrykker murin TRAIL under kontrol af den stråleinducerbare recA-promotor. Efter bestråling blev TRAIL udskilt, hvorefter det forsinkede væksten af mammatumorer betydeligt og reducerede risikoen for død48.
Invasin, et Yersinia-overfladeprotein, kan binde sig selektivt til β1-integrin for at udløse bakteriel indgang i værtsceller. Ved hjælp af en ikke-patogen, rekombinant invasiv E. coli-stamme, der samudtrykker invasin og modelantigenet ovalbumin samt LLO, viste Critchley-Thorne et al. at den manipulerede stamme kunne invadere β1-integritin-udtrykkende celler og levere proteiner til tumorer for at producere terapeutiske virkninger i mus128. Azurin, et redoxprotein med lav molekylvægt, kan internaliseres effektivt for at igangsætte kræftcellers apoptose ved at øge de intracellulære p53- og Bax-niveauer for at inducere frigivelse af mitokondriecytochrom c i cytosolen. Nissle påviste i 1917, at E. coli-baseret levering af azurin var effektiv til at undertrykke væksten af B16-musmelanom og 4T1-musbrystkræft i musen; desuden forhindrede denne fremgangsmåde også lungemetastase og stimulerede inflammatoriske reaktioner29.
Prodrugskonverterende enzymer
Ekspression af prodrugskonverterende enzymer kan konvertere prodrugs til cytotoksiske midler specifikt i tumorområdet. Nytteværdien af denne strategi til at forbedre kræftbehandlingens effektivitet og reducere de bivirkninger, der er forbundet med systemisk administration, er blevet undersøgt. Adskillige prodrug-konverterende enzymer er blevet leveret af bakterier96,129,130,131. Cytosindeaminase (CD) omdanner ikke-toksisk 5-fluorocytosin (5-FC) til det kemoterapeutiske middel 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU er meget giftigt, fordi det metaboliseres yderligere til et produkt, der forstyrrer DNA- og RNA-syntesen132,133,134,135. Ved samtidig indgift af en svækket S. Typhimurium-stamme (VNP20009), der udtrykker E. coli CD, og 5-FC til patienter, blev der observeret en omdannelse af 5-FC til 5-FU, hvilket tyder på bakteriel produktion af funktionel CD i tumoren54.
Herpes simplex virus type I thymidinkinase/ganciclovir-systemet (HSV1-TK/GCV) er en anden prodrug-konverterende enzym/prodrug-kombination, der er blevet undersøgt i vid udstrækning med henblik på anvendelse til tumorbehandling. Tumorvævsspecifik HSV1-TK-ekspression kan omdanne den ikke-toksiske forløber ganciclovir til ganciclovir-3-fosfat, et giftigt stof, der dræber tumorceller. Liu et al. testede in vivo effektiviteten af en Bifidobacterium infantis-stamme, der udtrykker HSV1-TK og GCV, til prodrugsterapi i en blæretumormodel hos rotter. Resultaterne viste, at denne målrettede tilgang effektivt kunne hæmme rotteblæretumorvækst ved at øge caspase 3-ekspressionen og inducere apoptose131. En anden stamme til levering af et prodrugkonverterende enzym, E. coli DH5α, der udtrykker β-glucuronidase, som hydrolyserer glucuronidprodrug 9ACG til topoisomerase I-inhibitoren 9-aminocamptothecin (9AC), viste effektiv tumorhæmning129. Brugen af svækket S. Typhimurium VNP20009 som vektor til at levere carboxypeptidase G2 viste øget antitumoreffekt i forbindelse med administration af prodrug130.
Immunomodulatorer
Cytokiner kan opnå antitumorvirkninger ved at lette immuncellers proliferation, aktivering og differentiering, ved at inducere apoptose i tumorceller og via antiangiogenesevirkninger på tumorvaskulaturen. Flere cytokiner, herunder GM-CSF, IL-12 og IL-18, har været genstand for kliniske forsøg med henblik på kræftbehandling136. Cytokiner, der udtrykkes af bakterier med tumortargeting, blev leveret specifikt til tumorområdet, hvor de forstærkede immunresponset mod tumor i TME20,29,49,62,137,138,139,140. Intravenøs administration af en IL-18-eksprimerende svækket S. Typhimurium-stamme hæmmede primær tumorvækst hos mus, inducerede massiv leukocytinfiltration (hovedsagelig granulocytter) og øgede NK- og CD4+ T-celle-, men ikke CD8+ T-celle-rekruttering. Desuden øgede denne fremgangsmåde også cytokinproduktionen i tumorområdet, herunder produktionen af IL-1β, TNF-α, IFN-γ og GM-CSF49. IL-2 er det cytokin, der er mest studeret i forbindelse med bakterielle leveringssystemer. Oral administration af en S. Typhimurium Ty21a-stamme, der udtrykker IL-2, hæmmede hepatocellulært karcinom (HCC) i musemodeller23,29. Flagellin, som aktiverer det medfødte immunsystem via TLR5, er blevet etableret som en fremragende immunterapi-adjuvans141. Vores gruppe behandlede mus med tarmkræft med en svækket ΔppGpp S. Typhimurium-stamme, der udtrykker heterologt flagellin, og viste, at det forbedrede antitumorimmuniteten via et samarbejde med TLR4- og TLR5-signalvejene. Denne fremgangsmåde fremmer også et M2-til-M1-skift i makrofager og øger nitrogenoxidniveauet i tumorer20.
Tekniske bakterier, der udtrykker tumorassocierede antigener, kan sensibilisere TME’er og overvinde den selvtolerance, som regulatoriske T-celler vækker, og derved fremkalde effektor- og hukommelses-T-cellresponser mod antigenproducerende tumorceller142,143. Der er blevet rapporteret om en række prostatakræft-associerede antigener. Bakteriebaserede vacciner mod prostataspecifikt antigen (PSA) er blevet afprøvet i flere musemodeller139,144. Endogen PSA-genoverførsel ved hjælp af svækket S. Typhimurium SL7207-allokerede immuntolerance over for murine prostatastammecelleantigener og forsinkede tumorvæksten betydeligt84. Genterapitiltag med antigener mod HER-2/neu143, NY-ESO-183, survivin88 og Mage-b145 har også vist lovende tumorhæmmende virkninger.
Der er opstået stor interesse for kræftterapi med immunkontrolpunktblokade (ICB). På trods af ICB-behandlingens succes i kliniske forsøg er det kun nogle patienter, der har gavn af denne behandling. Der er flere årsager til den værtsresistens, der ligger til grund for denne effekt, hvoraf den immunosuppressive TME er den vigtigste146,147. Undersøgelser viser, at tumorkolonisering med bakterier kan inducere proinflammatoriske reaktioner, der involverer forhøjet ekspression af IL-1β, TNF-α og IFN-γ samt aktivering af NK- og T-celler; derfor kan en kombination af ICB- og bakteriebehandlinger overvinde værtsresistens131.
Targeting the tumor stroma
Angiogenese spiller en vigtig rolle i tumorvækst og metastase. Målretning af tumor neovaskularisering giver en lovende retning for kræftbehandling. Endostatin er et 20 kDa C-terminalt fragment fra type XVIII-kollagen, der kan hæmme tumorkardannelse på en dosisafhængig måde uden tydelige bivirkninger eller lægemiddelresistens148,149. Xu et al. klonede endostatin og et siRNA mod signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) i en svækket S. Typhimurium-stamme. De testede derefter stammens terapeutiske effektivitet i ortotropt HCC og viste, at den kunne hæmme tumorproliferation og metastase, reducere mængden af tumormikrovaskulatur, øge CD4+/CD8+ T-cellepopulationerne og ekspressionsniveauerne af flere inflammatoriske cytokiner (herunder IFN-γ og TNF-α) og nedregulere TGF-β, regulatoriske T-celler og ekspression af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)149. VEGF og dets receptor (VEGFR) regulerer tumor angiogenese121,145. Oral administration af svækket S. Typhimurium SL3261, der udtrykker det ekstracellulære VEGFR2-domæne, hæmmede tumorvækst, neovaskularisering og lungemetastase. Endvidere steg procentdelen af CD4+ og CD8+ T-celler i tumorområdet også signifikant121. Endoglin (CD105) er et medlem af TGF-β-receptorfamilien. TGF-β1 og hypoxi kan opregulere endoglin-genpromotoren, og denne promotor er meget aktiv i tumorale endothelceller. Derfor er endoglin blevet betragtet som et mål for kræftbehandling150. Paterson et al. brugte Listeria-baserede vacciner mod CD105, Lm-LLO-CD105A og Lm-LLO-CD105B til at behandle brystkræft i en musemodel. Vaccinerne stimulerede en robust antiangiogeneseeffekt og et antitumorimmunrespons, der hindrede primære og metastaserende tumorer151.
Gensilensering
siRNA’er, en klasse af 20-25 basepar lange dobbeltstrengede RNA’er, der formidler silencing af specifikke målgener, har udgjort en lovende tilgang til kræftbehandling. Den største hindring for RNA-interferensbehandling er imidlertid behovet for specifik levering af siRNA’er til tumorområdet. Bakteriebaserede leveringssystemer til siRNA’er mod Stat363,122,149,152, IDO153,154, survivin155, Sox230 og den cellecyklus-associerede polo-like kinase 1 (PLK1)57 er blevet afprøvet i tumormodeller hos mus. Oral administration af en svækket S. Typhimurium-stamme med et eukaryotisk ekspressionsplasmid, der koder for siRNA-Stat3, øgede NK-celleaktiviteten og T-lymfocytfunktionen og forhøjede procentdelen af CD8+ T-celler, mens det mindskede antallet af CD4+ CD25+ regulatoriske T-celler i tumoren; disse virkninger førte til hæmning af tumorvækst og forlænget overlevelse hos tumorbærende mus122. Silencing host IDO-ekspression ved hjælp af en S. Typhimurium VNP20009-stamme, der udtrykker shIDO, fremkaldte betydelig tumorinfiltration af ROS-genererende polymorphonukleære neutrofile, hvilket fremmede intratumoral celledød og væsentlig kontrol af B16F10-melanomer153 og CT26- eller MC38-kolorektalcancer156.