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L’ossigeno (O2) si evolve durante il trasporto elettronico fotosintetico quando l’acqua viene scissa dal complesso ossigeno-evoluzione per fornire protoni ed elettroni alla catena elettronica cloroplastica, generando così ATP e NADPH-la fonte di energia e potere riducente per il metabolismo delle piante. La maggior parte di questa energia chimica viene utilizzata per guidare il metabolismo del carbonio fotosintetico, che consiste nella carbossilazione del ribulosio-1,5-bisfosfato (ciclo di riduzione del carbonio fotosintetico) e nell’ossigenazione (ciclo di ossidazione del carbonio fotosintetico); con un requisito combinato di elettroni = JA. Quattro elettroni sono richiesti per ogni O2 evoluto, così che la produzione lorda di O2 (GOP) è legata al trasporto lineare di elettroni (J) secondo J/4. Quando il trasporto lineare di elettroni è usato solo per guidare la fissazione di CO2, il consumo di O2 e il rilascio di CO2 dall’ossidazione fotosintetica del carbonio e dalla respirazione mitocondriale è tale che la produzione netta di O2 (NOP) è uguale all’assimilazione netta di CO2 (Anet; purché il quoziente respiratorio sia 1, ma vedi Tcherkez et al, 2017).

Inoltre, gli elettroni possono essere utilizzati per il trasporto alternativo non ciclico di elettroni (ANCET), tra cui, per esempio, la fotoriduzione dell’O2 stesso formando specie reattive dell’ossigeno (reazioni Mehler-perossidasi o “ciclo acqua-acqua”; Asada, 1999), l’anabolismo cloroplastico (per esempio lipidi; Stumpf et al, 1963), la riduzione dell’ossalacetato a malato (che viene esportato nei mitocondri; Scheibe, 2004), e l’assimilazione dell’azoto (Bloom et al., 1989). L’ANCET è stato ipotizzato sia come un modo per regolare il rapporto ATP/NADPH per soddisfare le mutevoli richieste energetiche del metabolismo cellulare, sia come un meccanismo per prevenire il fotodanneggiamento attraverso l’utilizzo del riduttore in eccesso quando la densità del flusso di fotoni supera il requisito energetico della fissazione della CO2 (ad esempio in condizioni di alta irradiazione, temperature fredde, stress idrico che chiude gli stomi; ad esempio Badger, 1985; Ort e Baker, 2002; Robinson, 1988). È importante notare che non ci sono prove formali su come i flussi di elettroni interagiscano, in particolare in condizioni di luce fluttuante (Morales et al., 2018).

Poiché ANCET permette di sostenere tassi maggiori di trasporto lineare di elettroni, il trasporto totale di elettroni (Jt) sarà maggiore di JA. Al contrario, l’effetto sull’assorbimento di O2 dipenderà dalla via metabolica coinvolta. Per esempio, nelle reazioni Mehler-perossidasi, non c’è un cambiamento netto di O2 così che NOP rimarrà uguale a Anet. Ma nella riduzione del nitrato, il rapporto tra la produzione di O2 legata al N e il consumo di O2 dipende fortemente dall’aminoacido sintetizzato (Noctor e Foyer, 1998). In questo caso, NOP non sarà sempre uguale a Anet perché O2 e CO2 potrebbero non essere equilibrati nel metabolismo (Skillman, 2008). Di conseguenza, le misure concomitanti dei flussi di CO2 e O2 sono importanti per la comprensione di come le piante regolano l’uso dell’energia luminosa, con diversi destini che hanno esiti metabolici molto diversi.

Le prime misure dell’evoluzione dell’O2 non erano in grado di distinguere il GOP dall’assorbimento di O2 (Hill, 1937). Il metodo di spettrometria di massa stabilito da Mehler e Brown (1952) ha risolto questo problema utilizzando traccianti isotopici di O2 per monitorare indipendentemente i flussi di 16O2 e 18O2. In questo metodo, il 18O2 puro è stato fornito allo spazio di testa del gas di una camera chiusa, e il declino del 18O2 è stato attribuito all’assorbimento di O2. L’O2 evoluto ha la stessa composizione isotopica dell’acqua da cui è generato; in questo caso, l’isotopo dominante nell’acqua era 16O (Fig. 1). L’approccio di etichettatura 18O è stato ulteriormente applicato a dischi di foglie (per esempio Tourneux e Peltier, 1995), intere foglie escisse (per esempio Volk e Jackson, 1972), e intere piante (Gerbaud e André, 1980), illuminando il destino dell’O2 in vivo.

La limitazione dei sistemi chiusi di scambio di gas è che le misurazioni possono essere effettuate solo per brevi periodi di tempo (da secondi a minuti) prima che la concentrazione di CO2 si esaurisca. Di conseguenza, CO2:O2 non è costante, il che cambia i tassi relativi di carbossilazione e ossigenazione in modo che le stime di assorbimento di GOP e O2 siano imprecise. Questa limitazione è stata superata nell’approccio della spettrometria di massa sostituendo la CO2 consumata attraverso l’afflusso periodico di CO2 nella camera, permettendo la quantificazione dello stato stazionario ed estendendo la capacità di misurare i flussi di O2 in una gamma di condizioni e stati fisiologici (Canvin et al., 1980). Allo stesso tempo, sono stati fatti progressi nell’uso della fluorescenza della clorofilla, che fornisce informazioni sulla resa quantica del PSII (Baker, 2008). Genty et al. (1989) hanno fornito il collegamento empirico tra la fluorescenza e il tasso di trasporto degli elettroni, sostituendo la necessità di misurare direttamente l’evoluzione dell’O2. La fluorescenza della clorofilla è ora una delle tecniche più popolari in fisiologia vegetale a causa della sua facilità d’uso e del costo relativamente basso. Ciò è stato favorito dalla capacità di multiplexare le misure di fluorescenza con lo scambio di gas H2O e CO2 in strumenti portatili e disponibili in commercio, aprendo la possibilità di misurare la funzione delle piante fuori dal laboratorio. Di conseguenza, le misure in vivo dei flussi di O2 sono sostanzialmente diminuite negli ultimi 20 anni.

In questo numero di Plant Physiology, Gauthier et al. (2018) ci ricordano perché è così importante riportare la nostra attenzione su O2, fornendoci un nuovo, elegante sistema a percorso aperto per misurare i flussi di O2. Il loro metodo è un approccio isotopico “inverso”, che coinvolge la marcatura 18O dell’acqua delle foglie piuttosto che dell’aria in modo che la composizione isotopica di O2 che si evolve durante la scissione dell’acqua abbia una firma molto diversa da quella dell’O2 ambientale (Fig. 1). L’uso di un considerevole arricchimento di 18O è imperativo poiché il contributo di NOP in uno sfondo di 21% di O2 è probabilmente dell’ordine dello 0,05% (ad esempio 100 μmol mol-1 NOP/210.000 μmol mol-1 O2 ambientale), rendendo difficile normalmente rilevare con precisione un cambiamento nel δ18O di O2 associato a NOP nell’aria che circonda la foglia.

Il metodo rimane altamente tecnico, richiedendo l’uso di tre strumenti di alta precisione. La composizione isotopica e la concentrazione del vapore di CO2 e H2O sono misurate tramite spettroscopia laser, e il δ18O2 e il δO2/N2 (per stimare la concentrazione di O2) tramite spettrometria di massa. Una camera su misura è anche necessaria per ospitare la foglia escoriata e la sua fonte di acqua marcata con 18O, che aiuta a prevenire le perdite attraverso le guarnizioni da intorno al picciolo. È importante notare che il sistema di scambio di gas aperto migliora la capacità di ottenere misure di stato stazionario, e l’etichettatura dell’acqua rispetto all’uso di gas 18O2 puro risolve il problema dell’accessibilità, che ha notevolmente limitato l’adozione di sistemi aperti.

Mentre la fluorescenza della clorofilla è diventata l’opzione popolare per misurare il tasso di trasporto degli elettroni, non è senza presupposti. Per esempio, si presume spesso che le foglie assorbano l’84% dei fotoni incidenti e che il 50% di questi fotoni siano assorbiti dal PSII; tuttavia, questo potrebbe non essere sempre il caso (Baker, 2008). Questo può portare a una sovrastima del tasso di trasporto degli elettroni quando si calcola dalla fluorescenza rispetto alle misurazioni del GOP. Inoltre, la determinazione accurata di JA è particolarmente rilevante per la stima della conduttanza del mesofillo, che era un’applicazione evidenziata da Gauthier et al. (2018). Le reazioni Mehler-perossidasi, che hanno dimostrato di variare dallo 0% al 30% (Driever e Baker, 2011), porterebbero a una sovrastima dei flussi di elettroni associati ai cicli di riduzione/ossigenazione del carbonio fotosintetico in entrambi i metodi. Tuttavia, il vantaggio dell’approccio di etichettatura isotopica è che il contributo della reazione di Mehler alla produzione lorda di O2 può essere quantificato accoppiando le misure di GOP con NOP (ad esempio, Furbank et al., 1982; vedi Fig. 1). Ora che abbiamo una rinnovata capacità di misurare i flussi di O2, queste ipotesi non dovrebbero essere ignorate.

Oltre alla comprensione del trade-off tra efficienza e fotoprotezione per una migliore produzione agricola (Murchie e Niyogi, 2011), i diversi destini degli elettroni hanno importanti implicazioni per la comprensione dei flussi globali di O2. In particolare, l’assorbimento di O2 associato alla fotorespirazione, alla respirazione mitocondriale e alle reazioni Mehler-perossidasi hanno diversi fattori di frazionamento isotopico (Guy et al., 1993), così che la quantificazione dei flussi dei singoli percorsi è necessaria per vincolare le stime della produzione primaria globale dalle informazioni δ18O (Welp et al, 2011).

È giunto il momento di rivisitare la misurazione dei flussi di O2, e il nuovo metodo sviluppato da Gauthier et al. (2018) ci fornisce la capacità necessaria per farlo.