Diagnosi dell’infezione da Legionella

Abstract

Le Legionelle, che sono importanti cause di polmonite nell’uomo, continuano ad essere erroneamente etichettate come patogeni esotici. La capacità di diagnosticare l’infezione da Legionella è limitata dalla natura aspecifica delle caratteristiche cliniche e dalle carenze dei test diagnostici. Nonostante i recenti miglioramenti, i test diagnostici esistenti per l’infezione da Legionella mancano di sensibilità per rilevare tutte le legionelle clinicamente importanti o non sono in grado di fornire risultati in un arco di tempo clinicamente utile. La comprensione dell’epidemiologia locale della legionella è importante per decidere se effettuare il test per l’infezione da legionella e quali test diagnostici utilizzare. Nella maggior parte delle situazioni, l’uso di entrambi i test dell’antigene urinario più la coltura dell’espettorato è la migliore combinazione diagnostica. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è uno strumento promettente, ma i test standardizzati non sono disponibili in commercio. Un ulteriore lavoro deve concentrarsi sullo sviluppo di test dell’antigene urinario che rilevi una gamma più ampia di legionelle patogene e sullo sviluppo di test PCR standardizzati.

La malattia dei legionari continua ad avere la reputazione di essere un’infezione esotica. Al contrario, quando si cerca sistematicamente, le specie di Legionella sono costantemente riconosciute come una delle cause comuni di polmonite. Al di fuori dell’ambiente di ricerca, tuttavia, le diagnosi confermate di legionellosi sono infrequenti. Questa mancata diagnosi di legionellosi nella pratica di routine è in gran parte il risultato di 3 fattori: l’incapacità di distinguere clinicamente e radiograficamente la legionellosi da altre cause di polmonite, il mancato ordine di test diagnostici per l’infezione da legionella, e le carenze dei test diagnostici disponibili. La malattia dei legionari è più accuratamente descritta come una diagnosi elusiva piuttosto che un’infezione esotica.

Anche se i metodi diagnostici sono migliorati durante i 25 anni da quando la Legionella pneumophila fu descritta per la prima volta, nessun test attualmente disponibile è in grado di diagnosticare la malattia dei legionari in modo tempestivo con un alto grado di sensibilità e specificità. Infatti, alcuni autori hanno messo in discussione l’ordinazione di routine di qualsiasi test microbiologico per i pazienti con polmonite, supportati da dati che suggeriscono che tali test non influenzano significativamente la scelta della terapia antibiotica e l’esito del paziente. Recentemente, Marrie ha sostenuto che questo approccio alla diagnosi della legionellosi è sbagliato. Il mancato test per l’infezione da legionella può ritardare il riconoscimento dei focolai di legionellosi, può mancare i cambiamenti nell’epidemiologia della malattia (compreso lo sviluppo della resistenza antimicrobica), e può impedire alle persone di chiedere un risarcimento per l’infezione acquisita sul lavoro. È importante che sia possibile selezionare un sottoinsieme di pazienti per i quali il rendimento dei test diagnostici per l’infezione da legionella è elevato e che beneficerebbero di una diagnosi specifica.

Questa revisione si concentra sugli attuali test diagnostici per l’infezione da legionella, con particolare attenzione ai test che forniscono una diagnosi in un lasso di tempo che influenzerà la gestione iniziale dell’infezione. Nell’esaminare i vari test diagnostici per l’infezione da Legionella, è importante tenere a mente diversi fattori. In primo luogo, per diagnosticare l’infezione da legionella sono necessari dei test specializzati, che devono essere specificamente richiesti dal medico. In secondo luogo, è importante apprezzare la distinzione tra le prestazioni di un test in un laboratorio di ricerca e ciò che può essere realisticamente raggiunto in un laboratorio diagnostico locale. Una considerevole variazione interlaboratorio è stata documentata per la capacità di coltivare le legionelle, e questo probabilmente si estenderà anche ad altri test. In terzo luogo, l’interpretazione delle prestazioni dei test diagnostici è ostacolata dalla mancanza di un adeguato “gold standard”. I dati di sensibilità e specificità calcolati varieranno con diversi standard di confronto. In quarto luogo, l’utilità dei test diagnostici è influenzata dall’epidemiologia locale della legionella. Il sierogruppo 1 di L. pneumophila è la causa predominante della legionellosi in molte, se non la maggior parte, aree del mondo, e l’infezione con questo organismo è più facile da diagnosticare rispetto a quella con altre specie e sierogruppi di Legionella. In alcune regioni, altre specie e sierogruppi sono più importanti. Per esempio, Legionella longbeachae è una delle principali cause di legionellosi in Australia e Nuova Zelanda, dove è spesso associata all’esposizione al terriccio. L’infezione con questa specie non sarà rilevata dagli attuali test dell’antigene urinario e sarà mancata dai laboratori che eseguono test sierologici solo per L. pneumophila.

Cultura

La diagnosi in coltura richiede mezzi speciali, un adeguato trattamento dei campioni e competenze tecniche (tabella 1). Sono necessari diversi giorni per ottenere un risultato positivo, con la maggior parte delle colonie di Legionella rilevate entro 3-5 giorni. Il terreno standard utilizzato per la coltura delle legionelle è l’agar di estratto di lievito di carbone tamponato (BCYE) integrato con α-chetoglutarato, con o senza agenti antimicrobici. Questo terreno fornisce ferro e L-cisteina, entrambi essenziali per la crescita delle legionelle. La crescita di alcune specie di Legionella (ad esempio, Legionella micdadei e Legionella bozemanii) è migliorata dall’aggiunta di BCYE agar con albumina di siero bovino, e l’aggiunta di coloranti indicatori ai mezzi può aiutare l’identificazione. I terreni di coltura contenenti cefamandole inibiscono la crescita delle specie di Legionella che non producono β-lattamasi, come L. micdadei e L. bozemanii.

Le legionelle possono essere isolate da una varietà di tipi di campioni, sebbene le secrezioni del tratto respiratorio inferiore (es, espettorato e campioni da broncoscopia) sono i campioni di scelta. La principale limitazione della coltura dell’espettorato è che meno della metà dei pazienti con la malattia dei legionari produce l’espettorato. Altri fattori influenzano la sensibilità della coltura una volta ottenuto un campione di espettorato. I batteri della legionella possono sopravvivere poco nelle secrezioni respiratorie, e questi campioni dovrebbero essere trattati prontamente. Alcuni pazienti affetti da legionellosi producono espettorato che ha relativamente poca purulenza; questi campioni possono essere rifiutati dai laboratori che scartano i campioni di espettorato contenenti pochi leucociti polimorfonucleati. Di conseguenza, i criteri di rifiuto non dovrebbero essere applicati ai campioni di espettorato inviati per la coltura della legionella. Anche l’esperienza del personale di laboratorio è importante, e i laboratori esperti nella coltura della Legionella hanno maggiori probabilità di recuperare l’organismo.

Le sensibilità stimate della coltura dell’espettorato vanno da <10% a ∼80% e variano in base ai diversi standard di confronto e dai singoli laboratori. In pratica, è probabile che i risultati migliori siano raggiunti solo da laboratori con un interesse speciale nell’infezione da Legionella, e le sensibilità sono di solito <50% quando i risultati sierologici sono usati come standard. I campioni broncoscopici possono produrre una resa diagnostica maggiore rispetto ai campioni di espettorato.

Le specie di Legionella possono essere isolate dalle colture di sangue, ma la resa è scarsa. La crescita delle legionelle è mantenuta dai mezzi di emocoltura di routine, ma può non attivare l’allarme delle macchine per emocoltura commerciali. Di conseguenza, sono necessarie subcolture alla cieca su terreni solidi. Nel complesso, la resa delle emocolture è bassa ed è improbabile che influisca sulla gestione clinica.

Macchiatura diretta con anticorpi fluorescenti (Dfa)

La colorazione DFA può individuare le legionelle nelle secrezioni respiratorie e nei campioni di tessuto. Questa tecnica ha il vantaggio di fornire un risultato entro 2-4 ore, ma è tecnicamente impegnativa e dovrebbe essere eseguita da personale di laboratorio esperto. Le sensibilità riportate della colorazione DFA variano, sono costantemente inferiori a quelle della coltura e sono meno note per le specie diverse da L. pneumophila. Per le secrezioni del tratto respiratorio inferiore, le sensibilità sono generalmente comprese tra il 25% e il 66%, con i campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare che hanno una resa maggiore rispetto ai campioni di espettorato o transtracheali. La specificità della colorazione DFA è stata stimata essere ∼94%, anche se è probabile che il test sia meno specifico in mani inesperte. Risultati falsi positivi possono verificarsi a causa di reazioni incrociate con altri batteri, tra cui Bacteroides fragilis, specie Pseudomonas, specie Stenotrophomonas e specie Flavobacterium. Le reazioni incrociate possono essere meno di un problema quando vengono usati agenti DFA con anticorpi monoclonali. I problemi di sensibilità e specificità hanno limitato l’uso della colorazione DFA, e un risultato DFA positivo in assenza di altre prove di supporto non è ora generalmente accettato come sufficiente per la diagnosi di infezione da Legionella.

Rilevazione dell’antigene urinario

La rilevazione dell’antigene solubile della Legionella nei campioni di urina è un metodo rapido che fornisce una diagnosi precoce di infezione da Legionella ed è stato uno strumento utile per l’indagine di focolai di legionellosi. I kit commerciali che utilizzano entrambe le metodologie RIA e EIA sono disponibili da diversi anni e hanno caratteristiche di prestazione simili. Recentemente, è stato sviluppato un test immunocromatografico (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax) che ha sensibilità e specificità simili all’EIA. Questo test è facile da eseguire e può fornire un risultato entro 15 minuti.

Per il rilevamento del sierogruppo 1 di L. pneumophila, i test dell’antigene urinario hanno sensibilità nell’intervallo 70%-100% e specificità che si avvicinano al 100%. Le sensibilità possono essere aumentate fino al 20% con una concentrazione di 25 volte dei campioni di urina prima del test. Lo svantaggio principale di questi test è la loro incapacità di rilevare in modo affidabile organismi diversi dal sierogruppo 1 di L. pneumophila. Sono stati sviluppati test ad ampio spettro che rilevano antigeni solubili di un’ampia varietà di specie di Legionella, ma non sono disponibili in commercio. Il Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) è destinato a rilevare legionelle diverse da L. pneumophila sierogruppo 1, ma lo fa in modo meno affidabile di quanto rilevi L. pneumophila sierogruppo 1 . Risultati falsi positivi dell’antigene urinario si sono verificati in pazienti con malattia da siero.

L’antigenuria da legionella può essere rilevata già 1 giorno dopo la comparsa dei sintomi e persiste per giorni o settimane. In un caso, l’escrezione di antigene è stata documentata per >300 giorni. Gli antigeni solubili di Legionella sono stati rilevati anche in campioni diversi dalle urine, compresi campioni di espettorato, tessuto polmonare, siero e liquido pleurico, anche se l’uso di tali campioni non è stato pienamente valutato.

Il test dell’antigene urinario è ora uno strumento consolidato e prezioso per la diagnosi della malattia dei legionari, in particolare nelle regioni in cui il sierogruppo 1 di L. pneumophila è la causa più comune della malattia. Nelle località in cui solo una minoranza delle infezioni è causata dal sierogruppo 1 di L. pneumophila, i test dell’antigene urinario attualmente disponibili contribuiscono meno ai test di laboratorio esistenti.

Test sierologici

I test sierologici per l’infezione da legionella sono uno strumento epidemiologico prezioso, ma hanno un impatto limitato sul processo decisionale clinico a causa del ritardo temporale prima che un risultato sia disponibile. Gli anticorpi prodotti in risposta all’infezione sono generalmente una miscela di IgA, IgM e IgG, e i test dovrebbero rilevare tutti i tipi per una sensibilità ottimale. La misurazione delle IgM specifiche è un marcatore inaffidabile dell’infezione acuta, perché gli anticorpi IgM possono persistere per lunghi periodi di tempo. La sieroconversione può richiedere diverse settimane, che è una delle principali limitazioni dei test sierologici. Nella maggior parte dei casi, un aumento di 4 volte del titolo anticorpale viene rilevato entro 3-4 settimane, ma in alcuni casi, questo può richiedere >10 settimane. L’ottenimento di campioni di siero in fase di convalescenza troppo presto porta senza dubbio a molti risultati falsi negativi e probabilmente spiega in parte il 20%-30% dei pazienti con legionellosi che presumibilmente non sviluppano una risposta anticorpale rilevabile. Tuttavia, è chiaro che una parte delle persone con infezione da legionella provata non hanno una sieroconversione rilevabile. In pratica, i medici dovrebbero essere incoraggiati a ottenere campioni di siero in fase di convalescenza 3 settimane dopo l’inizio della malattia per l’analisi in parallelo con il siero ottenuto durante la fase acuta. Se non c’è sieroconversione dopo questo periodo di tempo e si sospetta ancora un’infezione da Legionella, si dovrebbe ottenere un ulteriore campione in fase di convalescenza.

Tra i vari metodi di rilevamento degli anticorpi disponibili, l’immunofluorescenza indiretta è il test standard di riferimento. Un aumento di 4 volte o più del titolo anticorpale reciproco a ⩾128 è considerato diagnostico. I titoli anticorpali reciproci in fase acuta di ⩾256 in presenza di polmonite erano una volta considerati sufficienti per una diagnosi presuntiva, ma questo si è dimostrato inaffidabile, specialmente data l’alta prevalenza di positività degli anticorpi alla legionella tra alcune persone senza evidenza clinica di legionellosi. Non c’è praticamente alcun ruolo per l’analisi di singoli campioni di siero.

Un altro svantaggio dei test sierologici è l’incapacità di rilevare con precisione tutte le specie e i sierogruppi di Legionella. Anche se la sieroconversione al sierogruppo 1 di L. pneumophila è generalmente considerata come altamente predittiva della malattia, la sensibilità e la specificità della sieroconversione ad altre specie e sierogruppi non è stata rigorosamente confermata. Inoltre, la formazione di anticorpi cross-reattivi tra i membri della famiglia delle Legionellaceae può rendere difficile determinare la specie o il sierogruppo infettante. Alcuni pazienti con infezione da non-L. pneumophila sierogruppo 1 avranno una sieroconversione a L. pneumophila sierogruppo 1. Al contrario, l’identificazione basata sulla sequenza dei prodotti PCR di Legionella di pazienti che hanno avuto la sieroconversione a specie di Legionella diverse da L. pneumophila indica che alcuni sono stati probabilmente infettati da L. pneumophila (osservazioni non pubblicate). Gli anticorpi cross-reattivi si trovano occasionalmente anche in pazienti con infezioni causate da batteri non Legionella, compresi pseudomonadi, micobatteri, specie Bacteroides e specie Campylobacter. Un’interessante reazione incrociata si verifica tra L. bozemanii e Rickettsia typhi come risultato di un antigene condiviso.

Amplificazione dell’acido nucleico

Di recente, le tecniche di rilevamento del DNA si sono dimostrate promettenti per la diagnosi rapida dell’infezione da Legionella. La PCR permette l’amplificazione specifica di quantità minime di DNA di Legionella, fornisce risultati in tempi brevi ed è in grado di rilevare le infezioni causate da qualsiasi specie e sierogruppo di Legionella. Attualmente, la PCR della legionella è disponibile solo in un numero limitato di laboratori che utilizzano una varietà di test interni.

La PCR è stata utilizzata con successo per rilevare il DNA della legionella in una serie di campioni ambientali e clinici. Quando si analizzano campioni del tratto respiratorio inferiore, la PCR ha ripetutamente dimostrato di avere una sensibilità pari o superiore alla coltura. Infatti, la PCR potrebbe essere considerata il test di scelta per i pazienti che producono espettorato. Il ruolo della PCR per testare altri tipi di campioni è meno chiaro. Il DNA della legionella può essere rilevato in campioni di urina, siero e leucociti ottenuti da pazienti con legionellosi con sensibilità del 30%-86%. La sensibilità della PCR è probabile che aumenti quando si testano i campioni che sono ottenuti all’inizio del corso della malattia e quando si testa >1 tipo di campione da ogni paziente. I tamponi della gola possono anche essere un campione adatto per il test PCR, ma questa applicazione è stata valutata solo in un singolo studio.

Sono necessari ulteriori lavori per stabilire un metodo PCR standard che sia abbastanza robusto da essere usato al di fuori di un laboratorio di ricerca. La sua applicazione a campioni non respiratori è particolarmente interessante, perché questo eluderà il problema dei pazienti che non producono campioni di espettorato. Lo sviluppo di un test PCR ottimale è stato complicato dalla contaminazione intermittente di alcuni kit commerciali di estrazione del DNA con DNA di Legionella. L’uso di questi kit per elaborare i campioni può portare a risultati falsamente positivi e sottolinea l’importanza di includere controlli appropriati in ogni analisi.

Strategia di test

Perché la legionellosi non può essere distinta clinicamente o radiograficamente da altre cause di polmonite, la decisione di testare l’infezione da legionella può essere difficile e spesso viene presa in modo irregolare. È importante avere familiarità con l’epidemiologia locale. Alcuni laboratori in aree in cui le specie di Legionella sono una causa comune di polmonite hanno scelto di coltivare di routine tutti i campioni di espettorato ottenuti da pazienti con polmonite su terreni di coltura di Legionella. Pochi laboratori, tuttavia, sarebbero in grado di giustificare il costo aggiuntivo associato alla coltura di routine della legionella. Nella maggior parte dei luoghi, l’incidenza dell’infezione da Legionella è sconosciuta, e la decisione di ordinare test diagnostici per l’infezione da Legionella è di solito limitata ai pazienti a rischio, ai pazienti con polmonite grave, e agli scenari di epidemia. È certamente possibile selezionare un sottogruppo di pazienti per i quali il rendimento dei test diagnostici per la Legionella sarà probabilmente relativamente alto. Questo gruppo comprende le persone anziane, i fumatori, gli individui immunosoppressi, quelli con malattie polmonari croniche, i pazienti che risiedono in ospedali con forniture di acqua colonizzata dalla legionella, e gli individui esposti alla miscela di vasi. L’incidenza della malattia dei legionari è più alta tra i pazienti con polmonite grave, e tutti i pazienti con polmonite che sono ricoverati in un’unità di terapia intensiva dovrebbero essere testati per questa infezione.

Nelle località in cui il sierogruppo 1 di L. pneumophila è la causa predominante dell’infezione da Legionella, o durante un focolaio di infezione da L. pneumophila sierogruppo 1, il test dell’antigene urinario è uno strumento diagnostico particolarmente prezioso. Lo sviluppo di un test commerciale dell’antigene urinario che rilevi in modo affidabile anche altri patogeni umani della Legionella sarebbe un grande progresso e probabilmente lo renderebbe il test diagnostico di scelta in quasi tutti i contesti. Nei luoghi geografici in cui le legionelle diverse da L. pneumophila sierogruppo 1 sono patogeni numericamente importanti, gli attuali test dell’antigene urinario sono ancora utili ma non dovrebbero essere utilizzati come unico strumento diagnostico. Se disponibile, la PCR della legionella combinata con il test dell’antigene urinario è probabilmente la migliore strategia di test iniziale che rileverà tutte le specie di legionella e fornirà risultati in un lasso di tempo che influenzerà la gestione clinica.

Se la PCR non è disponibile, il test dell’antigene urinario combinato con la coltura di campioni del tratto respiratorio inferiore è la migliore combinazione di test. La cultura rimane un importante strumento diagnostico, ma la sua sensibilità relativamente bassa e la dipendenza dalla disponibilità di un campione del tratto respiratorio inferiore lo rendono inadeguato come unico test diagnostico. Anche se i test sierologici non hanno alcun impatto sulla gestione iniziale, possono essere utili se non viene fatta una diagnosi specifica durante la fase acuta dell’infezione, ma i campioni della fase acuta e convalescente devono essere testati in parallelo. Durante un sospetto focolaio di legionellosi, un approccio aggressivo alla diagnosi è garantito, che comporterebbe l’uso di una combinazione di metodi di prova.

Le specie di Legionella possono occasionalmente causare la febbre di Pontiac, una malattia acuta, febbrile e non polmonare caratterizzata da un alto tasso di attacchi, un breve periodo di incubazione e una rapida guarigione. La diagnosi della febbre di Pontiac di solito si basa sul riconoscimento di caratteristiche cliniche tipiche durante una situazione di epidemia, e la diagnosi è confermata da test sierologici di persone colpite. L’uso della cultura è in gran parte limitato all’analisi di campioni ambientali per determinare la fonte del focolaio, anche se il sierogruppo 1 di L. pneumophila è stato isolato da un aspirato tracheale di un bambino con febbre di Pontiac. La diagnosi si basa sull’uso di test specializzati, spesso in combinazione. I test dell’antigene urinario, la coltura dell’espettorato e il test PCR dei campioni del tratto respiratorio inferiore sono gli strumenti diagnostici più importanti per il rilevamento dell’infezione da Legionella nelle prime fasi della malattia. Lo sviluppo di test dell’antigene urinario in grado di rilevare una gamma più ampia di legionelle patogene e lo sviluppo di test PCR standardizzati saranno importanti progressi nella diagnostica della legionella. La maggiore disponibilità e l’uso di test diagnostici migliorati aiuteranno a caratterizzare meglio l’epidemiologia della malattia dei legionari, compresa la vera incidenza e la variazione geografica.

Riconoscimenti

Sono grato a Steve Chambers per gli utili commenti sull’articolo nel manoscritto.