I componenti di un sistema base di cromatografia liquida ad alte prestazioni sono mostrati nel semplice diagramma della Figura E.
Un serbatoio contiene il solvente. Una pompa ad alta pressione viene utilizzata per generare e misurare una determinata portata di fase mobile, in genere millilitri al minuto. Un iniettore è in grado di introdurre il campione nel flusso di fase mobile a flusso continuo che porta il campione nella colonna HPLC. La colonna contiene il materiale di imballaggio cromatografico necessario per effettuare la separazione. Questo materiale di imballaggio è chiamato fase stazionaria perché è tenuto in posizione dall’hardware della colonna. Un rivelatore è necessario per vedere le bande di composti separati mentre eluiscono dalla colonna HPLC. La fase mobile esce dal rivelatore e può essere inviata ai rifiuti o raccolta, come desiderato. Quando la fase mobile contiene una banda di composti separati, l’HPLC offre la possibilità di raccogliere questa frazione dell’eluato contenente quel composto purificato per ulteriori studi. Questa è chiamata cromatografia preparativa.
Nota che i tubi e i raccordi ad alta pressione sono usati per interconnettere la pompa, l’iniettore, la colonna e i componenti del rivelatore per formare il condotto per la fase mobile, il campione e le bande di composti separati.
Figura E: Sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni
Il rivelatore è collegato alla stazione dati del computer, il componente del sistema HPLC che registra il segnale elettrico necessario per generare il cromatogramma sul suo display e per identificare e quantificare la concentrazione dei costituenti del campione (vedi Figura F). Poiché le caratteristiche dei composti del campione possono essere molto diverse, sono stati sviluppati diversi tipi di rivelatori. Per esempio, se un composto può assorbire la luce ultravioletta, viene utilizzato un rilevatore di assorbanza UV. Se il composto è fluorescente, si usa un rilevatore di fluorescenza. Se il composto non ha nessuna di queste caratteristiche, si usa un tipo di rivelatore più universale, come un rivelatore a diffusione di luce evaporativa. L’approccio più potente è l’uso di più rivelatori in serie. Per esempio, un rivelatore UV e/o ELSD può essere usato in combinazione con uno spettrometro di massa per analizzare i risultati della separazione cromatografica. Questo fornisce, da una singola iniezione, informazioni più complete su un analita. La pratica di accoppiare uno spettrometro di massa a un sistema HPLC è chiamata LC/MS.
Figura F: Un tipico sistema HPLC
Funzionamento HPPLC
Un modo semplice per capire come si ottiene la separazione dei composti contenuti in un campione è visualizzare il diagramma in Figura G.
La fase mobile entra nella colonna da sinistra, passa attraverso il letto di particelle ed esce a destra. La direzione del flusso è rappresentata dalle frecce verdi. Per prima cosa, considera l’immagine in alto; rappresenta la colonna al tempo zero, quando il campione entra nella colonna e comincia a formare una banda. Il campione mostrato qui, una miscela di coloranti giallo, rosso e blu, appare all’ingresso della colonna come una singola banda nera.
Dopo alcuni minuti, durante i quali la fase mobile scorre continuamente e costantemente oltre le particelle di materiale di riempimento, possiamo vedere che i singoli coloranti si sono spostati in bande separate a velocità diverse. Questo perché c’è una competizione tra la fase mobile e la fase stazionaria per attrarre ciascuno dei coloranti o analiti. Notate che la banda del colorante giallo si muove più velocemente e sta per uscire dalla colonna. Il colorante giallo ama la fase mobile più degli altri coloranti. Pertanto, si muove ad una velocità maggiore, più vicina a quella della fase mobile. La banda del colorante blu ama il materiale di imballaggio più della fase mobile. La sua forte attrazione per le particelle lo fa muovere molto più lentamente. In altre parole, è il composto più trattenuto in questa miscela di campioni. La banda del colorante rosso ha un’attrazione intermedia per la fase mobile e quindi si muove ad una velocità intermedia attraverso la colonna. Poiché ogni banda di colorante si muove a velocità diversa, siamo in grado di separarla cromatograficamente.
Figura G: Capire come funziona una colonna cromatografica – Bande
Cos’è un rivelatore?
Quando le bande di colorante separate lasciano la colonna, passano immediatamente nel rivelatore. Il rivelatore contiene una cella di flusso che vede ogni banda di composto separato contro uno sfondo di fase mobile. Un rivelatore appropriato ha la capacità di percepire la presenza di un composto e di inviare il suo corrispondente segnale elettrico a una stazione dati del computer. Viene fatta una scelta tra molti tipi diversi di rivelatori, a seconda delle caratteristiche e delle concentrazioni dei composti che devono essere separati e analizzati, come discusso in precedenza.
Che cos’è un cromatogramma?
Un cromatogramma è una rappresentazione della separazione avvenuta chimicamente nel sistema HPLC. Una serie di picchi che salgono da una linea di base è disegnata su un asse temporale. Ogni picco rappresenta la risposta del rivelatore per un composto diverso. Il cromatogramma è tracciato dalla stazione dati del computer.
Figura H: Come vengono creati i picchi
Nella Figura H, la banda gialla è passata completamente attraverso la cella di flusso del rivelatore; il segnale elettrico generato è stato inviato alla stazione dati del computer. Il cromatogramma risultante ha iniziato ad apparire sullo schermo. Nota che il cromatogramma inizia quando il campione è stato iniettato per la prima volta e inizia come una linea retta posta vicino al fondo dello schermo. Questa è chiamata linea di base; rappresenta la fase mobile pura che passa attraverso la cella di flusso nel tempo. Man mano che la banda gialla dell’analita passa attraverso la cella a flusso, un segnale più forte viene inviato al computer. La linea curva, prima verso l’alto e poi verso il basso, in proporzione alla concentrazione del colorante giallo nella banda del campione. Questo crea un picco nel cromatogramma. Dopo che la banda gialla passa completamente fuori dalla cella del rivelatore, il livello del segnale ritorna alla linea di base; la cella di flusso ora ha, ancora una volta, solo fase mobile pura. Poiché la banda gialla si muove più velocemente, eluendo per prima dalla colonna, è il primo picco estratto.
Poco dopo, la banda rossa raggiunge la cella di flusso. Il segnale sale dalla linea di base quando la banda rossa entra per la prima volta nella cella, e il picco che rappresenta la banda rossa inizia ad essere tracciato. In questo diagramma, la banda rossa non è passata completamente attraverso la cella di flusso. Il diagramma mostra come sarebbero la banda rossa e il picco rosso se fermassimo il processo in questo momento. Poiché la maggior parte della banda rossa è passata attraverso la cella, la maggior parte del picco è stata disegnata, come mostrato dalla linea continua. Se potessimo ripartire, la banda rossa passerebbe completamente attraverso la cella di flusso e il picco rosso sarebbe completato. La banda blu, la più fortemente trattenuta, viaggia alla velocità più lenta ed eluisce dopo la banda rossa. La linea tratteggiata mostra come apparirebbe il cromatogramma completato se avessimo lasciato che la corsa continuasse fino alla sua conclusione. È interessante notare che la larghezza del picco blu sarà la più ampia perché la larghezza della banda blu dell’analita, mentre è più stretta sulla colonna, diventa la più ampia quando eluisce dalla colonna. Questo perché si muove più lentamente attraverso il letto di materiale da imballaggio cromatografico e richiede più tempo per essere eluito completamente. Poiché la fase mobile scorre continuamente a una velocità fissa, ciò significa che la banda blu si allarga ed è più diluita. Poiché il rivelatore risponde in proporzione alla concentrazione della banda, il picco blu è più basso in altezza, ma più largo.