PMC

DNE NELLA REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE

Le DNE possono anche sorgere nel contesto della regolazione trascrizionale. Per esempio, una DNE può essere ottenuta rimuovendo il dominio di transattivazione di una TF modulare, lasciando solo il dominio di legame al DNA. Questo fattore troncato può comportarsi come un inibitore competitivo della trascrizione. Questo è noto che si verifica in natura. Per esempio, la proteina C/EBP nei mammiferi è espressa come tre polipeptidi alternativi. I polipeptidi più lunghi contengono un dominio di attivazione trascrizionale N-terminale, mentre la forma corta ne è priva. Poiché le isoforme lunghe e corte si assemblano in omo- ed eterodimeri, quest’ultima si comporta come un DN naturale (Zahnow et al., 1997). Questo è anche il caso di Stats 5 e 6 nei vertebrati, che sono in grado di dimerizzare. La loro elaborazione proteolitica in risposta a segnali fisiologici porta alla rimozione del dominio di attivazione C-terminale e li converte in potenti inibitori che regolano negativamente la trasduzione del segnale (Nakajima et al., 2003). Nelle piante, un gran numero di proteine MYB funzionano come regolatori trascrizionali. Nell’Arabidopsis, le proteine che contengono una singola ripetizione di legame al DNA di MYB ma che mancano del dominio di transattivazione sono coinvolte nello specificare aspetti del destino delle cellule epidermiche. Queste proteine interagiscono con altri TF, comprese le proteine bHLH, e a causa dell’assenza di un dominio transattivatore, si comportano come DN e trans-DN formando complessi inattivi (Ramsay e Glover, 2005).

La rimozione del dominio di legame al DNA può anche portare a DNE. Questo accade nei TF bHLH. Come notato sopra, il gene Id-1 codifica un inibitore DN naturale di questa famiglia di TF. Proteine bHLH complete (con domini di legame e dimerizzazione del DNA) possono essere espresse costitutivamente. Tuttavia, l’espressione regolata di Id-1, che contiene solo il dominio di dimerizzazione, impone la regolazione dell’attività della proteina bHLH (Sun, 1994). Un fenomeno simile è previsto anche nelle piante. Per esempio, il genoma dell’Arabidopsis codifica ∼120 proteine bHLH previste per legare il DNA e 27 proteine con una regione meno basica di quella richiesta per il legame (Toledo-Ortiz et al., 2003). Queste HLH non leganti il DNA possono funzionare come le proteine Id animali, come regolatori negativi delle proteine bHLH attraverso la formazione di eterodimeri incapaci di legare il DNA (Toledo-Ortiz et al., 2003). Effetti simili sono attesi nei TF appartenenti alla famiglia del dominio di base/leucina zipper (bZIP), che contengono un motivo di legame al DNA di base, un dominio di dimerizzazione leucina zipper e domini per la transattivazione. L’Arabidopsis codifica 67 proteine bZIP, tutte previste per funzionare come omo- e/o eterodimeri (Deppmann et al., 2004). Alcune di queste sono molto piccole e possono mancare di domini di attivazione. In un classico esempio nelle piante, Fukazawa et al. (2000) hanno chiarito la funzione del bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) nella segnalazione della gibberellina attraverso l’uso di una forma DN di RSG, che mancava di un dominio di attivazione trascrizionale e quindi agiva per reprimere la funzione della proteina wild-type quando espressa in tabacco transgenico. Inoltre, in linea con quanto detto nella sezione relativa ai DN trans mediante sovraespressione, i complessi di trascrizione DNA-proteina sono anche sensibili all’equilibrio del dosaggio genico (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Alterazioni di questo equilibrio per diminuzione o aumento dell’espressione di un TF rispetto ad altri coinvolti nello stesso complesso possono indurre fenotipi anormali.

Un semplice modello di attivazione trascrizionale può essere usato per esplorare alcune sottigliezze quantitative delle mutazioni DN in questo contesto. Studi di sistemi virali e di Drosophila hanno dimostrato che la trascrizione spesso mostra una relazione sigmoidale rispetto alla concentrazione di un TF. Nel caso di un sistema che risponde a un singolo tipo di attivatore (A), questa risposta sigmoidale può essere sezionata in due componenti principali: legame cooperativo di A al promotore (p) di un gene bersaglio e sinergia (Figura 6). La sinergia è il risultato delle interazioni concertate tra le molecole di A già legate al promotore e il macchinario trascrizionale (Carey, 1998; Veitia, 2003).

Consideriamo un promotore, p, contenente due siti di legame per A. Gli stessi siti di legame sono riconosciuti anche dalla variante a, che potrebbe agire come un inibitore competitivo. Supponiamo che ci possa essere una cooperatività durante l’interazione tra le molecole di A con il promotore. Questo potrebbe essere così anche per le interazioni tra A, a, e il promotore. Una possibile fonte di cooperatività è stata menzionata sopra (cioè, A tende a formare dimeri in soluzione, ma questo viene potenziato durante il legame al DNA). Un’altra possibilità è che i monomeri non siano in grado di interagire in soluzione e che l’interazione di un monomero con il DNA porti a un cambiamento allosterico che aumenta l’affinità di A legato per un monomero in arrivo. È anche possibile, anche se meno probabile, che non ci siano interazioni A-A e che il legame di un monomero al DNA porti a un cambiamento nel sito vicino che aumenta la sua affinità per un nuovo monomero arrivato. Qualunque sia il caso, la cooperatività significa che la reazione pA + A = pAA avviene più facilmente di p + A = pA.

A causa dell’esistenza della sinergia, la specie molecolare che contribuisce maggiormente alla trascrizione è il promotore occupato da due molecole di attivatore: pAA. Questo significa anche che se la costante di affinità per l’associazione tra il complesso pA e la polimerasi è KpolA, il K per l’associazione di pAA e la polimerasi sarà molto più alto di 2K (dell’ordine di K2polA; vedi Zlotnick, 1994). Per accomodare l’attività di transattivazione parziale in questo modello, useremo Kpola (per la reazione pa + pol) e Kpola2 (per paa + pol). Sotto questi presupposti, un’equazione per la risposta trascrizionale (TR) in funzione della concentrazione di A (e a) può essere derivata come descritto da Veitia (2003) e Veitia e Nijhout (2006) (vedi Materiali supplementari online).

Con una equazione piuttosto semplice in mano, diverse condizioni possono essere esplorate: (1) la situazione wild-type A/A, (2) quando c’è un allele mancante (A/-), e (3) quando c’è una coespressione di A e una versione troncata a priva del dominio di transattivazione. In quest’ultimo caso, possiamo distinguere due diverse situazioni: (3a) quando la mutazione di a abolisce la cooperatività o (3b) quando A e a interagiscono in modo cooperativo. Infine, possiamo anche esplorare una situazione (4) in cui la capacità di transattivazione di a è normale e la cooperatività assente, e (5) quando la cooperatività è normale ma la capacità di transattivazione è parziale.

La figura 7 mostra che un TR, relativo all’output massimo del promotore rispetto a quello esibisce una relazione sigmoidale, che varia tra 0 e 1. La saturazione riflette la risposta massima del sistema, ma ciò non implica che il promotore funzioni solo a saturazione. Secondo la figura, e in generale, i valori sulla curva per l’eterozigote A/- in qualsiasi punto sono più bassi che in A/A (per ogni valore di relativo, l’eterozigote A/- ha due volte meno in termini assoluti rispetto al tipo selvaggio). È interessante notare che a basse concentrazioni relative di A, lo spostamento tra le curve è molto pronunciato Y(A/-) è ∼25% di Y(A/A). Tuttavia, come intuitivamente previsto, per alti valori di A, la saturazione è raggiunta anche in A/-. Se questo sistema fosse normalmente funzionale a basse concentrazioni di A, un individuo A/- mostrerebbe un tipico fenotipo aploinsufficiente.

Cosa succede in A/a quando a manca il dominio di transattivazione in assenza di cooperatività? Secondo la definizione classica di DN, la curva è più bassa in qualsiasi punto di quella di A/-. Tuttavia, c’è una tendenza a raggiungere la saturazione con concentrazioni crescenti di A e a. Infatti, A tende ad occupare preferenzialmente il promotore in quanto assicura interazioni cooperative con i monomeri A in arrivo. Tuttavia, è evidente che il riconoscimento del promotore a basse concentrazioni di proteine avviene meno rapidamente in A/a che nella condizione wild-type. In pratica, un monomero troncato incapace di assicurare interazioni cooperative porterà ad una DNE debole. La situazione è completamente diversa all’altro estremo, quando la cooperatività tra A e a è completamente mantenuta. Infatti, il plateau della curva per A/a è raggiunto a TR = 0,25. Questo è atteso perché pAA, che guida la trascrizione (cioè, i contributi di pAa e paa sono trascurabili), rappresenta solo il 25% delle specie di promotori occupati alla saturazione.

Un potenziale esempio è fornito da una mutazione artificiale nella TF FOXL2. Questa TF reprime il promotore del gene regolatore dell’acuto steroidogenico umano, che contiene più siti di legame putativi. Una versione di FOXL2 che contiene il dominio di legame al DNA ma manca del dominio C-terminale è in grado di indurre una DNE che compromette la repressione trascrizionale. Tuttavia, questo effetto si ottiene solo quando la versione DN è molto più fortemente espressa (5× e 10×) rispetto alla proteina wild-type (Pisarska et al., 2004). Come sottolineato in precedenza, questo può essere dovuto all’assenza di interazioni cooperative tra le molecole FOXL2 su questo promotore.

Un esempio più eloquente è fornito nella Figura 8, che rappresenta la risposta di due diversi promotori contenenti uno o due siti di legame per la TF PTX2a e la sua versione DN, come descritto in precedenza (Saadi et al., 2003. A basse quantità di DNA di trasfezione (0.05 μg in Figura 8), la risposta del promotore con due siti è più di due volte più forte (cioè, 3×) rispetto alla risposta del promotore con un solo sito. Questa è la firma combinata di cooperatività e sinergia. Inoltre, ad alte concentrazioni di trasfettare costrutti WT + DN, il TR del promotore con due siti di legame è ∼25% della risposta del tipo selvaggio da solo. Questo è atteso perché ad alte concentrazioni di proteine i dimeri possono essere preassemblati anche prima di raggiungere il DNA bersaglio. In questo caso, solo il 25% dei dimeri sarà normale. Il calo di TR è meno drammatico per il promotore con un solo sito di legame (previsto 50%). Da un punto di vista pratico, per evitare di trascurare un potenziale DNE in esperimenti in vitro, basse quantità dei costrutti WT+DN dovrebbero essere trasfettate con un eccesso di promotore reporter per evitare la sua saturazione da parte della forma wild-type. Più in generale, le curve di risposta per diverse concentrazioni di TF dovrebbero essere fornite per tali esperimenti di trasfezione.

Come previsto intuitivamente, quando la capacità di transattivazione di a è normale e la cooperatività assente, appare una DNE molto lieve che porta a un comportamento vicino a un allele nullo in stato eterozigote. L’isolamento di questo tipo di mutante è possibile utilizzando un elegante schermo genetico su lievito descritto da Burz e Hanes (2001). Una mutazione può influenzare i livelli di cooperatività in modo meno drammatico. Un caso interessante si verifica quando la cooperatività scende a circa un decimo del livello normale (secondo i parametri alla base dei risultati presentati nella Figura 7) e la capacità di transattivazione è normale. In queste condizioni, la variante a si comporta come un allele ipomorfo nell’omozigote a/a e come un allele nullo in A/a (cioè, A/a = A/-; dati non mostrati). Questo evidenzia ancora una volta la mancanza di confini distinti tra alleli ipomorfi, DN e nulli.

Quando c’è transattivazione residua (cioè, 1<Kpola<KpolA) e la cooperatività è normale, il plateau in A/a non è raggiunto a TR = 1 ma ad un livello inferiore. Gli alleli con capacità di attivazione parziale possono essere facilmente prodotti in alcuni casi. Il paradigma è fornito il lievito TF Gal4, che contiene due regioni attivanti (ARI e ARII) coinvolte nel reclutamento del macchinario trascrizionale. Le delezioni nella regione acida ARII portano ad una diminuzione della capacità di transattivazione (Ptashne e Gann, 2002; Ptashne, 2007). Una combinazione di un tale allele con il wild-type Gal4 dovrebbe comportarsi come descritto. Come mostrato nella Figura 7, la curva per A/a incrocia quella di A/-. Così, lo stesso allele può essere ipomorfo se il sistema funziona a bassi livelli di saturazione (prima che le curve si intersechino) e può essere DN in termini molecolari a concentrazioni di proteine più elevate. Una spiegazione intuitiva può essere fornita. Consideriamo, per esempio, una proteina a che interagisce con la polimerasi con, diciamo, il 90% della forza wild-type. Per una gamma di concentrazioni l’eterozigote A/a tenderà a comportarsi come A/A. Tuttavia, a saturazione solo il 25% della specie del promotore sarà pAA, che interagisce con la polimerasi con la massima forza. Al contrario, in un eterozigote A/-, a basse concentrazioni di proteine è più difficile occupare il promotore, mentre a saturazione il 100% delle specie del promotore sarà pAA. Quindi, le curve per A/a e A/- devono intersecarsi a un certo punto.

Tutti i promotori target all’interno di una cellula non sono ugualmente sensibili a un DN TF. Quando c’è una forte cooperatività e sinergia, la sensibilità di un promotore a una proteina DN dovrebbe dipendere dal numero di siti di legame sul DNA. Il caso più semplice da visualizzare è quando a manca un dominio di transattivazione ma interagisce in modo cooperativo con A. Se la specie di promotore che guida la trascrizione è quella completamente caricata con la proteina wild-type, come assunto sopra, il TR massimo può essere calcolato utilizzando la formula (delle probabilità binomiali) data nei Materiali supplementari online. Per un promotore con due siti di legame identici, TR massimo sarà del 25% rispetto all’uscita della condizione wild-type: per tre siti di legame, 12.5%, e per quattro siti di legame, 6.25% (quando A e a sono espressi a concentrazioni equimolari). Per situazioni più complesse, la risposta non è intuitiva e richiede l’analisi di modelli non trattati in questa sede.