A sikeres automatizált DNS-szekvenálás egyik legfontosabb tényezője a megfelelő primertervezés. Ez a dokumentum ismerteti a folyamat lépéseit és az elkerülendő főbb buktatókat.
**** Számítógép használata a primerek tervezéséhez ****
A primerek tervezése során erősen javasoljuk a számítógép használatát, hogy ellenőrizni lehessen bizonyos végzetes tervezési hibákat. Számos program képes ezt az elemzést elvégezni. Keresse például a “Primer3”-at a világhálón.
Egy pár alapfogalom: Ha összezavarodtak a szálak és a primerek orientációja miatt, olvassa el ezt.
A szekvenáló primereknek képesnek kell lenniük arra, hogy a cél-DNS-hez egy kiszámítható helyen és egy kiszámítható szálon kapcsolódjanak. Továbbá képesnek kell lenniük a Taq DNS-polimerázzal történő hosszabbításra.
Néhányan zavarban vannak azzal kapcsolatban, hogyan kell megvizsgálni egy DNS-szekvenciát a megfelelő primer-szekvencia kiválasztásához. Íme néhány dolog, amit a kezdőknek érdemes megjegyezniük:
- A szekvenciákat mindig 5′-től 3′-ig írják. Ez magában foglalja a sablon DNS szekvenciáját (ha ismert), a vektor DNS szekvenciáját, amelybe beillesztjük, és a javasolt primerek szekvenciáját. Soha ne írjon primer szekvenciát fordítva, különben csak összezavarja magát és másokat.
- A polimeráz mindig a primer 3′ végét hosszabbítja meg, és a leolvasott szekvencia ugyanaz a szál (sense vagy anti-sense) lesz, mint maga a primer.
- Ha tehát olyan primer szekvenciát választunk, amelyet a forrásszekvenciánkban (például a vektorban) olvashatunk, akkor a kapott szekvencia a primer jobb (3′) végétől fog kinyúlni.
- Fordítva, ha a “forrásszekvenciánkkal” ellentétes szálról választunk primert, akkor a kapott szekvencia balra fog olvasni.
Itt van néhány példa:
Tegyük fel, hogy van egy vektorunk, amelynek a Multiple Cloning Site (a “MCS”) körül a következő szekvencia van:
TTAGCTACTGCTTGATGCTAGTACTACATCTAGTGCTAGATGGATCCGAATTCGCTGATGCTCATATGTTAATAAAGAC ^ ^ | | BamHI EcoRI
Ha a BamHI és EcoRI helyek közé klónozta a kívánt DNS-t, akkor a ‘CTTGATGCTAGTAGTACTACTACATC’ primerrel (ne feledjük – ez 5′-től 3′-ig van írva) szekvenálhat, és a következő szekvenciát kapja a magból:
TAGTGCTAGATGAATTCGCTGATGC...(etc.)
Mi van, ha a másik szálról – Eco-tól Bam-ig – akar szekvenciát? Ebben az esetben ki kell választania valamilyen szekvenciát a jobb oldalon, majd fordítottan komplementálnia kell, mielőtt lekérné az oligót. Néhány szekvencia kiválasztása a fenti ábráról:
CTGATGCTCATATGTTAATA
Ez NEM a primer szekvencia – szó szerint a fenti szekvenciából van kimásolva. Valójában, ha ezt a szekvenciát használná primernek, a szekvenálás jobbra haladna, az inzertjétől távolodva. Ehelyett fordítottan egészítsük ki ezt a szekvenciát:
TATTAACATATGAGCATCAG
Most ennek az ellenkező szál szekvenciáját kell eredményeznie:
CGAATTCATCTAGCACTA...(etc.)
Egy kis apróbetűs rész: A szekvenálás csak ritkán mutatja meg ténylegesen a primer után közvetlenül következő nukleotidokat. A fenti példákban némi didaktikai szabadságot vettem igénybe.
Még több haladó fogalom: How to Design a Primer that Works.
Általában egy kis mennyiségű ismert szekvenciával kezdünk, amelyet ki szeretnénk bővíteni. A következőképpen kell eljárni:
I. Csak pontos szekvenciaadatokból tervezzen primereket. Az automatizált szekvenálás (és valójában bármilyen szekvenálás) véges valószínűséggel hibákat produkál. A primertől túl messze kapott szekvenciát megkérdőjelezhetőnek kell tekinteni. Annak meghatározásához, hogy mi a “túl messze”, erősen javasoljuk ügyfeleinknek, hogy olvassák el a Szekvenálási kromatogramok értelmezése című emlékeztetőt, amely leírja, hogyan kell értékelni az ABI szekvenálókból nyert adatok érvényességét. Válasszon ki egy olyan régiót a primer elhelyezéséhez, ahol a szekvenciahiba lehetősége alacsony. II. Korlátozza a keresést azokra a régiókra, amelyek a legjobban tükrözik a céljait.
Elképzelhető, hogy a kapott szekvenciaadatok maximalizálása érdekli, vagy csak a templát egy nagyon specifikus helyén kell vizsgálnia a szekvenciát. Az ilyen igények nagyon eltérő primerelhelyezéseket diktálnak.
- A kapott szekvencia maximalizálása a hibalehetőségek minimalizálása mellett:
Általában a primert olyan messzire kell tervezni a 3′-ig, amennyire csak lehet, mindaddig, amíg bízik a szekvencia pontosságában, amelyből a primer származik. Az ellentétes szálakon lévő primereket a lehető legjobban eltolva kell elhelyezni. - Célzott szekvenálás egy adott régióra:
A primert úgy kell elhelyezni, hogy a kívánt szekvencia a kromatogram legpontosabb régiójába essen. A szekvenciaadatok gyakran a primertől 80-150 nukleotid távolságra a legpontosabbak. Ne számítson arra, hogy a primertől kevesebb mint 50 nukleotid távolságra vagy 300 nt-nél távolabb jó szekvenciát lát (bár gyakran kapunk közvetlenül a primer után kezdődő szekvenciát, és gyakran 700 nt pontos szekvenciát kapunk vissza).
III. Lokalizáljuk a jelölt primereket:
A potenciális szekvenáló primerek azonosítása, amelyek a ciklusos szekvenáláshoz megfelelő körülmények között stabil bázispárosodást hoznak létre a templát-DNS-szel. Erősen javasolt, hogy ennél a lépésnél számítógépet használjon. Javasolt primerek jellemzői:
- A primerek hossza 18 és 30 nt között legyen, az optimális 20-25 nt. (Bár voltak már sikereink 30-nál hosszabb és 18-nál rövidebb primerekkel is).
- 40-60%-os G-C tartalom a kívánatos.
- A Tm-nek 55 C és 75 C között kell lennie. Figyelem: a régi “4 fok minden G-C-re, 2 fok minden A-T-re” szabály rosszul működik, különösen a 20-nál rövidebb vagy 25 nt-nél hosszabb oligók esetében. Ehelyett próbáljuk ki:
Tm = 81.5 + 16.6* log + 0.41*(%GC) - 675/length - 0.65*(%formamide) - (%mismatch)
Van egy webes Tm-kalkulátor a http://www.rnature.com/oligonucleotide.html címen.
IV. Dobja el azokat a jelölt primereket, amelyek nemkívánatos önhibridizációt mutatnak.
Az önhibridizációra képes primerek nem állnak rendelkezésre a templáthibridizációhoz. Általában kerülje az olyan primereket, amelyek 4 vagy több egymást követő kötést tudnak kialakítani önmagukkal, vagy összesen 8 vagy több kötést. Példa egy marginálisan problémás primerre:
5'-ACGATTCATCGGACAAAGC-3' |||| |||| 3'-CGAAACAGGCTACTTAGCA-5'
Ez az oligo lényegében stabil dimert képez önmagával, két helyen négy egymást követő kötéssel és összesen nyolc szálközi kötéssel.
A 3′ végű primerek, amelyek még átmenetileg is hibridizálnak, a polimeráz hatására megnyúlnak, így tönkreteszik a primert és hamis sávokat generálnak. Legyünk valamivel szigorúbbak a 3′ dimerek elkerülése érdekében. Például a következő primer öndimerizálódik tökéletes 3′ hibridizációval önmagán:
5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3' |||||||||||||| 3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'
A fenti oligo elég rossz, és szinte garantáltan problémákat okoz. Vegye figyelembe, hogy a polimeráz a szekvenálási reakció során meghosszabbítja a 3′ véget, ami nagyon erős ACTATGC szekvenciát eredményez. Ezek a sávok a “valódi” adatok elején hatalmas csúcsokként fognak megjelenni, elfedve a helyes szekvenciát. A legtöbb primertervezési program helyesen észleli az ilyen öndimerizáló primereket, és figyelmezteti Önt, hogy kerülje el őket.
Megjegyzendő azonban, hogy egyetlen számítógépes program vagy hüvelykujjszabályos értékelés sem képes pontosan megjósolni egy primer sikerét vagy sikertelenségét. Egy marginálisnak tűnő primer jól teljesíthet, míg egy másik, hibátlannak tűnő primer egyáltalán nem működhet. Kerülje el a nyilvánvaló problémákat, tervezze meg a lehető legjobb primereket, de szorult helyzetben, ha kevés lehetősége van, csak próbáljon ki néhány jelölt primert, függetlenül a lehetséges hibáktól.
V. Ellenőrizze a primer helyspecifikusságát. Végezzen szekvencia-homológiakeresést (pl. dot-plot homológia-összehasonlítás) az összes ismert sablonszekvencián, hogy ellenőrizze az alternatív primerhelyeket. Vessen el minden olyan primert, amely “jelentős” hajlamot mutat az ilyen helyekhez való kötődésre. Csak durva iránymutatást tudunk adni arra vonatkozóan, hogy mi számít “jelentősnek”. Kerüljük azokat a primereket, amelyekben olyan alternatív helyek vannak jelen, amelyek (1) több mint 90%-os homológiát mutatnak az elsődleges helyhez, vagy (2) több mint 7 egymást követő homológ nukleotidot tartalmaznak a 3′ végén, vagy (3) a mennyiségük több mint 5-ször nagyobb, mint a tervezett primerhelyé. VI. Választás a jelölt primerek közül.
Ha ezen a ponton több jelölt primer áll rendelkezésünkre, akkor kiválaszthatunk egyet vagy néhányat, amelyek 3′ végén A-T-ben gazdagabbak. Ezek egyes kutatók szerint általában kissé specifikusabb hatásúak. Lehet, hogy egynél több primert szeretne használni, ezzel maximalizálva a siker valószínűségét.
Ha nincs olyan jelöltje, amely túlélte volna a fenti kritériumokat, akkor kénytelen lehet enyhíteni a kiválasztási követelmények szigorán. Végső soron a jó primer próbája csak a használatában rejlik, és ezekkel a leegyszerűsítő szabályokkal nem lehet pontosan megjósolni.
Ha szerencséje van, akkor azonban rengeteg lehetősége van a primerek kiválasztására. Egy szekvencia-összeállítási projekthez tervezzen több primert, mint amennyire úgy gondolja, hogy valóban szüksége van, hogy ha a szekvencia nem olyan hosszú, mint remélte, akkor is elegendő átfedő adatot kapjon ahhoz, hogy biztosítsa a jó szekvencia-konszenzust. Javasoljuk, hogy a jobb megerősítés érdekében mindkét szekvenciát szekvenálja. Az egyik szálon a primereket 500-700 nt távolságra helyezze el egymástól (a rövidebb távolság biztonságosabb!). Az ellenkező szálon a primereket az első szál primereitől lépcsőzetesen, az alábbi ábrának megfelelően helyezze el:
