自動DNAシーケンスで最も重要な要素の1つは適切なプライマーデザインです。 この文書では、このプロセスの手順と避けるべき主な落とし穴について説明します。
**** Use a Computer to Design Primers ****
プライマーの設計には、設計上の致命的な欠陥を確認するためにコンピューターを使用することを強くお勧めします。 多くのプログラムがこの解析を行うことができる。 例えば、ウェブで「Primer3」を検索する。
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シーケンスプライマーは、予測可能な場所で、予測可能な鎖上でターゲットDNAにアニールできなければなりません。 さらに、Taq DNA Polymeraseによる伸長も可能でなければなりません。
適切なプライマー配列を選択するために、DNA配列をどのように調べたらよいか、混乱している人もいることでしょう。 初心者が覚えておくべきことをいくつか紹介します。
- 配列は常に5′から3′まで書かれています。 これには、鋳型となるDNAの配列（分かっている場合）、それが挿入されるベクターDNAの配列、そして提案されているプライマーの配列が含まれます。 プライマーの配列を逆に書くと、自分や他人を混乱させるだけなので絶対にやめましょう。
- ポリメラーゼは常にプライマーの3′端を伸ばすので、読む配列はプライマー自身と同じ鎖（センスまたはアンチセンス）になります。
- したがって、ソース配列（たとえばベクター）で読めるプライマー配列を選ぶと、得られる配列はプライマーの右（3′）端から伸びます。
- 逆に、「ソース」配列で読めるものとは反対の鎖からプライマーを選ぶと、得られる配列は左に向かって読めることになります。
以下にいくつかの例を示します。
Multiple Cloning Site（MCS）の周りに以下の配列があるベクターを用意したとします。
TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI
目的の DNA を BamHI と EcoRI サイトの間にクローンした場合、プライマー ‘CTTGATGCTAGTACTACATC’ (5′ to 3′ と書いてあることを思い出してください) を使用して配列決定すると、Core から以下の配列が得られます:
TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)
代わりに、もう一方の鎖 (Eco から Bam) から配列を取得したいとしたらどうしますか。 この場合、右側の配列を選択し、それを逆補完してから、オリゴをリクエストする必要があります。 上の図から配列を選ぶと、
CTGATGCTCATATGTTAATA
これはプライマー配列ではなく、上の配列からそのままコピーしたものです。 実際、この配列をプライマーに使うと、シーケンスはインサートから遠ざかるように右方向に進むことになる。
TATTAACATATGAGCATCAG
この配列を逆補数すると、反対側の鎖の配列になるはずです。 配列決定でプライマーのすぐ下流のヌクレオチドがわかることは稀です。 私は上記の例で教訓的な許可を得ました。
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一般に、拡張したい既知の配列が少量ある状態から開始します。 ここでは、その進め方について説明します。 自動化された配列決定（実際にはどんな配列決定でも）には、有限の確率でエラーが発生します。 プライマーから離れすぎている配列は疑わしいと考えなければならない。 何が「遠すぎる」のかを判断するために、ABIシーケンサーから得られたデータの妥当性を評価する方法を説明したメモ Interpretation of Sequencing Chromatograms を読むことをお客様に強くお勧めします。 プライマーの配置は、シーケンスエラーの可能性が低い領域を選択する。 II. 自分の目的を最もよく反映する領域に限定して検索する。
得られた配列データを最大限に活用したい場合もあれば、テンプレート中の特定の位置の配列だけを調べればよい場合もあります。
- エラーの可能性を最小限に抑えながら、得られる配列を最大限にする：
一般的に、プライマーの元となる配列の正確さに自信がある限り、できる限り3′側にプライマーをデザインすべきである。 - 特定領域のターゲットシークエンス：
目的の配列がクロマトグラムの最も正確な領域に入るように、プライマーを配置する。 配列データはプライマーから80-150塩基程度離れたところが最も正確であることが多い。 プライマーから50塩基以下、あるいは300nt以上離れてはいけない（ただし、プライマーの直後から始まる配列が得られることが多く、700ntの正確な配列を返すことが多い）
III. 候補となるプライマーを探す。
サイクルシーケンスに適した条件下で、鋳型DNAと安定した塩基対を形成するシーケンス用プライマーの候補を特定する。 このステップではコンピュータを使用することを強くお勧めします。 プライマーの特徴：
- 長さは18〜30nt、最適は20〜25nt（ただし30より長く、18より短いプライマーで成功した例もある）。
- G-Cの含有率は40-60%が望ましい。
- Tmは55℃から75℃が望ましい。警告：古い「G-Cは4度、A-Tは2度」のルールは、特に20ntより短いオリゴや25nmより長いオリゴではうまく機能しない。 その代わり、
Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)
Tm calculatorをhttp://www.rnature.com/oligonucleotide.html.
IVで試してみてください。 望ましくない自己ハイブリダイゼーションを示すプライマーは廃棄する。
自己ハイブリダイズするようなプライマーは、テンプレートにハイブリダイズすることができない。 一般的には、自分自身と4つ以上の連続した結合、あるいは合計8つ以上の結合を形成できるようなプライマーは避ける。
5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'
このオリゴはそれ自身と実質的に安定した二量体を形成し、2か所で4つの連続した結合と合計8つの鎖間結合を持つ。
一時的にでもハイブリダイズする3末端のあるプライマーはポリメラーゼ作用により伸び、プライマーはダメになって偽バンドが発生する。 3′二量体を避けるには、やや厳重にする。 例えば、次のようなプライマーは、それ自体が完全な3′ハイブリダイゼーションで自己二量化する：
5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'
上のオリゴはかなり悪く、ほぼ確実に問題を起こす。 ポリメラーゼはシークエンス反応中に3′末端を伸長し、非常に強い配列ACTATGCを与えることに注意してください。 このようなバンドは、「実際の」データの最初に巨大なピークとして現れ、正しい配列を隠してしまう。 ほとんどのプライマー設計プログラムは、このような自己二量化プライマーを正しく検出し、それを避けるように警告してくれる
しかし、どんなコンピュータープログラムも経験則も、プライマーの成功や失敗を正確に予測することはできないことに注意してください。 限界と思われるプライマーがうまく機能することもあれば、完璧と思われるプライマーがまったく機能しないこともある。 明らかな問題は避け、最良のプライマーを設計する。しかし、選択肢が少ないピンチの時には、潜在的な欠陥にかかわらず、いくつかの候補のプライマーを試してみることだ。 既知の全鋳型配列について、配列の相同性検索（ドットプロットホモロジー比較など）を行い、プライマーの代替部位がないかを確認する。 そのような部位に結合する傾向が顕著なプライマーは廃棄する。 どの程度が「有意」なのかについては、大まかな目安を示すにとどめる。 (1)プライマリーサイトと90%以上の相同性がある、(2)3末端に7つ以上の連続した相同ヌクレオチドがある、(3)プライミングサイトより5倍以上存在量が多い、などの代替部位があるプライマーは避ける。 VI. プライマー候補の中から選択する。
この時点でいくつかのプライマー候補がある場合、3末端がよりA-Tリッチなものを1つ、あるいは数個選択することができる。 ある研究者によれば、これらのプライマーは作用がやや特異的である傾向がある。 複数のプライマーを使って、成功の可能性を最大化するのもよいだろう。
上記の基準をクリアした候補がない場合は、選択要件の厳しさを緩和せざるを得ないかもしれない。 最終的には、良いプライマーのテストはその使用においてのみであり、これらの単純化されたルールオブサムによって正確に予測することはできない
幸運にも、あなたはプライマーのために多くの選択肢を持っている。 配列の組み立てプロジェクトでは、本当に必要だと思う数よりも多くのプライマーを設計し、配列が期待したほど長くなくても、配列のコンセンサスを保証するのに十分な重複データを得ることができるようにする。 より確実な確認のために、両鎖の配列を決定することをお勧めする。 片方の鎖には、プライマーを500〜700ntの間隔で配置する（間隔は短い方が安全である！）。 反対側の鎖には、下の図のように、最初の鎖のプライマーから千鳥になるようにプライマーを配置する：
