Confrontando la quantità e la qualità del DNA usando la raccolta della saliva dopo il consumo di cibo e bevande

Materiali e metodi

Abbiamo ottenuto l’approvazione dalla commissione di revisione istituzionale per la protezione dei soggetti umani dell’Air Force Research Laboratory, numero di protocollo FWR20180101H. I soggetti sono stati informati individualmente e hanno firmato i documenti di consenso testimoniato da una terza parte. I campioni sono stati raccolti da cinque soggetti usando l’Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab (Epicentre, Madison, WI) e l’Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit (Isohelix, Kent, UK). Tutti i campioni raccolti sono stati raccolti lo stesso giorno con almeno 30 minuti tra ogni raccolta o nel corso di 3 giorni, a causa dei vincoli di tempo dei partecipanti. Sono stati raccolti due tamponi per soggetto; ogni tampone è stato strofinato contro l’interno di ogni guancia per 10-15 s. Sono stati raccolti sei campioni di saliva: secondo le istruzioni del produttore, immediatamente dopo aver bevuto un bicchiere d’acqua, mangiato il pranzo, bevuto una bibita gassata, bevuto una bevanda sportiva o bevuto il caffè.

I tamponi sono stati estratti utilizzando la soluzione di estrazione del DNA Epicentre QuickExtract™ 1.0 (Epicentre). Il primo tampone è stato elaborato così com’è e il secondo è stato purificato utilizzando il Wizard™ SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, WI) utilizzando il protocollo di microcentrifuga per la purificazione del DNA genomico dai lisati di cellule di coltura di tessuti. Non c’era nessun passaggio di lavaggio delle cellule perché i campioni erano già in soluzione. I campioni di saliva sono stati estratti utilizzando il QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) con il protocollo di estrazione della saliva modificato dal produttore.

I campioni sono stati quantificati utilizzando il NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e il Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) con il Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. Il NanoDrop è stato utilizzato anche per valutare la purezza dei campioni confrontando i valori di assorbanza a 260 e 280 nm (A260/A280). Entrambi sono stati utilizzati secondo i protocolli del produttore. I campioni estratti, normalizzati a 10 ng/μL in base alle concentrazioni Qubit, sono stati analizzati utilizzando un gel di agarosio E-Gel® Precast al 2% (Thermo Fisher Scientific). Il Bioanalyzer Agilent (Agilent, Santa Clara, CA) insieme all’High Sensitivity DNA Chip è stato utilizzato per determinare la qualità del DNA estratto.

I campioni sono stati poi analizzati sull’Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) per testare due marcatori genetici legati alle allergie alle arachidi: rs7192 e rs9275596 . La genotipizzazione è stata effettuata con un’impostazione rapida della reazione a catena della pre-polimerasi (PCR) a 60 °C per 1 min, un ciclo di mantenimento di 95 °C per 10 min, 40 cicli di 95 °C per 15 s e poi 60 °C per 1 min, e una post-PCR a 60 °C per 1 min. È stata utilizzata la Master Mix TaqPath ProAmp (Thermo Fisher Scientific). I saggi di polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) sono stati utilizzati a metà della concentrazione raccomandata dal produttore. Il volume finale era di 10 µL.

Risultati

Il metodo di estrazione del tampone utilizzando la soluzione QuickExtract ha prodotto un’elevata quantità di DNA. I valori di DNA ottenuti dal tampone senza alcuna ulteriore elaborazione variavano da 1,38 a 54,2 pg/µL, come determinato dal Bioanalyzer (file aggiuntivo 1: tabella S1). Tuttavia, i risultati precedenti non riportati dal nostro laboratorio hanno dimostrato che gli esperimenti di sequenziamento sono stati inibiti quando le librerie sono stati preparati direttamente dalla soluzione QuickExtract estrazioni. Pertanto, abbiamo purificato questi campioni utilizzando un protocollo di purificazione su colonna Wizard, diminuendo la concentrazione, come previsto (che vanno da 2.59 a 38.2 pg/µL), e migliorando i rapporti A260/A280 più vicino al range generalmente accettato (1.8-2.1).

Campioni di sputo raccolti secondo il protocollo del produttore ed estratti utilizzando il kit QIAamp sangue DNA aveva una gamma di 1.01 ng/μL a 8.20 ng/μL. La purezza indicata dalla misurazione A260/A280 era tipicamente nell’intervallo per il DNA (vedi file aggiuntivo 1: Tabella S1). Nessuno dei campioni di saliva raccolti dopo che i soggetti avevano bevuto varie bevande o avevano pranzato ha mostrato concentrazioni di DNA e letture di purezza significativamente diverse da quelle raccolte utilizzando il protocollo del produttore (30 minuti di digiuno) (Fig. 1).

I campioni estratti normalizzati a 10 ng/μL come determinato da Qubit 4.0 letture sono stati eseguiti su un 2% E-Gel utilizzando un ladder 1-kb (Additional file 1: Figura S1). Ci aspettavamo di vedere una banda verso la parte superiore del gel che rappresenta un’estrazione di DNA ad alto peso molecolare. Come previsto, il DNA estratto dai vari metodi di raccolta della saliva era di alto peso molecolare. Nonostante sia stato normalizzato a un input di 10-ng/µL, la maggior parte dei campioni di tampone non risultano in una banda chiara, suggerendo sia la presenza di interferenti di carica o qualche altro problema sistematico.

Analisi più dettagliata dimensione e purezza su un Bioanalyzer ha mostrato tutti i campioni e tutte le condizioni per avere prevalentemente alto peso molecolare DNA e concentrazioni simili (Fig. 2). A parte la già citata bassa concentrazione dopo la purificazione dell’estrazione del tampone, non ci sono tendenze legate alle condizioni di raccolta (mangiare o bere) nella qualità, dimensione o concentrazione del DNA che diventano evidenti quando si analizzano i segnali dell’elettroferogramma. Sembra esserci un cambiamento dipendente dal soggetto, anche se questo fenomeno non è stato perseguito ulteriormente.

Infine, abbiamo usato la genotipizzazione SNP per verificare l’idoneità del DNA estratto per processi molecolari a valle (Fig. 3). Tutti i campioni estratti da tutti i soggetti sono stati in grado di produrre con successo risultati utilizzabili per la genotipizzazione di due SNP associati alle allergie alle arachidi, con l’eccezione di uno dei campioni di tampone purificati (soggetto 5B).

Discussione

Quando si progetta uno studio di ricerca genetica, un prodotto commerciale o un intervento sanitario, l’usabilità e la conformità dell’utente finale sono due considerazioni critiche. I dispositivi di raccolta del sangue che richiedono punture di pelle possono avere una minore adesione a causa dell’avversione al dolore. Dalle osservazioni nel nostro laboratorio, abbiamo notato aneddoticamente una diminuzione del tasso di iscrizione agli studi quando la differenza primaria è la venipuntura rispetto al campionamento della saliva. Non abbiamo eseguito uno studio controllato per indagare questo fenomeno; piuttosto, abbiamo scelto di procedere con il campionamento della saliva basato sulla facilità d’uso, apparente aumento di iscrizione, e il tipo di studi di ricerca prevalentemente eseguiti nel nostro laboratorio. Come i nostri studi coinvolgono auto-somministrazione del campionamento di saliva, abbiamo cercato di determinare se c’è una quantità abbastanza alta e qualità del DNA presente per l’uso in applicazioni molecolari a valle dopo varie condizioni di raccolta di campo probabile, principalmente diversa assunzione di cibo e bevande. Il disegno dello studio non era inteso per il confronto incrociato tra individui; piuttosto, abbiamo cercato di confrontare la variabilità intra-soggetto della raccolta del campione. Con questo obiettivo in mente, non abbiamo osservato alcuna diminuzione significativa delle quantità di DNA causata dalla variazione rispetto alle istruzioni del produttore di digiunare per 30 minuti prima della raccolta.

Anche se la quantità di DNA è importante, più critica per tecniche avanzate di biologia molecolare è la qualità del DNA ottenuto. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che la raccolta di campioni di saliva dopo aver mangiato e bevuto non ha influito sulla resa di DNA ad alto peso molecolare. Tale DNA è fondamentale per il sequenziamento di prossima generazione, la scansione di array e la genotipizzazione PCR. Inoltre, un test sperimentale utilizzando due obiettivi genetici indipendenti nella genotipizzazione PCR ha dimostrato che questi campioni erano suscettibili di analisi molecolari.

Il nostro obiettivo previsto con questo studio era quello di vedere se la qualità e la quantità del DNA dalla raccolta di saliva da un kit di raccolta del DNA salivare sarebbe influenzato da non seguire le indicazioni del produttore, cioè, bere o mangiare subito prima della raccolta. Coerentemente con la nostra ipotesi, non abbiamo visto una differenza nella quantità o qualità del DNA isolato.

Conclusione

Genetica studi hanno esteso oltre il regno di un impegno puramente scientifico e sono ora comune tra il pubblico dei consumatori. Per ottimizzare i campioni umani per questi studi, i produttori stanno cercando di sviluppare metodi di raccolta semplici e robusti. Il campionamento della saliva è il meno invasivo di questi metodi, produce DNA di alta qualità e fornisce un’eccellente stabilità del prodotto. Il nostro studio sul DNA ottenuto dalla saliva dopo il consumo di varie bevande e/o snack ha dimostrato che non vi è alcuna differenza significativa nella quantità e nella qualità del DNA raccolto utilizzando il kit di raccolta del DNA salivare Isohelix GeneFiX (Isohelix) quando i campioni non vengono raccolti secondo il protocollo del produttore. Anche se la dimensione del campione in questo studio è piccola, osservazioni da altri studi nel nostro laboratorio sono coerenti con i risultati del nostro confronto sistematico presentato qui. Concludiamo quindi che la raccolta della saliva è un modo robusto e non invasivo per raccogliere campioni sia in laboratorio che sul campo, e il requisito di 30 minuti di astensione da cibo e bevande è un ideale e non un assoluto.