The Berg Lab

Questa guida è adattata dal Dipartimento di Biochimica e Biofisica Molecolare dell’Università dell’Arizona Programma di Biologia Generale per insegnanti di scienze: Drosophila Melanogaster and Mendelian Genetics, di Pete Geiger.

Un’introduzione a Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster è una piccola, comune mosca che si trova vicino a frutta acerba e marcia. È stata utilizzata per oltre un secolo per studiare la genetica e il comportamento. Thomas Hunt Morgan era il biologo preminente che studiava la Drosophila all’inizio del 1900. Fu il primo a scoprire il sex-linkage e la ricombinazione genetica, che pose la piccola mosca all’avanguardia della ricerca genetica. Grazie alle sue piccole dimensioni, alla facilità di coltura e al breve tempo di generazione, i genetisti hanno usato la Drosophila da allora.

Le mosche della frutta sono facilmente ottenibili in natura e molte aziende di scienze biologiche hanno una varietà di mutazioni diverse. Inoltre queste aziende vendono qualsiasi attrezzatura necessaria per coltivare le mosche. I costi sono relativamente bassi e la maggior parte dell’attrezzatura può essere usata anno dopo anno. Ci sono una varietà di esercizi di laboratorio che si potrebbero acquistare, anche se la necessità di farlo è discutibile.

Perché usare la Drosophila?

Gli insegnanti dovrebbero usare i moscerini della frutta per gli studi genetici delle scuole superiori per diverse ragioni:
1. Sono piccoli e facilmente maneggiabili. Sono piccoli e facilmente maneggiabili.
2. Possono essere facilmente anestetizzati e manipolati individualmente con attrezzature non sofisticate.
3. Sono sessualmente dimorfici (maschi e femmine sono diversi), rendendo abbastanza facile differenziare i sessi.
4. I moscerini della frutta vergini sono fisicamente distinti dagli adulti maturi, rendendo facile ottenere maschi e femmine vergini per incroci genetici.
5. I moscerini hanno un breve tempo di generazione (10-12 giorni) e stanno bene a temperatura ambiente.
6. La cura e la cultura dei moscerini della frutta richiede poca attrezzatura, è a basso costo e usa poco spazio anche per colture grandi.

Utilizzando la Drosophila, gli studenti:
1. Capire la genetica mendeliana e l’ereditarietà dei tratti
2. Trarre conclusioni sui modelli di ereditarietà dai dati ottenuti
3. Costruire trappole per catturare popolazioni selvatiche di D. melanogaster
4. Acquisire una comprensione del ciclo vitale di D. melanogaster, un insetto che mostra una metamorfosi completa
5. Costruire incroci tra mosche catturate e mosche conosciute di tipo selvatico e mutate
6. Imparare le tecniche per manipolare le mosche, sessarle e tenere note concise sul diario
7. Imparare le tecniche di coltura per mantenere le mosche sane
8. Rendersi conto che molti esperimenti scientifici non possono essere condotti e conclusi in una o due sessioni di laboratorio

Standard nazionali trattati in queste lezioni:
Contenuto:
1. Gli organismi richiedono un insieme di istruzioni per specificare i tratti (ereditarietà)
2. L’informazione ereditaria si trova nei geni.
3. Combinazioni di tratti possono descrivere le caratteristiche di un organismo.

Obiettivi degli studenti:
1. Identificare domande e concetti che guidano le indagini scientifiche
2. Progettare e condurre indagini scientifiche
3. Formulare e rivedere spiegazioni e modelli scientifici usando la logica e le prove
4. Comunicare e difendere un argomento scientifico

La genetica della Drosophila è ben documentata e diversi siti web di dominio pubblico presentano il genoma completo annotato. Pertanto, quegli insegnanti o studenti che desiderano vedere dove si verificano le loro mutazioni hanno un riferimento pronto a disposizione.

Siccome Drosophila è stata così ampiamente utilizzata in genetica, ci sono molti tipi diversi di mutazioni disponibili per l’acquisto. Inoltre, lo studente attento può trovare mutazioni all’interno delle proprie colture selvatiche poiché, a causa del breve tempo di generazione, le mutazioni sono relativamente comuni rispetto ad altre specie animali.
Classificazione
Dominio: Eukarya
Kingdom: Animalia
Phylum: Arthropoda
Classe: Insecta
Ordine: Diptera
Famiglia: Drosophilidae
Genere: Drosophila (“amante della rugiada”)
Specie: melanogaster (“budello scuro”)
Ciclo vitale di Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster presenta un metamorfismo completo, il che significa che il ciclo vitale comprende un uovo, una forma larvale (verme), una pupa e infine l’emersione (eclosure) come adulto volante. Questo è lo stesso della ben nota metamorfosi delle farfalle. Lo stadio larvale ha tre istari, o mute.

Giorno 0: La femmina depone le uova
Giorno 1: Le uova si schiudono
Giorno 2: Primo instar (un giorno di lunghezza)
Giorno 3: Secondo instar (un giorno di lunghezza)
Giorno 5: Terzo e ultimo instar (due giorni di lunghezza)
Giorno 7: Le larve iniziano lo stadio vagante. La puparizzazione (formazione delle pupe) avviene 120 ore dopo la deposizione delle uova
Giorno 11-12: Eclosione (gli adulti emergono dalla pupa).

Le femmine diventano sessualmente mature 8-10 ore dopo l’eclosione

– Il tempo di generazione di Drosophila melanogaster varia con la temperatura. Il ciclo di cui sopra è per una temperatura di circa 22°C (72°F). Le mosche allevate a temperature più basse (a 18°C, o 64°F) impiegheranno circa il doppio del tempo per svilupparsi.
– Le femmine possono deporre fino a 100 uova al giorno.
– Le femmine vergini sono in grado di deporre le uova; tuttavia saranno sterili e in numero ridotto.

Dopo la schiusa delle uova, piccole larve dovrebbero essere visibili nel terreno di coltura. Se il vostro terreno è bianco, cercate la piccola area nera (i ganci della bocca) sulla testa delle larve. Alcuni terreni premiscelati essiccati sono blu per aiutare a identificare le larve, ma non è necessario e con un po’ di pazienza e pratica, le larve sono facilmente visibili. Inoltre, quando le larve si nutrono, distruggono la superficie liscia del substrato e quindi guardando solo la superficie si può dire se le larve sono presenti. Tuttavia, è sempre una buona idea ricontrollare con uno stereomicroscopio. Dopo il terzo stadio, le larve cominceranno a migrare su per la fiala di coltura per impuparsi.

Cura, manutenzione e manipolazione della Drosophila

Introduzione
Per incorporare i moscerini della frutta in classe, sarà necessario mantenere colture di mosche per la manipolazione negli incroci e come riserva per eventuali incidenti che possono verificarsi. La coltura è molto facile e si raccomanda di far mantenere agli studenti le proprie colture di mosche. In questo modo, ogni studente o gruppo sarebbe direttamente responsabile della cura e del mantenimento a lungo termine delle mosche, compresa la creazione di grandi popolazioni di colture per i loro incroci. Quando sono coinvolti direttamente, gli studenti guadagnano competenza e una maggiore comprensione dei requisiti e del comportamento delle mosche. L’insegnante dovrebbe rimanere come allenatore, non docente, assistendo gli studenti nelle tecniche. L’istruttore ha bisogno di mantenere le colture di riserva di tutti i ceppi e mutanti utilizzati dagli studenti nel caso in cui il suddetto incidente imprevedibile si verifica e le culture degli studenti si estinguono o si mescolano. Perdere le culture è l’eccezione piuttosto che la regola, e finché gli studenti ricoltivano le loro mosche su base regolare e non si verifica una contaminazione di massa, le mosche possono essere mantenute per decenni.
Bottiglie e fiale
Thomas Hunt Morgan usava bottiglie di vetro per il latte per i suoi esperimenti e, infatti, qualsiasi contenitore va bene, compresi i vasetti per bambini e contenitori assortiti. Tuttavia, per la facilità di coltura e trasferimento delle colture, bottiglie e fiale uniformi sono l’approccio migliore. Entrambi possono essere acquistati in un negozio di forniture biologiche. Le bottiglie sono utilizzate principalmente per il mantenimento di grandi popolazioni di mosche, mentre le fiale di coltura sono utili per il mantenimento di popolazioni più piccole e sono il contenitore preferito per la costruzione di incroci tra studenti. Se c’è il desiderio di mantenere le colture di stock per un lungo periodo di tempo, o di riutilizzare bottiglie e fiale è importante pulirle e sterilizzarle completamente. Questo per prevenire epidemie di parassiti e malattie.

Per pulire bottiglie e fiale, prima congelatele per uccidere eventuali mosche in esse. Rimuovere il cibo, lavare bene, quindi sterilizzare in autoclave (per 20 minuti a 121°C e 15 psi; se i contenitori sono di plastica, assicurarsi che possano essere sterilizzati in autoclave) o lavare in una soluzione di candeggina al cloro al 10%.

Bottiglie e fiale possono essere acquistate in una varietà di dimensioni e materiali. Il vetro è efficace, tuttavia, se caduto, uno studente potrebbe perdere 2 settimane di dati in una singola fuoriuscita. Le fiale di plastica autoclavate (sterili) sono disponibili e sono preferibili per l’uso da parte degli studenti. Le dimensioni delle fiale variano da 96 mm per 25 mm a quelle più grandi, tuttavia le dimensioni più piccole sono raccomandate per fare incroci e mantenere piccole colture. Ci sono una varietà di tappi disponibili, dal cotone morbido ai tappi di schiuma. Questa è una questione di preferenze e costi, tuttavia il cotone funziona bene e può essere acquistato in un negozio di droga locale in un pizzico.
Dove acquistare le forniture:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, A division of Genesee Scientific
Come sono fatti:

Microscopio stereoFiala di DrosophilaBottiglie di Drosophila

Cibo per mosche
Il primo passo nella preparazione delle fiale di coltura è l’aggiunta del cibo. Ci sono una varietà di tipi di cibo disponibili per le mosche; alcuni richiedono la cottura e altri vengono acquistati già preparati e disidratati. Questi ultimi possono essere acquistati da una società di forniture biologiche. Questo è, naturalmente, molto più veloce e più facile che preparare i media cotti, tanto che gli studenti possono riempire le proprie fiale con i media. Tuttavia, deve essere completamente reidratato per ottenere i migliori risultati, poiché questa è l’unica fonte di acqua per gli adulti e le larve. Perciò, seguite i suggerimenti qui sotto per assicurare un mezzo completamente idratato:

Medium disidratato
Aggiungi il mezzo secco alla bottiglia o alla fiala a circa 1/5 – 2/5 del volume. Aggiungere acqua fino a quando i media appaiono completamente inumiditi. Lasciar riposare la fiala per alcuni minuti, aggiungendo ulteriore acqua se necessario, fino a quando il supporto è completamente idratato. La superficie dovrebbe essere umida con un aspetto lucido e non dovrebbero esserci spazi nel supporto. Se i media non sono completamente idratati, la produzione di culture vigorose è compromessa. Le mosche possono essere aggiunte pochi minuti dopo che il terreno è stato idratato. Ricordati di aggiungere diversi grani (ma non di più) di lievito alla superficie dei media prima di aggiungere le mosche.

Media cotti
Quando si distribuiscono media cotti, si dovrebbe riempire la fiala di coltura, la bottiglia o la fiala da 1/5 a 2/5. Tenere i media fuori durante la notte per curare, tenendo le fiale coperte con un panno per evitare che le mosche selvatiche vi depongano le uova. Il giorno dopo, aggiungere il lievito e i tappi. Refrigerare le fiale di media inutilizzate. I media cotti possono essere conservati in frigorifero per diverse settimane. Permettere ai media di riscaldarsi a temperatura ambiente prima di aggiungere le mosche. Non lasciare che i media si asciughino.
Ambiente
Il modo più semplice per crescere le mosche è a temperatura ambiente. Tuttavia, la condizione ottimale di allevamento è una temperatura di 25°C e il 60% di umidità. In queste condizioni il tempo di generazione è più breve (9-10 giorni dall’uovo all’adulto). A meno che l’attrezzatura non sia facilmente disponibile, questo non è necessario per il successo dell’allevamento e dell’incrocio delle mosche. E’ preferibile tenere le mosche lontano da correnti d’aria e dalla luce diretta del sole o da fonti di calore. Questi asciugheranno rapidamente i media, richiedendo frequenti cambi di media e la possibilità di disidratare le mosche.
Anestetizzare le mosche
Il problema con le mosche della frutta è che volano! Perciò sono stati sviluppati diversi metodi per anestetizzare le mosche. Sono inclusi l’etere, marche commerciali come Flynap, anidride carbonica e raffreddamento. Ognuno ha i suoi punti di forza e di debolezza. L’etere è infiammabile, ha un forte odore e ucciderà le mosche se sono troppo anestetizzate (e può anestetizzare gli studenti più giovani!). Il Flynap, della Carolina Biological, è disordinato e ha un odore che alcuni trovano offensivo. Ognuno di questi, tuttavia, richiede attrezzature a basso costo che possono essere facilmente acquistate. L’anidride carbonica funziona molto bene, mantenendo le mosche immobili per lunghi periodi di tempo senza effetti collaterali, tuttavia le stuoie di CO2 (blocchi) sono costose e una fonte di CO2 (di solito una bottiglia) e un sistema di consegna (fiale e morsetti) sono necessari, aumentando i costi. Se si è pieni di risorse, si può usare la CO2 emessa dalle compresse di Alka-Seltzer per anestetizzare le mosche per brevi periodi di tempo. Preparare una grande provetta con un sistema di tubi e tappi. Aggiungere l’acqua nella provetta, poi la pastiglia Alka-Seltzer. Verrà emesso del gas anidride carbonica.

Il meno dannoso per le mosche è l’anestetizzazione con anidride carbonica o con raffreddamento. Di queste due scelte, il raffreddamento è il più semplice, richiedendo solo un congelatore, ghiaccio e piastre di Petri. Inoltre, è l’unico metodo che non influenzerà la neurologia della mosca, quindi gli studi sul comportamento possono iniziare dopo che le mosche si sono riscaldate a sufficienza.
Anestetizzare le mosche per raffreddamento
Per inabilitare le mosche, mettere la fiala di coltura nel congelatore fino a quando le mosche non si muovono, generalmente 8-12 minuti. Scaricare le mosche su una superficie raffreddata. Questo può essere costruito utilizzando la parte superiore di una capsula di Petri, aggiungendo ghiaccio tritato, poi mettendo il fondo della capsula di Petri in cima. L’aggiunta di mosche a questo sistema li manterrà raffreddati abbastanza a lungo per fare ogni esperimento. Basta mettere le mosche di nuovo nella fiala di cultura quando finito. Le mosche si “sveglieranno” relativamente in fretta una volta fuori dal ghiaccio, quindi tenetele al freddo. Non ci sono effetti collaterali di lunga durata per questo metodo, anche se le mosche lasciate nel frigorifero troppo a lungo potrebbero non recuperare. Un altro modo per mantenere le mosche al freddo è l’aggiunta di acqua ai sacchetti per il congelatore, metterli nel congelatore con una capsula di Petri annidata sul sacchetto, e lasciarli congelare.
Trasferimento delle mosche da una fiala all’altra
Le mosche dovrebbero essere trasferite ogni 10-14 giorni. Gli studenti dovrebbero mantenere una cultura di riserva delle loro mosche e l’istruttore dovrebbe mantenere culture di riserva di tutti i ceppi di mosche. Ci sono due modi di base per trasferire le mosche quando si formano nuove culture. Uno non richiede anestesia ma mani veloci.
A) Mettere un imbuto nella bocca di una fiala di cultura fresca che ha già aggiunto i media. Nella vecchia fiala (quella con le mosche), picchiettare delicatamente le mosche verso il basso, battendo dolcemente la fiala su una superficie morbida, come un tappetino per il mouse. Le mosche cadranno sul fondo e vi rimarranno per qualche secondo (non più di questo!), tempo sufficiente per togliere rapidamente il tappo dalla fiala, capovolgerla nell’imbuto, e tamponare delicatamente, insieme, le due fiale per forzare le mosche giù nella nuova fiala.
B) Un modo alternativo è quello di mettere le mosche nel congelatore per circa 8 minuti. Questo farà cadere le mosche in uno stato di torpore. Dopo aver messo un imbuto sulla nuova fiala, invertire la fiala con le mosche immobili nell’imbuto. Questo non è così divertente, ma non avrai nessuna mosca che vola in giro per la classe.
Sessare le mosche
È abbastanza facile distinguere i maschi dalle femmine e con un po’ di pratica gli studenti diventeranno sicuri della loro capacità di farlo. Notate che i maschi sono generalmente più piccoli e hanno un addome più scuro e arrotondato. La colorazione dell’addome è la più facile da riconoscere. Inoltre, i maschi hanno pettini tarsali sul primo paio di zampe. Questi sono neri e molto distintivi, ma possono essere visti solo con un ingrandimento relativamente alto. Con un po’ di pratica, guardando l’addome gli studenti diventeranno abili nel sessare accuratamente le mosche. Sessare le mosche è fondamentale quando si fanno gli incroci, quindi assicurati che gli studenti siano sicuri nell’identificare la differenza tra i sessi. Per far sì che gli studenti si sentano a proprio agio nel sessare le mosche, date o fate loro ottenere 25 o più mosche di sesso misto e permettete loro di dividere le mosche in due mucchi, maschio e femmina. Gli altri studenti del gruppo e l’istruttore dovrebbero verificare l’ordinamento. Ogni membro del gruppo dovrebbe essere in grado di classificare le mosche.
Immagini di maschi e femmine

Nota l’addome più scuro e l’aspetto più arrotondato del maschio. Le femmine tendono anche ad essere più grandi.
Raccogliere le femmine vergini
Sebbene sia una semplice questione di mettere le femmine vergini con i maschi, è importante riconoscere il fattore tempo coinvolto per ottenere le vergini. Le femmine rimangono vergini solo per 8-10 ore dopo l’eclisse e devono essere raccolte entro questo lasso di tempo. NOTA: Le femmine hanno la capacità di immagazzinare lo sperma dopo un singolo accoppiamento, quindi se la femmina per un incrocio non è vergine, non si conoscerà il genotipo del maschio usato per l’incrocio. Si consiglia vivamente di ottenere altre vergini nel caso in cui si commetta un errore di identificazione o la mosca muoia prima che l’accoppiamento e la deposizione delle uova possano avvenire. In una cultura forte, più femmine vergini dovrebbero essere facilmente ottenute. Anche se le femmine sono in grado di deporre le uova come vergini, saranno sterili e non verranno prodotte larve. Di seguito ci sono tre modi per ottenere le vergini, il “metodo di rimozione” è il più incoraggiato per i principianti.
Metodo di rimozione
Rimuovi tutte le mosche 8-10 ore prima della raccolta (generalmente questo viene fatto per prima cosa al mattino). Ispezionare visivamente la superficie del cibo per assicurare la completa rimozione delle mosche. Dopo 8-10 ore (di solito prima di lasciare il lavoro) raccogliere tutte le femmine che sono presenti. Tutte saranno vergini. Mettere in una fiala di cultura fresca e attendere 2-3 giorni per cercare le larve. Le femmine vergini possono deporre le uova, ma saranno sterili. Poiché sono sensibili al fotoperiodo, le femmine tendono a eclissarsi al mattino presto. Pertanto, le raccolte precoci garantiranno il maggior numero di vergini per la sperimentazione. Tuttavia, la raccolta è possibile più tardi nel corso della giornata.
Metodo visivo
Essere in grado di riconoscere le femmine vergini rimuove la necessità di svuotare le fiale di coltura in modo tempestivo e permette agli studenti di raccogliere le proprie senza la necessità di venire in classe a ore strane del giorno. Si noti che le femmine vergini sono molto più grandi delle femmine più vecchie e non hanno la colorazione scura delle femmine mature. Inoltre, nelle prime ore dopo l’eclissamento, sarà visibile una macchia verde scuro (il meconio, i resti del loro ultimo pasto prima di impuparsi) sul lato inferiore dell’addome.
Temperatura ciclica
È possibile massimizzare il numero di vergini in una raccolta mattutina utilizzando la temperatura ciclica. Quando le colture sono mantenute ad una temperatura di 18°C, lo sviluppo è rallentato in modo che le femmine non si accoppino fino a 16 ore dopo la chiusura. Rimuovendo le mosche nel pomeriggio/sera e mettendo le fiale in un incubatore a 18°C, il 98% delle mosche ottenute al mattino saranno vergini. Mettendo le vergini nelle loro stesse fiale per 2-3 giorni eliminerà quel 2% che sono non-vergini.
Immagini di maschi e femmine vergini:

Vole incrociate
Una volta che le femmine sono considerate vergini, aggiungere i maschi. Quando si impostano gli incroci, un rapporto di 3:1 tra femmine vergini e maschi è l’ideale. In genere, i maschi si accoppiano in modo più efficiente se hanno maturato 3 giorni o più. Assicuratevi di selezionare maschi robusti e sani; più vecchie sono le mosche, minore è l’efficienza di accoppiamento. L’accoppiamento avviene rapidamente e il comportamento è interessante da osservare, ma non sarà trattato qui. Le femmine iniziano a deporre le uova fertili subito dopo l’accoppiamento. Fare riferimento alla tabella del ciclo di vita per la prova delle larve F1. Rimuovere gli adulti una volta che è stato stabilito che sono presenti abbastanza larve (in genere 7-8 giorni dopo l’incrocio) in quanto non si può essere in grado di distinguere i genitori dalla generazione F1.
Mosche assassine: L’obitorio
Questa è una spiacevole necessità quando si usano le mosche. In genere si usa una bottiglia o un becher con acqua saponata o olio minerale. Scaricare le mosche anestetizzate direttamente nell’acqua saponata o nell’olio minerale dove annegano. Una bottiglia (becher, o barattolo con tappo a vite) riempita con etanolo o isopropanolo può anche essere usata come obitorio.
Nomenclatura e definizioni di base della genetica della Drosophila

Le mosche della Drosophila melanogaster hanno 4 cromosomi.
Il genotipo è scritto come:

Cromosoma
Cromosoma o Cromosoma / Cromosoma

Questa nomenclatura comune mostra un cromosoma in alto e il suo omologo in basso, come i cromosomi apparirebbero durante la meiosi quando contribuiscono i gameti.

Quando si scrive il genotipo, in generale, i cromosomi sono separati da un punto e virgola.

Cromosoma X; cromosoma II; cromosoma III; cromosoma IV

Il wild-type è indicato come “+” o WT

Le mutazioni dominanti sono scritte con una lettera maiuscola:
Ad esempio: Bar o B

Le mutazioni dominanti sono scritte con una lettera minuscola:
Per esempio: bianco o w

Le mutazioni sono alleli (forme alternative di un gene che occupa un dato locus su un cromosoma) che vengono ereditate con i cromosomi.

Omozigote – Un individuo con lo stesso allele nei loci corrispondenti sui cromosomi omologhi.

Eterozigote – Un individuo con alleli diversi nei loci corrispondenti sui cromosomi omologhi.

Genotipo – I geni che un organismo possiede.

Fenotipo – Gli attributi osservabili di un organismo.

P1 – Generazione dei genitori.

F1 – Generazione filiale, o generazione della prole. F1 è la prima generazione di figli.

F2 – La seconda generazione di figli.
Altre grandi risorse web:

Gerard Manning ha scritto una semplice introduzione alla genetica della Drosophila.

Genetica sulla mosca: A Primer on the Drosophila Model System di Karen G. Hales et al (2015).

Taking Stock of the Drosophila Research Ecosystem di David Bilder e Kenneth D. Irvine (2017).