Metabolismo aerobico e anaerobico nei pesci di strato minimo di ossigeno: il ruolo dell’alcol deidrogenasi | Journal of Experimental Biology

DISCUSSIONE

Le specie di pesce lanterna del Mare Arabico e i loro confamiliari della Corrente della California, del Golfo del Messico e dell’Antartico sono forti migratori verticali, che si spostano dalle medie profondità (200-1000 m), dove trascorrono le ore diurne, alle acque vicine alla superficie durante la notte dove si nutrono, più spesso di zooplankton (Pearcy et al., 1977; Gjøsaeter, 1984; Torres e Somero, 1988a; Lancraft et al., 1989; Hopkins e Gartner, 1992; Luo et al., 2000). La migrazione verticale è una strategia di foraggiamento utilizzata dai pesci lanterna in tutto il mondo (Robinson et al., 2010), rendendo le quattro regioni del presente studio sistemi sperimentali naturali che differivano notevolmente nei loro profili di ossigeno disciolto e temperatura, ma molto poco nelle abitudini quotidiane delle loro specie comuni. Così, i soggetti sperimentali per tutte e quattro le regioni erano analoghi ecologici. Le risposte fisiologiche a due importanti variabili fisiche, ossigeno e temperatura, erano in gioco.

Nel Mare Arabico e nel Golfo del Messico, l’ossigeno era chiaramente la variabile fisica con maggiore influenza. I profili di temperatura nei due sistemi erano praticamente identici (Fig. 1) ma i profili di ossigeno differivano radicalmente. Nel sistema del Mare Arabico, l’ossigeno scompariva ad una profondità di 200 m e rimaneva a zero fino ad una profondità di 1000 m, mentre nel Golfo del Messico, l’ossigeno scendeva a circa la metà dei valori di superficie (saturazione dell’aria) nello stesso intervallo (Fig. 1). In entrambi i sistemi, i pesci risiedevano nel minimo di ossigeno durante le ore diurne. Tuttavia, nel Mare Arabico i mictofidi sarebbero stati costretti all’anaerobiosi, ma nel Golfo del Messico le concentrazioni di ossigeno erano ben all’interno dell’intervallo normossico dei mictofidi (Donnelly e Torres, 1988). Le strategie biochimiche delle specie per affrontare i loro rispettivi profili di ossigeno si riflettono nelle loro attività enzimatiche. LDH, l’enzima terminale nel percorso glicolitico durante l’anaerobiosi, è circa tre volte più alto nei pesci del Mare Arabico che in quelli del Golfo del Messico, suggerendo una forte capacità anaerobica (Fig. 2). Al contrario, l’attività molto più alta di CS nei pesci del Golfo del Messico indica una strategia altamente aerobica, resa possibile dal lieve minimo di ossigeno trovato nel Golfo del Messico. L’attività ADH nei pesci del Mare Arabico era anche circa tre volte quella osservata nei pesci del Golfo del Messico, dando ai pesci il macchinario biochimico per convertire il lattato, che non può essere escreto alle branchie, in etanolo, che può (Shoubridge e Hochachka, 1980; Vornanen et al., 2009).

Il modello attuale per la conversione del lattato in etanolo nel pesce rosso e nella carpa (ad esempio Shoubridge e Hochachka, 1980; Vornanen et al., 2009) richiede prima che il lattato sia ossidato a piruvato in presenza di NADH, un passo termodinamicamente in salita (ΔG′°=+25,1 kJ mol-1) (Lehninger, 1970). Il piruvato è successivamente convertito in acetaldeide all’interno del mitocondrio dal complesso piruvato deidrogenasi, con il rilascio di CO2. L’acetaldeide viene poi ridotta a etanolo da ADH in presenza di NADH (Fig. 4). Il macchinario biochimico per la formazione di etanolo si trova esclusivamente nel muscolo nuotatore, che elabora non solo il lattato generato all’interno del muscolo ma anche quello prodotto da altri tessuti come il cervello, il fegato e il cuore e consegnato al muscolo attraverso il flusso sanguigno (Shoubridge e Hochachka, 1980; Vornanen et al., 2009) (Fig. 4). L’attività dell’ADH riscontrata nel muscolo dei pesci del Mar Arabico suggerisce una strategia simile.

Il muscolo scheletrico dei pesci svolge un ruolo importante nell’elaborazione post-esercizio del lattato attraverso le vie gluconeogeniche e glicogeniche, una situazione molto diversa da quella dei mammiferi, dove il meccanismo enzimatico per rigenerare il glucosio si trova principalmente nel fegato (Suarez et al., 1986; Moon, 1988; Gleeson, 1996). Il muscolo dei pesci è quindi più multifunzionale di quello dei mammiferi, possedendo una più ampia gamma di enzimi e una maggiore flessibilità metabolica intrinseca rispetto al muscolo dei mammiferi, compreso un maggiore potenziale di biosintesi (Gleeson, 1996). Infatti, è stato dimostrato che il muscolo scheletrico dei pesci sequestra il lattato dopo l’esercizio (Gleeson, 1996), facilitando la rigenerazione del glucosio all’interno del muscolo e migliorando il recupero post-esercizio. Nel caso del pesce rosso, della carpa crucian e ora dei pesci lanterna, la flessibilità metabolica della serie di enzimi muscolari permette nuove soluzioni biochimiche al problema dell’anaerobiosi.

L’attività MDH era anche significativamente più alta nei pesci del Mare Arabico che in quelli del Golfo del Messico, ma i molteplici ruoli di MDH nella cella rendono la spiegazione di questo notevolmente meno semplice. Il tessuto muscolare è stato omogeneizzato con omogeneizzatori di vetro smerigliato, il che permetterebbe sia al MDH citosolico che a quello mitocondriale di essere attivo nel cocktail del test. Le attività riportate nella tabella 1 erano quindi una combinazione di attività MDH dai due compartimenti cellulari. Nel metabolismo aerobico, MDH è chiaramente importante come enzima che catalizza la formazione di ossalacetato nel ciclo di Krebs. Inoltre, durante le condizioni aerobiche, il MDH citosolico e mitocondriale lavorano in tandem per trasportare gli equivalenti riducenti prodotti dalla glicolisi nel mitocondrio per l’elaborazione nel sistema di trasporto degli elettroni, una necessità dovuta all’impermeabilità della membrana mitocondriale al NADH citosolico. Un terzo ruolo del MDH è quello di catalizzare un passo importante nella via gluconeogenica convenzionale. Come accade, nel muscolo del pesce, si ritiene che la gluconeogenesi proceda da un’inversione quasi diretta della glicolisi (Suarez et al., 1986; Moon, 1988; Gleeson, 1996) e il MDH non è un partecipante importante.

Quello che è più probabile è che il MDH aiuti a mantenere l’equilibrio redox all’interno della cellula durante i periodi di transizione da condizioni normossiche ad anossiche quando i pesci migrano verso il basso nel minimo di ossigeno durante le ore diurne e di nuovo quando i pesci migrano verso l’alto verso il maggiore ossigeno delle acque superficiali di notte. La navetta del malato può spostare il NADH dentro o fuori il mitocondrio a seconda delle necessità cellulari di potere riducente.

Le specie di pesce lanterna della California Borderland e dell’Antartico hanno mostrato tendenze simili ai loro confamiliali del Mare Arabico e del Golfo del Messico, con l’avvertenza che la temperatura così come l’ossigeno hanno influenzato i risultati. Electrona antarctica, il migratore verticale più forte e attivo tra le specie antartiche ha anche mostrato la più alta attività LDH, dando alle specie antartiche nel loro insieme un valore significativamente più alto di quelle della California alla stessa temperatura di analisi. L’influenza dell’adattamento alla temperatura in un pesce robusto e attivo (Torres e Somero, 1988b; Yang e Somero, 1993; Vetter e Lynn, 1997) è la spiegazione più probabile per questo valore elevato. Se l’attività LDH di Electrona è considerata alla sua temperatura ambientale di 0°C, o la metà del valore della tabella 1 (54 U g-1 di massa umida), è esattamente nella media dei valori per le specie della California a 10°C, sottolineando l’influenza verso l’alto dell’adattamento alla temperatura sull’attività LDH di Electrona. Né il CS né l’attività MDH hanno mostrato differenze significative tra le specie californiane e antartiche alla temperatura di analisi di 10°C, anche se i valori medi per le specie californiane erano più alti in entrambi i casi.

L’attività ADH era significativamente più alta nelle specie californiane nonostante l’influenza della temperatura di analisi, che, come per la LDH, avrebbe avuto la tendenza a spostare verso l’alto i valori antartici. Con ADH, l’influenza più probabile sulle attività enzimatiche complessive era il minimo di ossigeno della California, che al suo centro (700 m; Fig. 1) mostra un valore di 0,2 ml l-1. Le migrazioni verticali dei pesci lanterna della California li porterebbero a valori di ossigeno diurni compresi tra 0,5 e 1,0 ml l-1 (16-32 Torr, ∼2,1-4,2 kPa), ben al di sotto delle loro capacità di estrarre efficientemente l’ossigeno (cfr. Torres et al, 1979; Donnelly e Torres, 1988).

I pesci lanterna del Mare Arabico e della California Borderland incontrano concentrazioni di ossigeno da zero a quasi zero alle loro profondità diurne, dopo una nuotata di almeno 5000 lunghezze corporee durante la loro escursione verso il basso (assumendo una nuotata minima di 300 m e una lunghezza del corpo di circa 5 cm; Tabella 1). Il loro ricorso più energeticamente efficiente sarebbe quello di mantenere l’attività di nuoto all’interno del minimo di ossigeno al livello più basso possibile in modo da minimizzare la necessità di anaerobiosi. La maggior parte degli anaerobi facoltativi (per esempio i bivalvi) (Hochachka, 1980; Hochachka e Somero, 2002) mostrano una marcata diminuzione dell’attività durante l’anaerobiosi come risultato dell’alto costo energetico anche delle vie anaerobiche più efficienti. Un’attività minima minimizza l’uso dell’energia immagazzinata. Quando accoppiato con l’uso della via ADH, l’accumulo di prodotti finali sarebbe anche minimizzato dall’escrezione di etanolo alle branchie, il tutto mantenendo l’equilibrio redox all’interno delle cellule muscolari. L’escursione verso l’alto al crepuscolo in acque normossiche può quindi essere iniziata con una ‘lavagna metabolica’ relativamente pulita con la navetta del malato che aiuta nella transizione come descritto sopra.

La migrazione verticale è un adattamento mostrato da molte specie di zooplancton e micronekton oltre ai pesci lanterna (Hopkins et al., 1994; Hopkins et al., 1996; Robinson et al., 2010), presumibilmente per ridurre la predazione visiva. Poiché l’acuità visiva e il rischio di attacco da parte dei predatori visivi sono notevolmente aumentati durante le ore di luce, molti animali entrano nelle acque superficiali ricche di cibo solo di notte, migrando verso le profondità più scure all’alba. Le specie che risiedono all’interno dei minimi di ossigeno, o che vi migrano, stanno affrontando una caratteristica fisica stabile (Stramma et al., 2008) che può essere affrontata attraverso un adattamento fisiologico e biochimico. Nel caso dei pesci lanterna studiati nel presente lavoro, il minimo di ossigeno fornisce un rifugio dai predatori pelagici che avrebbero la stessa difficoltà a cacciare nei minimi di ossigeno del Mare Arabico o della California Borderland come nelle zone morte dell’oceano costiero.

I pesci d’acqua media dell’oceano aperto differiscono notevolmente dai pesci costieri e d’acqua dolce per i tempi e il carattere della loro esposizione a ossigeno basso o nullo. L’anaerobo più compiuto della piscina (e meglio studiato), la carpa crucian, subisce un prevedibile soggiorno a zero ossigeno durante i mesi invernali nel suo habitat nativo dell’Asia centrale e dell’Europa (Vornanen e Paajanen, 2004). Gli individui che abitano piccoli stagni eutrofici svernano sotto una copertura di ghiaccio e neve che preclude lo scambio atmosferico, dando luogo a periodi di anossia che possono durare 90 giorni o più (Piironen e Holopainen, 1986). Il fatto che l’esposizione all’anossia sia un evento stagionale permette che l’adattamento metabolico e morfologico avvenga prima della caduta dell’ossigeno ambientale. L’adattamento metabolico include l’accumulo di glicogeno nel fegato, nei muscoli, nel cervello e nel cuore per alimentare la necessità di attività anaerobica. Gli aggiustamenti morfologici includono un aumento del numero di lamelle branchiali, con un conseguente aumento di 7 volte della superficie branchiale (Vornanen et al., 2009) per facilitare lo scambio di ossigeno. Forse la cosa più sorprendente è il fatto che il cuore e il cervello della carpa crucian rimangono pienamente funzionali durante l’anossia, una strategia unica tra i vertebrati, permettendo che l’etanolo sciacquato dai tessuti muscolari sia consegnato per l’escrezione alle branchie, e la distribuzione del glucosio dalle riserve del fegato ai siti che ne hanno bisogno (Vornanen et al., 2009).

I pesci marini costieri incontrano l’ipossia in una varietà di situazioni naturali e antropogeniche. Piscine di marea o canali in aree che hanno vegetazione in decomposizione, come nelle mangrovie, o in aree intertidali con fango ricco di organi, possono diventare anossici con la bassa marea, esponendo a volte le specie native al solfuro (Bagarinao e Vetter, 1989; Graham, 1997; Geiger et al., 2000). In quei pesci che sono attrezzati per farlo, la respirazione aerea è un’opzione valida per minimizzare gli effetti dell’anossia e dell’esposizione al solfuro (Graham, 1997; Geiger et al., 2000). Altri sfruttano l’opzione biochimica dell’ossidazione mitocondriale del solfuro per minimizzare i suoi effetti tossici, in modo simile alle specie nelle bocche idrotermali (Bagarinao e Vetter, 1989). Nella maggior parte dei sistemi ipossici naturali, le escursioni a zero ossigeno sono episodiche, come nelle piscine di marea delle mangrovie, o si verificano regolarmente con la bassa marea durante i mesi più caldi dell’anno. Queste situazioni sono prevedibili e abbastanza spesso da essere adattate dall’adattamento fisiologico. Le specie che vivono in ambienti soggetti a ipossia naturale sono fisiologicamente pronte ad affrontarla.

Eventi ipossici indotti o potenziati da fattori antropogenici, o zone morte, si verificano con maggiore regolarità negli oceani costieri e nelle baie del Nord America, Europa e Asia (Diaz e Rosenberg, 2008). Le zone morte sono solitamente associate al deflusso dei nutrienti e alla stratificazione estiva nei sistemi marini poco profondi (Diaz e Breitburg, 2009; Rabalais et al., 2002). Il carico di nutrienti accelera la produzione e la miscelazione dell’ossigeno atmosferico è inibita dalla stratificazione della colonna d’acqua. Al di sotto dello strato misto, la degradazione microbica della materia organica che affonda impoverisce gravemente l’ossigeno, in alcuni casi rimuovendo tutto il valore dal fondo e dall’habitat vicino al fondo (Diaz e Breitburg, 2009). La sopravvivenza dei pesci nelle zone ipossiche è determinata dall’efficacia delle specie nel rimuovere l’ossigeno a PO2 ridotta (Chapman e McKenzie, 2009; Perry et al., 2009; Richards, 2009), che varia notevolmente tra i vari taxa (Richards, 2009). In nessun caso l’anaerobiosi prolungata è usata dai pesci come strategia per far fronte alle zone morte.

Se ci sono piccole ma consistenti quantità di ossigeno nell’acqua, come in una zona di minimo ossigeno, gli animali hanno sviluppato meccanismi per estrarlo e usarlo. Tre meccanismi sono una maggiore superficie branchiale, un sistema circolatorio efficiente e un pigmento ematico ad alta affinità. Grandi superfici branchiali sono state misurate in pesci che abitano lo strato minimo di ossigeno della corrente della California (Ebeling e Weed, 1963; Gibbs e Hurwitz, 1967). Gnathophausia ingens, un crostaceo lophogastrid residente in questa zona, oltre ad avere branchie altamente sviluppate e un sistema circolatorio efficiente (Childress, 1971; Belman e Childress, 1976), ha un’emocianina ad alta affinità con un grande effetto Bohr positivo e un’alta cooperatività. È in grado di caricare l’ossigeno ad una pressione parziale di 6 Torr (∼0.8 kPa); la sua alta cooperatività permette al pigmento di scaricare l’ossigeno ai tessuti attraverso un gradiente di diffusione molto piccolo (Sanders e Childress, 1990).

I pesci lanterna comprendono una speciosa famiglia di pesci pelagici pan-globali, la grande maggioranza dei quali sono migranti verticali (Nelson, 2006; Smith e Heemstra, 1991). Le loro distribuzioni geografiche includono tutti i gravi minimi di ossigeno oceanici, due dei quali sono stati trattati nel presente studio. Proponiamo che, piuttosto che utilizzare la strategia di quelle specie che rimangono permanentemente all’interno delle porzioni più severe dello strato minimo di ossigeno, che richiede un notevole investimento fisiologico e morfologico (Childress e Seibel, 1998), sono in grado di utilizzare il percorso ADH per minimizzare l’accumulo di prodotti finali mentre utilizzano l’anaerobiosi per una parte del giorno per far fronte alle richieste del minimo di ossigeno. La strategia anaerobica ricorda quella utilizzata dalle specie intertidali durante le basse maree (cfr. Hochachka, 1980; Torres et al., 1977), ma con il vantaggio di un ingresso più prevedibile e controllabile in condizioni di basso ossigeno. Questo è il primo rapporto di attività ADH nel muscolo di pesci diversi dal pesce rosso e carpa, una strategia anaerobica in gran parte non prevista che può essere più diffusa.