Virulence attenuation
Engineering bacteria to minimize their virulence against the host immune system is also essential46,47. Należy zauważyć, że niektóre czynniki wirulencji bakterii mogą być odpowiedzialne za ich wewnętrzną aktywność przeciwnowotworową. Dlatego też atenuacja musi być osiągnięta bez osłabienia ich aktywności przeciwnowotworowej. Na przykład, w przypadku ludzkich patogenów, śmiertelnie toksyczne szczepy zostały przekształcone w szczepy w dużej mierze bezpieczne poprzez delecję głównych genów wirulencji2,10,21. VNP20009, atenuowany szczep S. Typhimurium, został wytworzony poprzez delecję genów msbB i purI; szczep ten był szeroko badany na myszach noszących guzy i wykazuje obiecującą specyficzność w stosunku do nowotworów oraz efekty hamujące rozwój nowotworów28,48,49,50. Delecja msbB w rodzaju Salmonella powoduje mirystoilację lipidowego składnika A LPS, co skutkuje znacznym zmniejszeniem indukcji TNF wywołanej przez LPS i może zmniejszyć ryzyko wstrząsu septycznego51. VNP20009 był następnie testowany w badaniach I fazy u pacjentów z nowotworami u ludzi51,52,53,54. Rozczarowująco, VNP20009 nie wykazywał swoistości nowotworowej i nie miał wyraźnej wartości w leczeniu nowotworów u pacjentów52,54,55. To niepowodzenie może być przypisane penta-acylowanemu lipidowi A wytwarzanemu przez VNP20009, który jest antagonistą TLR456. Aby zmodyfikować strukturę LPS w celu utrzymania aktywności przeciwnowotworowej, wygenerowano zmutowane szczepy Salmonella, które produkują homologiczny heksa-acylowany lipid A, który ma wysokie powinowactwo do TLR4, poprzez delecję genów pagP, pagL i lpxR47,57,58. Mutacje te nie miały wpływu na wirulencję w tle mutanta msbB59. Mutacje w rfaG i rfaD prowadzą do produkcji okrojonego LPS, co skutkuje zmniejszoną toksycznością i specyficznością nowotworową; jednakże działanie przeciwnowotworowe tych bakterii było również zmniejszone. Chromosomalna integracja genów biosyntezy LPS w locus araBAD przezwyciężyła te ograniczenia, a zmutowany szczep wykazał zmniejszoną wirulencję i efekty terapeutyczne60.
Inny nietoksyczny szczep Salmonella został zmodyfikowany przez obniżenie ekspresji genów związanych z endotoksyną lub przez hamowanie ich aktywności funkcjonalnej. Szczepy Salmonella relA- i spoT-mutant wadliwe w syntezie ppGpp, cząsteczki sygnalizacyjnej zaangażowanej w ekspresję genu toksyny, wykazywały znikomą toksyczność. Wartość LD50 szczepu ΔppGpp była zwiększona nawet 105-106-krotnie w porównaniu do szczepów typu dzikiego61. Szczep ΔppGpp wykazywał doskonałą aktywność przeciwnowotworową poprzez zdolność do aktywacji inflammasomu (NLRP3, IPAF) i indukowania ekspresji kilku cytokin prozapalnych (IL-1β, IL-18 i TNF-α)21. Delecja genów phoP i phoQ nie miała wpływu na aktywność przeciwnowotworową Salmonelli, natomiast delecje zmniejszały jej wirulencję w tkankach prawidłowych62. Szczepy noszące te mutacje zostały wykorzystane do produkcji doskonałej szczepionki, a ostatnio zostały użyte jako system dostarczania leków przeciwnowotworowych63,64,65,66,67. Doustne podanie zmutowanego szczepu S. Typhimurium z niedoborem syntezy systemu transportu cynku ZnuABC może wywołać skuteczną odpowiedź immunologiczną, która chroni myszy przed infekcjami jelitowymi68. Mutacje w genach kodujących metylazę adeninową DNA, cyklazę adenylanową i białko receptora cyklicznego monofosforanu adenozyny, które są zaangażowane w różne patogenne szlaki regulacji genów, mogą zmniejszyć toksyczność bakterii in vivo69. Delecja genu gmd w Salmonella hamowała tworzenie biofilmu i indukowała odpowiedź immunologiczną na wczesnym etapie infekcji28,57. Ponadto, delecja genów htrA, STM3120 i slyA znacząco zmniejszała przeżywalność bakterii w makrofagach, jak również ich działanie przeciwnowotworowe70. Delecja genów zaangażowanych w inwazję komórek może osłabiać cytotoksyczność Listeria monocytogenes. Delecja Hly powoduje defekty w uwalnianiu fagolizosomów52,71,72. Zmutowane szczepy L. monocytogenes pozbawione sekwencji actA lub ActA PEST-like również nie mają zdolności dyfuzji międzykomórkowej73,74, a zmutowane szczepy pozbawione inlA i inlB mają defekt inwazji75,76.
Wprowadzenie specyficznych mutacji zależnych od składników odżywczych u bakterii jest dodatkowym podejściem do poprawy proliferacji specyficznej dla guza z osłabieniem wirulencji. Szczep A1-R Salmonella, który jest auksotroficzny dla leucyny i argininy, preferencyjnie kolonizuje guzy, wykazuje działanie przeciwnowotworowe i zwiększa podatność guzów na chemioterapię22,77,78,79. Szczep L. monocytogenes został zmodyfikowany tak, aby był auksotroficzny dla składnika ściany komórkowej d-alaniny poprzez inaktywację locus dal/dat. Ten zmutowany szczep był wysoce atenuowany i mógł indukować cytotoksyczne limfocyty T22,80. Szczepy Salmonella SL3261 i SL7207, które posiadają delecję aroA, oraz BRD509, który jest szczepem z podwójną mutacją aroA/aroD, który jest auksotroficzny dla aminokwasów aromatycznych, są wysoce atenuowane i nie rozprzestrzeniają się swobodnie w organizmie gospodarza29,57,81,82,83,84,85. Inny szczep S. Typhimurium, YB1, który został wyprowadzony z SL7207 przez umieszczenie niezbędnego genu asd pod kontrolą promotora indukowanego hipoksją, nie mógł przetrwać w normalnej tkance bez egzogennego dostarczania kwasu diaminopimelinowego, chociaż nadal mógł kolonizować hipoksyjne guzy; w ten sposób szczep ten powoduje mniejsze uszkodzenia normalnej tkanki, zachowując swoją zdolność do ukierunkowania na guzy21,47,86,87. Co więcej, delecja genów purI i purD spowodowała zapotrzebowanie na egzogenną adeninę, co zwiększyło zdolność bakterii do efektywnej proliferacji w regionach bogatych w puryny, takich jak tkanka nowotworowa2,88. Atenuowane szczepy bakteryjne stosowane w terapii przeciwnowotworowej wymieniono w tabeli 1.
Ulepszanie ukierunkowania na guza
Podejścia inżynieryjne stosowane do ulepszania bakteryjnego ukierunkowania na guza mogą również zwiększać zarówno bezpieczeństwo, jak i skuteczność przeciwnowotworową. W jednym z podejść do osiągnięcia tych wyników, szczep SHJ2037 z niedoborem ppGpp został genetycznie zmodyfikowany tak, aby na powierzchni komórek pojawiały się ligandy specyficzne dla guza. Peptyd Arg-Gly-Asp, który wiąże się z integryną αvβ3, został połączony z białkiem błony zewnętrznej A w celu pobudzenia jego ekspresji na powierzchni bakterii89. Uzyskany w ten sposób szczep wykazał zwiększoną specyficzność wobec nowotworów i znacznie zwiększoną aktywność przeciwnowotworową w komórkach raka piersi MDA-MB-231 i ksenograftach czerniaka MDA-MB-435 wykazujących nadekspresję integryny αvβ3. Bakterie zostały również zaprojektowane tak, aby celowały w antygeny związane z nowotworami, takie jak antygen karcinoembrionalny lub antygen CD20 związany z chłoniakiem. Szczepy te miały skuteczne działanie przeciwnowotworowe i zmniejszały niespecyficzną akumulację bakterii w wątrobie i śledzionie90,91. Wykorzystując wiązanie biotyna-streptawidyna, skonstruowano szczep L. monocytogenes, w którym komórki były opłaszczone nanocząstkami obciążonymi plazmidem, wyrażającym gen bioluminescencji. Ten szczep, zwany mikrorobotem, dostarczał funkcjonalne cząsteczki kwasu nukleinowego do guzów litych i mógł być śledzony poprzez obrazowanie bioluminescencji60,92,93. Intrygującą alternatywą, która może zwiększyć selektywność nowotworów jest umieszczenie syntetycznych adhezyn (SAs) na powierzchni E. coli. SAs mają modularną strukturę składającą się ze stabilnej domeny β wymaganej do zakotwiczenia w błonie zewnętrznej i powierzchniowo wyeksponowanych domen immunoglobulinowych o wysokim powinowactwie i specyficzności, które mogą być wybierane z dużych bibliotek94. Szczepy probiotyczne wykazywały lepszą specyficzność w stosunku do nowotworów poprzez zwiększenie zdolności bakterii do iniekcji bez osłabienia ich wewnętrznych właściwości95,96,97,98,99. Probiotyczne komórki E. coli Symbioflor-2 były bardzo szybko usuwane ze śledziony i wątroby i przetrwały tylko w guzie, co wskazuje na skuteczne ukierunkowanie na guza. Myszy zakażone probiotycznym szczepem Salmonella tolerowały duży ładunek bakterii bez żadnych objawów patologicznych; jednakże, potrzebne są ulepszenia w systemie dostarczania ładunku z powodu gorszej skuteczności terapeutycznej tego szczepu, pomimo jego doskonałego bezpieczeństwa in vivo57.
Strategie ekspresji leków
Większość ładunków dostarczanych przez bakterie ukierunkowane na guzy jest toksyczna zarówno dla komórek guza, jak i komórek prawidłowych; dlatego preferowana jest ścisła kontrola ich produkcji, a nie konstytutywna ekspresja. Precyzyjne wyzwalanie ekspresji ładunku może zmaksymalizować jego efekty terapeutyczne przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności ogólnoustrojowej. System kontrolowanej ekspresji genów może być teoretycznie skonstruowany poprzez wprowadzenie specyficznej sekwencji promotora przed genem kodującym lek, w ten sposób nadając kontrolę transkrypcji poprzez sygnały zewnętrzne. Taki system umożliwia zarządzanie czasem i miejscem produkcji leku in vivo. Strategie dla tego typu regulacji genów, lub wyzwalania, należą głównie do następujących trzech kategorii: wyzwalanie wewnętrzne, samowyzwalanie (quorum sensing-QS) i wyzwalanie zewnętrzne100.
W przeciwieństwie do normalnej tkanki, TME mają specjalne właściwości, w tym hipoksję, kwasicę i martwicę, które bakterie mogą wyczuć i wykorzystać do poprawy specyficzności guza101. Na przykład, promotory indukowane hipoksją, takie jak HIP-1 i pepT, są aktywowane przez redukcję fumaranu i azotanu w środowisku hipoksyjnym w tkance guza102,103,104. Ten system ekspresji indukowanej hipoksją został zaprojektowany do funkcjonowania wyłącznie w warunkach beztlenowych dla ekspresji istotnych genów, takich jak asd105. Flentie i wsp. zidentyfikowali pięć sekwencji promotorowych specyficznie aktywowanych przez kwaśne mikrośrodowisko związane z komórkami nowotworowymi in vitro oraz z guzami in vivo. Promotory specyficzne dla kwasicy zostały zidentyfikowane przy użyciu specjalnie zaprojektowanego bez promotorowego transpozonowego reportera kodującego bakteryjną lucyferazę w celu zbadania biblioteki 7400 niezależnych mutantów transpozonowych Salmonella w kokulturze z komórkami czerniaka lub raka okrężnicy. Atenuowany szczep Salmonella wyrażający toksynę Shiga pod kontrolą promotora indukowanego przez niskie pH wykazał silną selektywność nowotworową i aktywność przeciwnowotworową106. Czujnik glukozy został skonstruowany w E. coli poprzez syntetyczną fuzję chemoreceptora Trg z osmoreceptorem EnvZ. W tej konstrukcji Trg zawiera domenę peryplazmatyczną i transmembranową oraz krótki segment cytoplazmatyczny, a EnvZ cytoplazmatyczną domenę kinazowo-fosfatazową. Zaprojektowane bakterie wyczuwają poziom glukozy w masie komórek nowotworowych i reagują na aktywność metaboliczną guza, co może prowadzić do efektu terapeutycznego. Cechy te są prawdopodobnie zachowane u innych członków tej rodziny czujników107.
Bakterie mogą kolonizować i proliferować w TME przy stosunku guza do normalnej tkanki przekraczającym 10 000; w ten sposób QS może być stosowany jako przełącznik ekspresji genów108,109. Jeden użyteczny system QS jest regulowany przez autoinduktor, syntetyczne białko LuxI i transkrypcyjne białko regulatorowe LuxR. Lakton acylohomoserynowy (AHL) produkowany przez LuxI, który zależy od gęstości bakterii, aktywuje LuxR i promuje transkrypcję jego genów docelowych. Systemy QS zależne od stężenia AHL zostały z powodzeniem wykorzystane do wysokiej ekspresji heterologicznych białek w guzach kolonizowanych przez bakterie90,109,110,111. Podejście QS zostało wykorzystane do wprowadzenia różnych obwodów genowych. Na przykład, wprowadzenie zsynchronizowanego obwodu lizy do bakterii poprawiło skuteczność przeciwnowotworową, umożliwiając uwalnianie leku poprzez okresowe wprowadzanie autoinduktora (dodatnie sprzężenie zwrotne) i wynikającą z tego aktywację genu lizy bakteriofaga (ujemne sprzężenie zwrotne)108.
Oprócz wewnętrznego i samoczynnego wyzwalania, ekspresja obwodów genowych może być również kontrolowana przez zewnętrzne czynniki indukujące, w tym substancje chemiczne, takie jak l-arabinoza, kwas salicylowy (ASA) i tetracyklina. Transkrypcja z promotora PBAD może być kontrolowana poprzez interakcję pomiędzy represorem AraC i l-arabinozą5,112. W atenuowanym szczepie Salmonella, ekspresja stymulowana przez pBAD terapeutycznych ładunków z plazmidu może być regulowana przez dożylne lub dootrzewnowe podawanie l-arabinozy20,21,113. Szczep Salmonella z mutacją w operonie Ara, która skutkuje upośledzeniem metabolizmu l-arabinozy, wykazuje silną aktywację promotora PBAD114. W systemie ekspresji ASA regulacja genu jest kontrolowana przez zależny od XylS2 promotor Pm115,116,117. Atenuowany szczep Salmonella posiadający system ekspresji ASA na plazmidzie lub na chromosomie umożliwił efektywną regulację genów kodujących enzymy konwertujące proleki (patrz poniżej) i doprowadził do wyraźnego zmniejszenia wzrostu guza115. System ekspresji pTet jest jednocześnie regulowany przez dwukierunkowe promotory PtetA i PtetR, które są indukowane przez tetracyklinę lub doksycyklinę118. W badaniach przedklinicznych pod tymi dwukierunkowymi promotorami umieszczono gen reporterowy i gen terapeutyczny, odpowiednio w celu wizualizacji procesu targetowania i dostarczania leków terapeutycznych7. Ten chemicznie indukowalny system jest regulowany w sposób zależny od dawki i czasu119; dlatego niedokładności w czasie podawania induktora lub dawki induktora mogą prowadzić do niespecyficznej lub suboptymalnej ekspresji cząsteczek docelowych w TMEs. Alternatywny system indukcyjny wykorzystuje indukowany promieniowaniem promotor recA48. Promieniowanie powoduje uszkodzenia DNA, które aktywują transkrypcję genów pod kontrolą promotora recA. Metoda ta łączy efekty terapeutyczne radioterapii z zależną od promieniowania indukcją ekspresji genów przeciwnowotworowych120. Indukcja ekspresji liganda indukującego apoptozę związanego z TNF (TRAIL) poprzez dawkę 2 Gy promieniowania γ 48 godzin po podaniu zmodyfikowanego szczepu Salmonella znacząco opóźniała wzrost komórek raka piersi 4T148. Promieniowanie jest korzystne, ponieważ może przenikać do tkanki nowotworowej i być stosowane w leczeniu miejscowym. Jednakże promieniowanie może również powodować toksyczność poprzez indukowanie uszkodzeń DNA w zdrowych komórkach wokół guza i prawdopodobnie powoduje śmiertelne mutacje w bakteriach terapeutycznych, które mogą osłabić ich działanie terapeutyczne101.
Dostarczanie leków
Pomimo badań nad przeciwnowotworowym działaniem bakterii, same bakterie są często niewystarczające do całkowitego zahamowania rozwoju nowotworów. W celu wzmocnienia pozytywnych wyników bakteryjnej terapii przeciwnowotworowej, zbadano przydatność eukariotycznych i prokariotycznych systemów ekspresji do dostarczania ładunków terapeutycznych, w tym czynników cytotoksycznych, enzymów konwertujących proleki, regulatorów immunologicznych, cząsteczek celujących w zrąb guza oraz siRNA (lista w Tabeli 2). Omówione powyżej prokariotyczne systemy ekspresji są najczęściej stosowanym podejściem, a systemy te zależą od transformacji bakterii za pomocą prokariotycznych plazmidów kodujących docelowe geny70,121,122; w przeciwieństwie do nich, eukariotyczne systemy ekspresji obejmują transdukcję komórek gospodarza, takich jak komórki odpornościowe lub komórki nowotworowe, za pomocą eukariotycznych plazmidów kodujących cDNA docelowych genów123.
Środki cytotoksyczne
Środki cytotoksyczne przenoszone przez bakterie ukierunkowane na guzy mogą mieć wewnętrzną aktywność przeciwnowotworową. W połączeniu z wykorzystaniem indukowalnych promotorów, ekspresja czynników cytotoksycznych może być ściśle kontrolowana w celu zmniejszenia ich toksycznego wpływu na normalne tkanki. Cytolizyna A (ClyA), białko hemolityczne o masie 34 kDa tworzące pory, produkowane przez E. coli, S. Typhimurium i Paratyphi A, może być transportowana na powierzchnię bakterii i wydzielana bez modyfikacji potranslacyjnej. Kilka szczepów bakteryjnych, takich jak E. coli i atenuowane S. Typhimurium, zostało zmodyfikowanych w celu ekspresji ClyA z konstytutywnego promotora5 lub z indukowalnych promotorów aktywowanych arabinozą5 lub doksycykliną7, a szczepy te wykazały doskonałe działanie hamujące rozwój nowotworów.
Indukcja apoptozy w komórkach nowotworowych jest obiecującą strategią terapii przeciwnowotworowej. Apoptin, białko pochodzące z wirusa anemii kurzej, selektywnie indukuje apoptozę w dużej liczbie ludzkich typów komórek nowotworowych poprzez szlak niezależny od p53, niewrażliwy na Bcl-2, bez wpływu na prawidłową tkankę124. Poprzez transformację eukariotycznego plazmidu ekspresyjnego apoptyny (pCDNA3.1) do atenuowanego szczepu S. Typhimurium, Wen i wsp. zaobserwowali znaczącą regresję guza z minimalną toksycznością ogólnoustrojową u myszy noszących ludzkiego raka krtani65. Inne czynniki cytotoksyczne, które mogą być podobnie wykorzystywane do indukowania apoptozy, obejmują trzech członków rodziny TNF-α (TNF-α, TRAIL i ligand Fas); jednak ze względu na krótki okres półtrwania i hepatotoksyczność, przydatność tych ligandów cytotoksycznych jest ograniczona przez ich niewystarczającą ekspozycję na guza i szkodliwy wpływ na czynność wątroby125. Aby poprawić biodostępność i trwałość tych białek, wykorzystano bakterie do dostarczania ich bezpośrednio do obszaru guza48,78,126,127. Forbes i wsp. wyhodowali niepatogenny szczep S. Typhimurium wykazujący ekspresję murine TRAIL pod kontrolą promotora recA indukowanego promieniowaniem. Po napromieniowaniu TRAIL był wydzielany, po czym znacznie opóźniał wzrost guza sutka i zmniejszał ryzyko śmierci48.
Invasin, białko powierzchniowe Yersinia, może selektywnie wiązać się z integryną β1 w celu wywołania wejścia bakterii do komórek gospodarza. Wykorzystując niepatogenny, rekombinowany, inwazyjny szczep E. coli koekspresjonujący inwazynę i modelowy antygen owalbuminy, jak również LLO, Critchley-Thorne i wsp. wykazali, że zmodyfikowany szczep może najeżdżać na komórki wykazujące integrynę β1 i dostarczać białka do guzów w celu uzyskania efektów terapeutycznych u myszy128. Azuryna, niskocząsteczkowe białko redoks, może być skutecznie internalizowana w celu zainicjowania apoptozy komórek nowotworowych poprzez podniesienie wewnątrzkomórkowego poziomu p53 i Bax w celu indukcji uwalniania mitochondrialnego cytochromu c do cytosolu. Skuteczność dostarczania azuryny opartej na E. coli w hamowaniu wzrostu mysiego czerniaka B16 i mysiego raka piersi 4T1 wykazał Nissle w 1917 r.; co więcej, podejście to zapobiegało również przerzutom płucnym i stymulowało reakcje zapalne29.
Enzymy konwertujące proleki
Wyrażenie enzymów konwertujących proleki może przekształcać proleki w czynniki cytotoksyczne specyficznie w regionie guza. Zbadano przydatność tej strategii do poprawy skuteczności leczenia nowotworów i zmniejszenia efektów ubocznych związanych z podawaniem systemowym. Kilka enzymów konwertujących proleki zostało dostarczonych przez bakterie96,129,130,131. Deaminaza cytozyny (CD) przekształca nietoksyczną 5-fluorocytozynę (5-FC) w czynnik chemioterapeutyczny 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU jest wysoce toksyczny, ponieważ jest dalej metabolizowany do produktu, który zakłóca syntezę DNA i RNA132,133,134,135. Po jednoczesnym podaniu pacjentom atenuowanego szczepu S. Typhimurium (VNP20009) wyrażającego E. coli CD i 5-FC, obserwowano konwersję 5-FC do 5-FU, co wskazuje na bakteryjną produkcję funkcjonalnego CD w guzie54.
System kinazy tymidynowej/gancyklowiru (HSV1-TK/GCV) wirusa opryszczki pospolitej typu I jest kolejnym połączeniem enzymu konwertującego prolek i leku, które było szeroko badane pod kątem zastosowania w terapii nowotworów. Specyficzna dla tkanki guza ekspresja HSV1-TK może przekształcić nietoksyczny prekursor ganciclovir w 3-fosforan gancicloviru, toksyczną substancję, która zabija komórki guza. Liu i wsp. badali skuteczność in vivo szczepu Bifidobacterium infantis wykazującego ekspresję HSV1-TK i GCV w terapii prolekowej w modelu szczurzego guza pęcherza moczowego. Wyniki wykazały, że to ukierunkowane podejście może skutecznie hamować wzrost szczurzego guza pęcherza moczowego poprzez zwiększenie ekspresji kaspazy 3 i indukowanie apoptozy131. Inny szczep dostarczający enzym konwertujący proleki, E. coli DH5α wyrażający β-glukuronidazę, która hydrolizuje glukuronid proleku 9ACG do inhibitora topoizomerazy I 9-aminokamptotecyny (9AC), wykazał skuteczne hamowanie wzrostu guza129. Wykorzystanie atenuowanego S. Typhimurium VNP20009 jako wektora do dostarczania karboksypeptydazy G2 wykazało zwiększoną skuteczność przeciwnowotworową w połączeniu z podawaniem proleku130.
Immunomodulatory
Cytokiny mogą wywierać działanie przeciwnowotworowe poprzez ułatwianie proliferacji, aktywacji i różnicowania komórek układu odpornościowego, poprzez indukowanie apoptozy w komórkach nowotworowych oraz poprzez działanie antyangiogenne na naczynia krwionośne guza. Kilka cytokin, w tym GM-CSF, IL-12 i IL-18, weszło do badań klinicznych w terapii nowotworów136. Cytokiny wyrażone przez bakterie ukierunkowane na guz były dostarczane specjalnie do obszaru guza, gdzie zwiększały przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną w TME20,29,49,62,137,138,139,140. Dożylne podawanie atenuowanego szczepu S. Typhimurium wykazującego ekspresję IL-18 hamowało wzrost guza pierwotnego u myszy, indukowało masywną infiltrację leukocytów (głównie granulocytów) oraz zwiększało rekrutację komórek NK i CD4+ T, ale nie CD8+ T. Ponadto, podejście to zwiększyło również produkcję cytokin w obszarze guza, w tym IL-1β, TNF-α, IFN-γ i GM-CSF49. IL-2 jest najszerzej badaną cytokiną w kontekście bakteryjnych systemów dostarczania. Doustne podawanie szczepu S. Typhimurium Ty21a wyrażającego IL-2 hamowało rozwój raka wątrobowokomórkowego (HCC) w modelach mysich23,29. Flagellina, która aktywuje wrodzony układ odpornościowy poprzez TLR5, została uznana za doskonały adiuwant w immunoterapii141. Nasza grupa leczyła myszy z rakiem jelita grubego atenuowanym szczepem ΔppGpp S. Typhimurium wyrażającym heterologiczną flagellinę i wykazała, że wzmacnia ona odporność przeciwnowotworową poprzez współpracę ze szlakami sygnałowymi TLR4 i TLR5. Takie podejście promuje również zmianę M2 na M1 w makrofagach i zwiększa poziom tlenku azotu w guzach20.
Zainżynierowane bakterie wyrażające antygeny związane z nowotworem mogą uwrażliwiać TME i przezwyciężyć samo-tolerancję wzbudzoną przez limfocyty T regulatorowe, wywołując w ten sposób odpowiedzi efektorowe i pamięciowe limfocytów T w kierunku komórek nowotworowych wytwarzających antygen142,143. Opisano szereg antygenów związanych z rakiem prostaty. Szczepionki oparte na bakteriach przeciwko antygenowi swoistemu dla prostaty (PSA) były testowane na kilku modelach mysich139,144. Dostarczenie endogennego genu PSA za pomocą atenuowanego S. Typhimurium SL7207-zwolniło tolerancję immunologiczną na antygeny komórek macierzystych prostaty u myszy i znacząco opóźniło wzrost guza84. Terapia genowa wykorzystująca antygeny przeciwko HER-2/neu143, NY-ESO-183, survivin88 i Mage-b145 również wykazała obiecujące efekty hamowania wzrostu guza.
Wielkie zainteresowanie wzbudziła terapia nowotworów z zastosowaniem blokady punktów kontrolnych układu odpornościowego (ICB). Pomimo sukcesów terapii ICB w badaniach klinicznych, tylko niektórzy pacjenci odnoszą korzyści z tego leczenia. Istnieje kilka przyczyn oporności gospodarza leżących u podstaw tego efektu, z których najważniejszą jest immunosupresyjny TME146,147. Badania wykazują, że kolonizacja guza przez bakterie może indukować reakcje prozapalne obejmujące zwiększoną ekspresję IL-1β, TNF-α i IFN-γ, jak również aktywację komórek NK i T; dlatego połączenie ICB i terapii bakteryjnych może przezwyciężyć oporność gospodarza131.
Celowanie w zrąb guza
Angiogeneza odgrywa ważną rolę we wzroście guza i przerzutach. Celowanie w neowaskularyzację guza stanowi obiecujący kierunek w terapii nowotworów. Endostatyna jest 20 kDa C-końcowym fragmentem kolagenu typu XVIII, który może hamować tworzenie naczyń nowotworowych w sposób zależny od dawki, bez oczywistych skutków ubocznych lub oporności na leki148,149. Xu i wsp. sklonowali endostatynę i siRNA przeciwko transduktorowi sygnału i aktywatorowi transkrypcji 3 (Stat3) w atenuowanym szczepie S. Typhimurium. Następnie badali skuteczność terapeutyczną szczepu w ortotropowym HCC i wykazali, że może on hamować proliferację guza i przerzuty, zmniejszać ilość mikrokrążenia nowotworowego, zwiększać populację komórek T CD4+/CD8+ i poziom ekspresji kilku cytokin zapalnych (w tym IFN-γ i TNF-α) oraz zmniejszać ekspresję TGF-β, regulatorowych komórek T i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)149. VEGF i jego receptor (VEGFR) regulują angiogenezę nowotworów121,145. Doustne podawanie atenuowanego S. Typhimurium SL3261 wyrażającego zewnątrzkomórkową domenę VEGFR2 hamowało wzrost guza, neowaskularyzację i przerzuty do płuc. Co więcej, odsetek komórek T CD4+ i CD8+ w obszarze guza również znacząco wzrósł121. Endoglina (CD105) jest członkiem rodziny receptorów TGF-β. TGF-β1 i hipoksja mogą zwiększać aktywność promotora genu endogliny, a promotor ten jest wysoce aktywny w nowotworowych komórkach śródbłonka. Dlatego endoglinę uznano za cel terapii przeciwnowotworowej150. Paterson i wsp. wykorzystali szczepionki na bazie Listeria przeciwko CD105, Lm-LLO-CD105A i Lm-LLO-CD105B do leczenia raka piersi w modelu mysim. Szczepionki te stymulowały silny efekt antyangiogenny i przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, która hamowała guzy pierwotne i przerzutowe151.
Wyciszanie genów
siRNA, klasa dwuniciowych RNA o długości 20-25 par zasad, które pośredniczą w wyciszaniu specyficznych genów docelowych, zapewniły obiecujące podejście do terapii przeciwnowotworowej. Jednak największą barierą w terapii interferencji RNA jest potrzeba specyficznego dostarczania siRNA do obszaru guza. Bakteryjne systemy dostarczania siRNA przeciwko Stat363,122,149,152, IDO153,154, survivin155, Sox230 i związanej z cyklem komórkowym kinazie polo-podobnej 1 (PLK1)57 zostały przetestowane w mysich modelach nowotworów. Doustne podawanie atenuowanego szczepu S. Typhimurium posiadającego eukariotyczny plazmid ekspresyjny kodujący siRNA-Stat3 zwiększyło aktywność komórek NK i funkcję limfocytów T oraz podniosło odsetek limfocytów T CD8+, podczas gdy zmniejszyło liczbę limfocytów T regulatorowych CD4+ CD25+ w guzie; efekty te doprowadziły do zahamowania wzrostu guza i przedłużyły przeżycie myszy noszących guz122. Wyciszenie ekspresji IDO gospodarza za pomocą szczepu S. Typhimurium VNP20009 wyrażającego shIDO wywołało znaczną infiltrację guza przez neutrofile wielojądrzaste generujące ROS, co promowało wewnątrzkomórkową śmierć komórek i znaczną kontrolę czerniaków B16F10153 i raków jelita grubego CT26 lub MC38156.
.