Enteropatogeni associati alla malattia diarroica nei neonati delle aree urbane povere di Porto Velho, Rondônia: uno studio preliminare

Enteropatogeni associati alla malattia diarroica nei neonati delle aree urbane povere di Porto Velho, Rondônia: uno studio preliminare

Vol. 96(5): 621-625, Jul 2001

Patrícia Puccinelli Orlandi+, Tatiane Silva, Gleiciene Felix Magalhães, Fabiana Alves, Roberto Penna de Almeida Cunha, Rui Durlacher, Luiz Hildebrando Pereira da Silva

Centro de Pesquisa em Medicina Tropical, Rodovia BR 364, km 4.5, 78970-900 Porto Velho, RO, Brasil

Centotrenta casi di diarrea e 43 controlli di pari età, da 0 a 5 anni, sono stati studiati in un ambulatorio pediatrico di una povera area periurbana di Porto Velho, Rondônia. L’80% dei casi di diarrea sono stati osservati nei gruppi sotto i 2 anni di età. Il Rotavirus (19,2%) era l’enteropatogeno più frequente associato alla diarrea, seguito da Shigella flexneri (6,15%) e S. sonnei (1,5%) e Salmonella sp. (6,9%). Sono stati identificati anche quattro casi di infezioni da E. coli enterotossigenico (3,1%), E. coli enteropatogeno (EPEC) (2,3%) un caso di infezione enteroinvasiva da E. coli (0,8%) e un caso di Yersinia enterocolitica (0,8%). Le infezioni miste erano frequenti, associando rotavirus, EPEC e Salmonella sp. con Entamoeba histolytica e Giardia lamblia.

Parole chiave: malattia diarroica – enteropatogeni – infezioni da rotavirus – epidemiologia – Rondônia – Brasile

La malattia diarroica rappresenta una stima di cinque milioni di morti all’anno tra i bambini sotto i 5 anni in tutto il mondo (Georges et al. 1984). I principali fattori di rischio per la morbi-mortalità della diarrea sono ben noti e riguardano la cattiva qualità della vita, la mancanza di servizi igienici e di acqua pulita per la maggior parte della popolazione che vive nelle aree povere dei paesi in via di sviluppo.

Le relazioni mostrano che la diarrea è presente come un’importante malattia infantile in molte aree dei paesi dell’America Latina e rappresenta più del 20% della mortalità infantile (Bern et al. 1992). In Brasile, la malattia diarroica è presente in tutto il paese e rappresenta ancora una delle principali cause di mortalità infantile nelle aree periurbane e rurali più povere, sia nel nord-est che nel nord (Guerrant & Kirchhoff 1983).

Uno studio longitudinale condotto dal 1990 al 1992 nella città di Belém, nella regione amazzonica orientale, ha prodotto tassi di 5,9 episodi di diarrea per bambino/anno (Linhares 1997).

Dati meno recenti da Fortaleza, nella regione nordorientale del paese, hanno mostrato che il numero di episodi di diarrea nella fascia di età tra i 6 e i 12 mesi supera i 7 e i 9 all’anno per persona tra le famiglie delle aree urbane e rurali povere, rispettivamente, diminuendo progressivamente a due episodi all’anno per persona tra gli adulti (Guerrant & Kirchhoff 1983). Fino ad oggi, nessuna indagine è stata effettuata in Rondônia così come nella regione amazzonica occidentale allo scopo di stabilire l’incidenza delle malattie diarroiche, tuttavia, le registrazioni dei servizi sanitari ufficiali indicano che la diarrea è la principale causa di mortalità tra i bambini da 0 a 5 anni (Plano Plurianual de Saúde de Rondônia 1996).

Diversi studi sono stati sviluppati nelle regioni del Sud e del Sud-Est del Brasile per identificare gli agenti eziologici associati alla diarrea, così come per valutare sia le caratteristiche epidemiologiche che cliniche della malattia (Riley et al. 1984, Trabulsi et al. 1985a, Gomes et al. 1991). Alcuni studi sono stati condotti nella regione nordorientale, in particolare a Fortaleza (Guerrant & Kirchhoff 1983) e Recife (Leal et al. 1988). Nessuno studio è stato eseguito nella regione amazzonica settentrionale del Brasile, ad eccezione di studi specifici sul rotavirus a Belém.

Presentiamo qui dati preliminari sull’eziologia e le caratteristiche cliniche della diarrea tra i bambini da 0 a 5 anni, che vivono in un’area urbana povera, e che sono stati inviati a un’unità pediatrica ambulatoriale a Porto Velho, Rondônia (regione amazzonica occidentale). Le frequenze relative degli enteropatogeni sono simili a quelle descritte nella regione nordorientale del Brasile.

MATERIALI E METODI

RISULTATI

DISCUSSIONE

RICONOSCIMENTI

MATERIALI E METODI

Area di studio – Lo studio è stato condotto tra luglio 1998 e marzo 1999 dal personale del “Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEPEM)”, Porto Velho, nell’unità sanitaria ambulatoriale “Policlínica Hamilton Gondin”. A Porto Velho, capitale, c’è stato un aumento significativo della popolazione durante gli ultimi tre decenni, con conseguente migrazione da diverse aree del Brasile in seguito alla costruzione della strada “BR364” che collega la città alle regioni centrali e meridionali del paese. La popolazione attuale della città è di circa 200.000 abitanti. La città ha un disegno geometrico moderno ma manca di un adeguato sistema sanitario. La “Policlínica” si trova nella povera periferia nord della città. La fornitura di acqua potabile è limitata a una bassa percentuale di residenze di età e la rete fognaria è assente, ogni casa ha servizi igienici di fossa.

Sintesi dello studio – Centotrenta bambini di età compresa tra 0 e 5 anni sono stati portati dalle madri alla “Policlínica” a causa della malattia diarroica; inoltre, 43 bambini di controllo non diarroici di pari età della “Policlínica” sono stati selezionati per lo studio. I pediatri del personale del CEPEM hanno intervistato gli adulti accompagnatori, ottenuto il consenso informato scritto, completato un questionario ed eseguito un esame fisico. Particolare attenzione è stata data alla storia passata dei sintomi, numero di episodi di diarrea, febbre (temperatura ascellare > 37o.8), vomito, disidratazione e presenza di muco e sangue nelle feci.

Metodi di laboratorio – I campioni fecali sono stati raccolti dopo un’evacuazione naturale o attraverso la stimolazione con una supposta di glicerina. I campioni sono stati divisi in due frazioni: una frazione è stata utilizzata per l’esame parassitologico e il test per il rotavirus utilizzando il kit Slidex (Biomerieux). La seconda aliquota è stata coltivata secondo le procedure batteriologiche standard. In breve, circa 3 g di feci sono stati sospesi in 3 ml di PBS e posti sui seguenti terreni selettivi: MacConkey, SS e agar verde brillante (dopo arricchimento in brodo di tetrathionate contenente 40 µg/ml di novobiocina) per l’isolamento e l’identificazione dei seguenti batteri enteropatogeni: Escherichia coli enteropatogeno (EPEC), E. coli enteroemorragico (produttore di tossina Shiga-like) (EHEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC), Shigella, Salmonella sp, Yersinia species, Campylobacter jejuni e C. coli. Le piastre sono state incubate a 37oC per 24-48 h, tranne quelle utilizzate per identificare le specie di Campylobacter; queste sono state rilevate utilizzando piastre con Skirrow modificato, seguite da incubazione a 42oC per 48 h in vaso Gaspak.

Cinque colonie positive tipiche di E. coli e una colonia lattosio-negativa di diversi tipi morfologici sono state coltivate su piastre di agar MacConkey e le colonie lattosio positive e negative isolate su piastre di agar SS e verde brillante sono state identificate con test biochimici utilizzando un kit EPM millicitrato (ProBac, Brasil). Le colonie che assomigliano alle specie di Campylobacter, che crescono su piastre modificate Skirrow, sono state sottoposte alla colorazione di Gram e ai test di catalasi e ossidasi per la conferma del genere. I ceppi di E. coli isolati su agar MacConkey sono stati sottoposti a test di agglutinazione su vetrino utilizzando sieri polivalenti contro i sierogruppi EPEC A, B e C. Gli isolati non agglutinanti sono stati testati con antisiero contro il sierogruppo EHEC O157 e con antisieri polivalenti contro i sierogruppi EIEC A e B. Gli isolati identificati da test biochimici come specie Shigella e Yersinia sono stati sierotipizzati mediante tecniche standard. Gli antisieri disponibili in commercio di ProBac e Promicro (San Paolo) sono stati utilizzati per la determinazione dei sierotipi.

Gli isolati di E. coli non appartenenti ai sierotipi EPEC, EHEC o EIEC sono stati testati per la produzione di enterotossina termolabile (LT) e di enterotossina stabile (ST) mediante PCR. I primer utilizzati (Tornieporth et al. 1995) sono complementari alle seguenti posizioni:

59 a 76 (ET-LT1,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)

765 a 746 (ET-LT2,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)

79 a 98 (ET-ST1, 5’CTGTATTGTCTTTTTCACCT3′) e

260 a 241 (ET-ST2, 5’GCACCCGGTACAAGCAGGAT3′).

L’amplificazione è stata eseguita con 30 cicli in un termociclatore Perkin-Elmer, come segue: denaturazione per 2 minuti a 92ºC, annealing per 1 minuto a 50oC, ed estensione per 2 minuti a 72ºC. Il processo di amplificazione è stato terminato con un’estensione di 5 minuti a 72ºC e le provette sono state rapidamente raffreddate a 4ºC. Quindici µl di ogni campione sono stati sottoposti a elettroforesi su un gel di agarosio al 2%, colorato con bromuro di etidio a 100V per 2 ore per visualizzare il prodotto della PCR.

RISULTATI

Distribuzione per gruppi di età della malattia diarroica – Una chiara maggiore incidenza nei gruppi di età da 0 a 2 anni nella “Policlínica” è stata osservata tra i 130 casi di diarrea. I bambini sotto 1 anno di età sono stati particolarmente colpiti, rappresentando 62 casi (47.7%), di cui 28 (21.4%) erano meno di 6 mesi (Tabella I).

Prevalenza degli enteropatogeni – Tra i 130 casi di malattia diarroica, gli esami di laboratorio erano negativi per batteri enteropatogeni e rotavirus in 16 bambini. La tabella II mostra la distribuzione degli agenti patogeni trovati nelle feci di 53 neonati con diarrea (40,7%) e in 2 controlli (4,6%). Il rotavirus è stato il patogeno più frequente trovato (19,2% dei casi di diarrea e 2,4% dei controlli). Le specie di Shigella sono state trovate in 10 casi (7,7%) e non tra i controlli, con alta frequenza di S. flexneri (8/10) rispetto a S. sonnei (2/10). Salmonella sp. è stata trovata in 9 casi (6,9% dei casi diarroici e 1 controllo – 2,4%). ETEC è stato trovato in 4 casi diarroici, tutti con enterotossine sia LT che ST. EPEC è stato trovato in 3 casi diarroici (2 E. coli O111 e 1 E. coli O125). Un caso con EIEC e uno con Y. enterocolitica sono stati identificati tra i bambini diarroici. Campylobacter è stato trovato sia nei casi di diarrea che nei controlli. Gli esami parassitologici hanno mostrato 8 casi di diarrea cisti di E. histolytica. Cisti di G. lamblia sono state trovate in 19 casi di diarrea e in 4 controlli. Le infezioni miste erano relativamente frequenti con la seguente distribuzione: 2 casi di infezioni da S. flexneri e rotavirus; 3 casi di infezioni da Salmonella sp. e G. lamblia, e 2 casi di infezione concomitante da EPEC ed E. histolytica.

Distribuzioni per età – La distribuzione per fasce di età dei diversi enteropatogeni trovati in associazione ai 114 casi di malattia diarroica è mostrata nella figura. Come già mostrato nella tabella I, l’80,5% degli episodi diarroici si è verificato in gruppi di età inferiore ai 2 anni. I tassi di positività al Rotavirus sono ugualmente elevati nei neonati di età inferiore a 1 anno, così come nel gruppo di età 1-2 anni. Altri patogeni sono distribuiti da tutti i gruppi di età, ma le loro frequenze relative non possono essere definite in considerazione del basso numero di casi di diarrea osservati nei bambini di età superiore a 2 anni.

Caratteristiche epidemiologiche e cliniche – Mentre tutti i patogeni batterici sono stati ugualmente riscontrati nei casi di diarrea durante tutto il periodo di studio, il numero di casi positivi al rotavirus, il 70%, era più alto nel periodo ottobre-febbraio (stagione delle piogge) rispetto a quello tra maggio e settembre (stagione secca). I segni clinici e i sintomi registrati dai pediatri al momento dell’ammissione sono riassunti nella tabella III; sono incluse anche le informazioni degli adulti accompagnatori sul vomito. La febbre è stata trovata per verificarsi più frequentemente nelle infezioni da rotavirus (60% c2 14.85, P= 0.011, 5df) che la presenza di sangue nelle feci era un reperto comune nei casi di infezioni da S. sonnei (80% c2 36.45, P= 0.00001 5df) così come la presenza di vomito (c2 18.84, P=0.002). La presenza di muco nelle feci è stata osservata in tutti i casi di diarrea indipendentemente dall’eziologia.

DISCUSSIONE

Nel presente studio, 130 casi di diarrea e 43 controlli di pari età nel gruppo di età da 0 a 5 anni sono stati studiati in un ambulatorio pediatrico nell’area periurbana di Porto Velho. I casi di diarrea erano concentrati nei gruppi di età inferiore ai 2 anni (80%), suggerendo il progressivo sviluppo dell’immunità contro gli enteropatogeni. Tuttavia, poiché i casi di diarrea sono stati rilevati passivamente, l’abitudine genitoriale e sociale di prestare maggiore attenzione ai bambini più piccoli può spiegare in parte la distorsione osservata nella distribuzione per età dei casi. In un’indagine longitudinale effettuata a Fortaleza, in cui è stata effettuata una ricerca attiva dei casi di diarrea, è stata osservata una distribuzione per età simile (Guerrant & Kirchhoff 1983) che conferma un ruolo importante dell’immunità per spiegare il profilo della distribuzione per età.

Per quanto riguarda gli enteropatogeni associati agli episodi di diarrea, è stata trovata nel campione di Porto Velho un’alta prevalenza di rotavirus (19,2% dei casi di diarrea e 2,4% dei controlli).

Il rotavirus è l’enteropatogeno più frequente trovato nelle tre regioni studiate (circa il 20%). A Porto Velho, come già osservato a San Paolo (Trabulsi et al. 1985) e Belém (Linhares 1997), il rotavirus è più frequentemente associato alla febbre (60% dei casi a Porto Velho).

ETEC era il sottogruppo più frequente di E. coli associato alla diarrea nell’indagine di Guerrants a Fortaleza, mentre era responsabile di una percentuale inferiore di pazienti nell’indagine di Trabulsi a San Paolo (Trabulsi et al. 1985b) e nella presente indagine a Porto Velho. Mentre i ceppi di E. coli positivi alla tossina LT sono stati sempre trovati nei campioni di San Paolo e Fortaleza, entrambe le tossine LT e ST sono state trovate nei quattro isolati ETEC di Porto Velho.

Le infezioni da Salmonella e Shigella, rare nelle indagini di San Paolo (Gomes et al. 1991), sono più frequenti nel Nordest (Guerrant & Kirchhoff 1983) e a Porto Velho, dove erano associate rispettivamente al 6,9% e al 7,7% degli episodi di malattia diarroica. Le infezioni da Shigella, altrettanto frequenti in altri paesi in via di sviluppo come il Sudafrica (Scragg et al. 1978), il Messico (Munhoz et al. 1979) e il Bangladesh (Stool et al. 1982) sono responsabili delle forme più gravi di diarrea e, nel campione di Porto Velho, erano frequentemente associate a vomito (90%) e presenza di sangue nelle feci (80%), indicando un grave danno della mucosa intestinale.

Nessun caso di infezione da Campylobacter species è stato rilevato nei casi di diarrea a Porto Velho, mentre questo enteropatogeno è frequentemente osservato a San Paolo (Gomes et al. 1991). Un caso di diarrea associato a Y. enterocolitica è stato osservato nel campione di Porto Velho. Mentre già descritto in casi di diarrea a Rio de Janeiro, Y. enterocolytica, è stato trovato raramente in altre aree. È degno di nota che è frequentemente associato a diarrea in Canada, suggerendo un migliore adattamento di questa specie all’ambiente freddo.

In conclusione, la presente indagine ha dimostrato che la distribuzione degli enteropatogeni associati alla diarrea a Porto Velho è simile a quella osservata nelle aree amazzoniche nordorientali e orientali dello Stato del Parà. Inoltre, alcune particolarità osservate in questo studio, sollevano l’interesse per ulteriori ricerche sugli enteropatogeni nell’Amazzonia occidentale con l’obiettivo di identificare meglio gruppi, sottogruppi e varianti di patogeni virali e batterici presenti nella regione e informazioni sulla resistenza agli antibiotici.

RICONOSCIMENTI

Al Dr Luiz Rachid Trabulsi, Instituto Butantã, per i suoi preziosi commenti e per aver letto il manoscritto originale.

• Bern C, Martines J, Zousa I, Glass RI 1992. La grandezza del problema globale della malattia diarroica: un aggiornamento di dieci anni. Bull WHO 70: 705-714.

• Georges MC, Wachsmuth IK, Meunier DMV, Nebout N, Didier F, Siopathis MR, Gorges AJ 1984. Patogeni enterici parassitari, batterici e virali associati alla diarrea nella Repubblica Centrafricana. J Clin Microbiol 19: 571-575.

• Gomes T, Rassi V, Macdonald K, Ramos S, Trabulsi LR, Vieira M, Guth B, Candeias J, Ivey C, Toledo MR, Blake P 1991. Enteropatogeni associati alla malattia diarroica acuta in neonati urbani a San Paolo, Brasile. J Infect Dis 7: 164-331.

• Guerrant RL, Kirchhoff LV 1983. Studio prospettico delle malattie diarroiche nel Brasile nord-orientale: modelli di malattia, impatto nutrizionale, eziologie e fattori di rischio. J Infect Dis 7: 753-759.

• Leal N, Cavalcanti T, Hofer E 1988. Enteropatogeni rilevati in bambini sani in tre comunità a basso reddito a Recife, stato di Pernambuco, Brasile. Mem Inst Oswaldo Cruz 83: 153-159.

• Linhares AC 1997. Infezione da Rotavirus in Brasile: epidemiologia, immunità e potenziale vaccinazione. Braz J Infect Dis 1: 284-293.

• Munhoz OH, Coelho-Ramirez P, Serafin FA, Olarte J, Pickering LK, Du Pont H, Gutierrez G 1979. Gastroenterite infecciosa aguda. Eziologia e correlazione con le manifestazioni cliniche e il moco fecale. Arch Invest Med 10: 135-145.

• Plano Plurianual de Saúde, Rondônia 1996. Segreteria di Stato della Salute della Rondônia, 168 pp.

• Riley LW, Ceballos BJO, Trabulsi LR, Toledo MRF, Blake PA 1984. L’importanza degli ospedali come serbatoi per la Salmonella typhimurium multiresistente endemica che causa l’infezione nei bambini brasiliani urbani. J Infect Dis 150: 236-241.

• Scragg JN, Rubidge CJ, Appelbaum PC 1978. Infezione da Shigella in bambini africani e indiani con particolare riferimento alla setticemia da Shigella. J Pediatr 93: 796-797.

• Stool BJ, Glass RJ, Huq MI, Khan MU, Bann H, Holt J 1982. Caratteristiche epidemiologiche e cliniche dei pazienti infettati da Shigella che hanno frequentato un ospedale per malattie diarroiche in Bangladesh. J Infect Dis 146: 177-183.

• Tornieporth NG, John J, Salgado K, Jesus P, Latham E, Melo MCN, Gunzburg ST, Riley LW 1995. Differenziazione di ceppi patogeni di Escherichia coli in bambini brasiliani mediante PCR. J Clinical Microbiol 33: 1371-1374.

• Trabulsi LR, Toledo MRF, Ceballos BSO, Candeias JAN 1985a. Epidemiologia delle malattie diarroiche in Sud America. Elsevier Science Publisher 12: 121-125.

• Trabulsi LR, Toledo, MRF, Murahovschi J, Neto UF, Candeias JAN 1985b. Epidemiologia della diarrea batterica infantile in Brasile. Bact Diar Dis 20: 25-36.

Figura | Tabella I | Tabella II | Tabella III