Prima di tutto, mettiamo a fuoco le basi della citometria a flusso
Che cos’è la citometria a flusso?
La citometria a flusso è una tecnica utilizzata per rilevare e misurare le caratteristiche fisiche e chimiche di una popolazione di cellule o particelle. In questo processo, un campione contenente cellule o particelle è sospeso in un fluido e iniettato nello strumento del citometro a flusso.
Qual è lo scopo della citometria a flusso?
La citometria a flusso fornisce un metodo consolidato per identificare le cellule in soluzione ed è più comunemente usato per valutare il sangue periferico, il midollo osseo e altri fluidi del corpo. Gli studi di citometria a flusso sono utilizzati per identificare e quantificare le cellule immunitarie e caratterizzare i tumori ematologici maligni.1 Possono misurare:
- la dimensione delle cellule
- la granularità delle cellule
- il DNA totale
- nuova sintesi
- l’espressione genica del DNA
- la superficie dei recettori
- le proteine intracellulari proteine
- segnale transitorio
La capacità di eseguire queste misurazioni in un arco di tempo molto rapido è uno dei vantaggi chiave del processo citometrico a flusso. Si possono quantificare fino a tre o sei proprietà o componenti in un singolo campione, cellula per cellula, per circa 10.000 cellule, in meno di un minuto.
Strumentazione e metodologia della citometria a flusso
I citometri a flusso prendono una sospensione di singole cellule monodisperse e non raggruppate e le fanno scorrere una alla volta (file singolo) oltre un raggio laser dove ogni cellula passa attraverso il raggio laser, la luce diffusa e fluorescente e viene poi contata e ordinata o ulteriormente caratterizzata.
I tre componenti principali di un citometro a flusso sono la fluidica, l’ottica e l’elettronica.
- Il sistema fluidico di un citometro a flusso è responsabile del trasporto dei campioni dal tubo del campione alla cella a flusso, oltre il laser, ordinati e/o scartati.
- I componenti del sistema ottico includono fonti di luce di eccitazione, lenti e filtri ottici utilizzati per raccogliere e spostare lunghezze d’onda di luce intorno allo strumento e il sistema di rilevamento che genera la fotocorrente. La differenza di risposta della lunghezza d’onda nei dati aiuta ad analizzare il tipo di cellula.
- L’elettronica o la strumentazione del citometro a flusso.
Uno dei principi principali dell’utilizzo della citometria a flusso è la capacità di analizzare il ciclo cellulare completo e analizzare il contenuto del DNA nelle diverse fasi. Il monitoraggio degli eventi naturali del ciclo cellulare può fornire informazioni per la diagnosi della malattia e la prognosi della terapia. Le diverse fasi del ciclo cellulare possono rivelare un contenuto alterato di DNA e altre anomalie che indicano la presenza di un tumore o segni di morte cellulare avanzata. Le espressioni dei dati sono memorizzate in un computer tramite un software specializzato in citometria a flusso associato all’uso dello strumento scelto durante il periodo di analisi. I dati della citometria a flusso sono tipicamente riportati in due modi distinti: un istogramma e/o un dot plot2.
| Fase G1: | RNA, ribosomi e proteine vengono sintetizzati |
| Fase S: | DNA viene replicato |
| Fase G2: | Rappresenta la fase tra la sintesi del DNA e la mitosi |
| Fase M: | le cellule sono divise in due cellule figlie |
FACS
Fluorescence-activated cell sorting (FACS) è un tipo specializzato di citometria a flusso. Fornisce un metodo per ordinare una miscela eterogenea di cellule biologiche in due o più contenitori, una cellula alla volta, sulla base delle caratteristiche specifiche di diffusione della luce e di fluorescenza di ogni cellula. È diverso dalla citometria a flusso nel modo in cui fornisce una caratterizzazione unica rispetto al semplice conteggio e smistamento delle cellule. È comune che i due principi lavorino in un processo di tipo co-caratterizzazione per offrire un approccio qualitativo e quantitativo completo all’analisi citometrica a flusso.
Il processo citometrico a flusso:
La sospensione cellulare è trascinata al centro di un flusso stretto e rapido di liquido. Il flusso è organizzato in modo che ci sia una grande separazione tra le cellule rispetto al loro diametro. Un meccanismo vibrante costringe il flusso di cellule a rompersi in singole goccioline. Il sistema è regolato in modo che ci sia una bassa probabilità di più di una cella per gocciolina. Appena prima che il flusso si rompa in goccioline, il flusso passa attraverso una stazione di misurazione della fluorescenza dove viene misurato il carattere fluorescente di interesse di ogni cellula.
Un anello di carica elettrica è posto proprio nel punto in cui il flusso si rompe in goccioline. Una carica è posta sull’anello in base alla misurazione dell’intensità di fluorescenza immediatamente precedente, e la carica opposta è intrappolata sulla gocciolina quando si rompe dal flusso. Le gocce caricate cadono poi attraverso un sistema di deflessione elettrostatica che devia le gocce in contenitori basati sulla loro carica. In alcuni sistemi, la carica viene applicata direttamente al flusso, e la gocciolina che si stacca conserva la carica dello stesso segno del flusso. Il flusso viene quindi riportato alla neutralità dopo la rottura della gocciolina.
Un anticorpo specifico per una particolare proteina della superficie cellulare è associato a una molecola fluorescente e quindi aggiunto a una miscela di cellule. Il passo successivo è il processo di fluorescenza, mentre le cellule specifiche passano attraverso un raggio laser e vengono monitorate. Alle goccioline contenenti una singola cellula viene assegnata una carica positiva o negativa, in base al fatto che la cellula abbia un anticorpo con tag fluorescente. Le goccioline contenenti una singola cellula vengono quindi rilevate da un campo elettrico e deviate in tubi di raccolta separati in base alla loro carica, permettendo una facile separazione delle cellule marcate con l’anticorpo fluorescente.
Citometria a flusso multicolore
La citometria a flusso multicolore è una tecnica utile quando si esaminano popolazioni miste di cellule, come le cellule del sangue e dei tessuti in campioni umani e animali. Generalmente, un tipo specifico di cellule viene marcato con un colorante fluorescente (marcatori) come il fluoroforo o lo ioduro di propidio. La capacità di utilizzare più marcatori fluorescenti simultaneamente permette l’identificazione di più tipi di cellule, così come marcatori funzionali che caratterizzano ulteriormente ogni campione. Esistono strumenti specializzati in grado di misurare più di 12 colori 3,4 . Questi coloranti e marcatori fluorescenti sono misurati da diverse lunghezze d’onda della luce emessa dal laser per ordinare per tipo di cella individuale. Ogni marcatore è eccitato ad una specifica lunghezza d’onda della luce per differenziarli quando si usano più marcatori.
Adattare un tipico pannello di colorazione da 4 a 6 colori a più di 12 colori non è semplicemente una questione di “plug and play”, deve essere affrontato in modo sistematico per ottenere parametri di successo in un pannello di colorazione. I principi di base della progettazione del pannello funzionano meglio se si basano sulla ricerca precedente all’uso. In altre parole, la preparazione è la chiave anche dall’inizio del processo di riferimento all’indice di colorazione per quanto riguarda la corrispondenza efficace dei fluorocromi in base alla luminosità5.
Citometria a flusso Tip:
Mettere in qualche tempo per capire le sottili sfumature del vostro citometro a flusso prima di progettare il vostro pannello di anticorpi primari. Concentratevi su dove possono essere fatte le misurazioni più sensibili sul sistema. C’è molto di più della semplice intensità di fluorescenza.
Considera la sostituzione con un fluorocromo meno luminoso per evitare errori di canale.
Applicazioni comuni della metodologia della citometria a flusso
La citometria a flusso è una componente integrale in diverse aree cliniche, tra cui la diagnosi, i piani di trattamento e le malattie sistemiche statiche o progressive. Man mano che impariamo di più sulle applicazioni pratiche per l’uso della citometria a flusso, la base di conoscenze viene ulteriormente ampliata. Ora, più che mai, i ricercatori sono molto entusiasti di poter imparare di più sulle complessità di alcune malattie e condizioni. Ha portato ad un rapido cambiamento nella diagnosi di modelli e drasticamente alterato approcci medici per il trattamento di malattie come il cancro6.
La metodologia della citometria a flusso è spesso coinvolta con altri modelli di test completi come l’esame morfologico. In molti casi, neoplasie ematologiche raffigurano specifici cambiamenti morfologici, e citometria a flusso fornisce una maggiore specificità e aiuta i patologi espandere su anomalie del tessuto o altre malattie avanzate. La citometria a flusso, in alcuni casi, può predeterminare la recidiva del cancro prima che i cambiamenti morfologici vengano rilevati7.
Alcune delle principali applicazioni utilizzate nell’ambito delle moderne impostazioni cliniche sia terapeutiche che orientate alla ricerca includono:
- Espressione delle proteine in tutta la cellula, anche nel nucleo
- Modifiche post-traslazionali delle proteine, incluse le proteine scisse e fosforilate
- RNA, inclusi i miRNA, e trascrizioni di mRNA
- Stato di salute della cellula – individuazione di cellule apoptotiche o morte cellulare
- Stato del ciclo cellulare – fornisce un potente strumento per valutare le cellule in fase G0/G1 rispetto alla fase S, G2 o poliploidia, compresa l’analisi della proliferazione e dell’attivazione cellulare
- Identificazione e caratterizzazione di sottoinsiemi distinti di cellule all’interno di un campione eterogeneo, compresa la distinzione delle cellule di memoria effettrici centrali dalle cellule T esaurite o dalle cellule T regolatorie
Concludendo
I principi di base della citometria a flusso sono cambiati poco negli ultimi dieci anni, ma le applicazioni di questa tecnologia si sono evolute moltissimo. Le basi della citometria a flusso sono state coerenti con la sua funzione primaria, che è quella di interrogare le singole cellule o particelle in un flusso con un laser mentre le cellule si muovono oltre un set di rivelatori stazionari. Sempre più spesso, più colori di fluorescenza vengono rilevati dai citometri, insieme all’ordinamento ad alta velocità e alla funzione analitica8.
Citometria a flusso gioca un ruolo fondamentale nella ricerca di scienze molecolari e continua ad evolversi ad un ritmo rapido. Ci sono diversi citometri a flusso commerciale sul mercato. Essi tendono ad operare sullo stesso principio di base, ma ci sono importanti differenze nel loro design e nei concetti di allineamento e integrazione di altri componenti.
Presto all’orizzonte, una strumentazione 3D sarà introdotta e incorporata in uno strumento ibrido proprietario prodotto da NanoCellect Biomedical, il WOLF Cell Sorter. Possiamo anche aspettarci lo sviluppo di sonde fluorescenti a spettro stretto, l’integrazione di tecniche biologiche molecolari con la citometria a flusso, e la valutazione di marcatori privi di cellule come le citochine saranno componenti chiave nella continua evoluzione dell’analisi della citometria a flusso e della tecnologia dei test cellulari.
Fonti:
1 http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221
2 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/
3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959
4 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26
5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250
6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/
7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/
8 https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543