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DNEs DANS LA REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE

Les DNEs peuvent également apparaître dans le contexte de la régulation transcriptionnelle. Par exemple, un DNE peut être obtenu en retirant le domaine de transactivation d’un TF modulaire, ne laissant que le domaine de liaison à l’ADN. Ce facteur tronqué peut se comporter comme un inhibiteur compétitif de la transcription. Ce phénomène est connu dans la nature. Par exemple, la protéine C/EBP chez les mammifères est exprimée sous la forme de trois polypeptides alternatifs. Les polypeptides les plus longs contiennent un domaine d’activation transcriptionnelle N-terminal, tandis que la forme courte en est dépourvue. Comme les isoformes longues et courtes s’assemblent en homo- et hétérodimères, cette dernière se comporte comme un DN naturel (Zahnow et al., 1997). C’est également le cas des Stats 5 et 6 chez les vertébrés, qui sont capables de se dimériser. Leur traitement protéolytique en réponse à des signaux physiologiques conduit à l’élimination du domaine d’activation C-terminal et les transforme en inhibiteurs puissants qui régulent négativement la transduction du signal (Nakajima et al., 2003). Chez les plantes, un grand nombre de protéines MYB fonctionnent comme régulateurs transcriptionnels. Chez Arabidopsis, les protéines contenant une seule répétition de liaison à l’ADN MYB mais dépourvues du domaine de transactivation sont impliquées dans la spécification de certains aspects du destin des cellules épidermiques. Ces protéines interagissent avec d’autres TF, y compris les protéines bHLH, et en raison de l’absence d’un domaine transactivateur, elles se comportent comme des DN et des trans-DN en formant des complexes inactifs (Ramsay et Glover, 2005).

La suppression du domaine de liaison à l’ADN peut également conduire à des DNE. Cela se produit dans les TFs bHLH. Comme indiqué ci-dessus, le gène Id-1 code pour un inhibiteur DN naturel de cette famille de TFs. Les protéines bHLH complètes (avec des domaines de liaison à l’ADN et de dimérisation) peuvent être exprimées de manière constitutive. Cependant, l’expression régulée de Id-1, contenant uniquement le domaine de dimérisation, impose une régulation de l’activité des protéines bHLH (Sun, 1994). Un phénomène similaire est également attendu chez les plantes. Par exemple, le génome d’Arabidopsis code ∼120 protéines bHLH prédites pour lier l’ADN et 27 protéines avec une région moins basique que celle requise pour la liaison (Toledo-Ortiz et al., 2003). Ces HLH non liants à l’ADN pourraient fonctionner comme les protéines Id animales, comme régulateurs négatifs des protéines bHLH par la formation d’hétérodimères incapables de lier l’ADN (Toledo-Ortiz et al., 2003). Des effets similaires sont attendus dans les TFs appartenant à la famille basic domain/leucine zipper (bZIP), qui contiennent un motif de liaison à l’ADN de base, un domaine de dimérisation leucine zipper, et des domaines de transactivation. Arabidopsis code pour 67 protéines bZIP, qui sont toutes prédites pour fonctionner en tant qu’homo- et/ou hétérodimères (Deppmann et al., 2004). Certaines d’entre elles sont très petites et peuvent manquer de domaines d’activation. Dans un exemple classique chez les plantes, Fukazawa et al. (2000) ont élucidé la fonction du TF bZIP REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) dans la signalisation de la gibbérelline grâce à l’utilisation d’une forme DN de RSG, dépourvue d’un domaine d’activation transcriptionnelle et agissant donc pour réprimer la fonction de la protéine de type sauvage lorsqu’elle est exprimée dans le tabac transgénique. De plus, en accord avec ce qui a été dit dans la section traitant des trans-DN par surexpression, les complexes de transcription ADN-protéine sont également sensibles à l’équilibre du dosage des gènes (Birchler et al., 2001 ; Veitia, 2002). Les altérations de cet équilibre par une expression diminuée ou augmentée d’une TF par rapport aux autres impliquées dans le même complexe peuvent induire des phénotypes anormaux.

Un modèle simple d’activation transcriptionnelle peut être utilisé pour explorer certaines subtilités quantitatives des mutations DN dans ce contexte. Des études sur les systèmes viraux et la drosophile ont montré que la transcription présente souvent une relation sigmoïdale par rapport à la concentration d’une TF. Dans le cas d’un système répondant à un seul type d’activateur (A), cette réponse sigmoïdale peut être disséquée en deux composantes principales : la liaison coopérative de A au promoteur (p) d’un gène cible et la synergie (Figure 6). La synergie est le résultat des interactions concertées entre les molécules de A déjà liées au promoteur et la machinerie transcriptionnelle (Carey, 1998 ; Veitia, 2003).

Envisageons un promoteur, p, contenant deux sites de liaison pour A. Les mêmes sites de liaison sont également reconnus par la variante a, qui pourrait agir comme un inhibiteur compétitif. Nous supposons qu’il peut y avoir une coopérativité lors de l’interaction entre les molécules A avec le promoteur. Il pourrait en être de même pour les interactions entre A, a et le promoteur. Une source possible de coopérativité a été mentionnée ci-dessus (c’est-à-dire que A a tendance à former des dimères en solution, mais cela est renforcé pendant la liaison à l’ADN). Une autre possibilité est que les monomères sont incapables d’interagir en solution et que l’interaction d’un monomère avec l’ADN entraîne un changement allostérique qui augmente l’affinité de A lié pour un monomère entrant. Il est également possible, bien que moins probable, qu’il n’y ait pas d’interactions A-A et que la liaison d’un monomère à l’ADN entraîne une modification du site voisin qui augmente son affinité pour un nouveau monomère entrant. Quoi qu’il en soit, la coopérativité signifie que la réaction pA + A = pAA se produit plus facilement que p + A = pA.

En raison de l’existence d’une synergie, l’espèce moléculaire qui contribue le plus à la transcription est le promoteur occupé par deux molécules d’activateur : pAA. Cela signifie également que si la constante d’affinité pour l’association entre le complexe pA et la polymérase est KpolA, le K pour l’association de pAA et de la polymérase sera bien supérieur à 2K (de l’ordre de K2polA ; voir Zlotnick, 1994). Pour tenir compte de l’activité de transactivation partielle dans ce modèle, nous utiliserons Kpola (pour la réaction pa + pol) et Kpola2 (pour paa + pol). Sous ces hypothèses, une équation pour la réponse transcriptionnelle (TR) en fonction de la concentration de A (et a) peut être dérivée comme décrit par Veitia (2003) et Veitia et Nijhout (2006) (voir Supplemental Materials online).

Avec une équation assez simple en main, plusieurs conditions peuvent être explorées : (1) la situation sauvage A/A, (2) lorsqu’il y a un allèle manquant (A/-), et (3) lorsqu’il y a coexpression de A et d’une version tronquée a dépourvue du domaine de transactivation. Dans ce dernier cas, on peut distinguer deux situations différentes : (3a) lorsque la mutation de a abolit la coopérativité ou (3b) lorsque A et a interagissent de manière coopérative. Enfin, nous pouvons également explorer une situation (4) où la capacité de transactivation de a est normale et la coopérativité absente, et (5) où la coopérativité est normale mais la capacité de transactivation est partielle.

La figure 7 montre qu’un TR, relatif à la sortie maximale du promoteur versus présente une relation sigmoïdale, comprise entre 0 et 1. La saturation reflète la réponse maximale du système, mais cela n’implique pas que le promoteur fonctionne uniquement à saturation. Selon la figure, et en général, les valeurs de la courbe pour l’hétérozygote A/- en tout point sont inférieures à celles de A/A (pour chaque valeur de la concentration relative, l’hétérozygote A/- a deux fois moins en termes absolus que le type sauvage). Il est intéressant de noter qu’à de faibles concentrations relatives de A, le décalage entre les courbes est très prononcé Y(A/-) est ∼25% de Y(A/A). Cependant, comme on pouvait s’y attendre intuitivement, pour des valeurs élevées de A, la saturation est également atteinte en A/-. Si ce système était normalement fonctionnel à de faibles concentrations de A, un individu A/- présenterait un phénotype haploinsuffisant typique.

Que se passe-t-il chez A/a lorsque a manque du domaine de transactivation en l’absence de coopérativité ? Selon la définition classique de la DN, la courbe est plus basse en tout point que celle de A/-. Cependant, il y a une tendance à atteindre la saturation avec des concentrations croissantes de A et a. En fait, A a tendance à occuper préférentiellement le promoteur car il assure des interactions coopératives avec les monomères A entrants. Cependant, il est évident que la reconnaissance du promoteur à faible concentration de protéines se produit moins facilement dans la condition A/a que dans la condition de type sauvage. En pratique, un monomère tronqué incapable d’assurer des interactions coopératives conduira à un DNE faible. La situation est complètement différente à l’autre extrême, lorsque la coopérativité entre A et a est totalement maintenue. En effet, le plateau de la courbe pour A/a est atteint à TR = 0,25. Ceci est attendu car pAA, qui dirige la transcription (c’est-à-dire que les contributions de pAa et paa sont négligeables), ne représente que 25% des espèces de promoteurs occupés à saturation.

Un exemple potentiel est fourni par une mutation artificielle dans le TF FOXL2. Cette TF réprime le promoteur du gène régulateur aigu stéroïdogène humain, qui contient plusieurs sites de liaison putatifs. Une version de FOXL2 contenant le domaine de liaison à l’ADN mais dépourvue du domaine C-terminal est capable d’induire un DNE qui nuit à la répression transcriptionnelle. Cependant, cet effet n’est obtenu que lorsque la version DN est beaucoup plus fortement exprimée (5× et 10×) que la protéine de type sauvage (Pisarska et al., 2004). Comme souligné ci-dessus, ceci est peut être dû à l’absence d’interactions coopératives entre les molécules FOXL2 sur ce promoteur.

Un exemple plus parlant est fourni dans la figure 8, qui représente la réponse de deux promoteurs différents contenant un ou deux sites de liaison pour le TF PTX2a et sa version DN, comme décrit précédemment (Saadi et al, 2003. À de faibles quantités d’ADN de transfection (0,05 μg dans la figure 8), la réponse du promoteur avec deux sites est plus de deux fois plus forte (c’est-à-dire 3×) que la réponse du promoteur avec un seul site. Il s’agit de la signature combinée de la coopérativité et de la synergie. De plus, à des concentrations élevées de constructions transfectantes WT+DN, le TR du promoteur avec deux sites de liaison est ∼25% de la réponse du type sauvage seul. Ceci est attendu car à une concentration élevée de protéines, les dimères peuvent être préassemblés avant même d’atteindre l’ADN cible. Dans ce cas, seulement 25% des dimères seront normaux. La chute du TR est moins dramatique pour le promoteur avec un seul site de liaison (50% attendu). D’un point de vue pratique, pour éviter de négliger un DNE potentiel dans les expériences in vitro, de faibles quantités des constructions WT+DN doivent être transfectées avec un excès de promoteur rapporteur pour éviter sa saturation par la forme sauvage. Plus généralement, des courbes de réponse pour différentes concentrations de TF doivent être fournies pour de telles expériences de transfection.

Comme prévu intuitivement, lorsque la capacité de transactivation de a est normale et la coopérativité absente, un DNE très léger apparaît qui conduit à un comportement proche d’un allèle nul à l’état hétérozygote. L’isolement de ce type de mutant est possible en utilisant un élégant crible génétique de levure décrit par Burz et Hanes (2001). Une mutation peut affecter les niveaux de coopérativité de façon moins dramatique. Un cas intéressant se présente lorsque la coopérativité chute à environ un dixième du niveau normal (selon les paramètres qui sous-tendent les résultats présentés dans la figure 7) et que la capacité de transactivation est normale. Dans ces conditions, la variante a se comporte comme un allèle hypomorphe chez l’homozygote a/a et comme un allèle nul chez A/a (c’est-à-dire A/a = A/- ; données non présentées). Cela souligne à nouveau l’absence de frontières distinctes entre les allèles hypomorphes, DN et nuls.

Lorsqu’il y a une transactivation résiduelle (c’est-à-dire 1<Kpola<KpolA) et que la coopérativité est normale, le plateau chez A/a n’est pas atteint à TR = 1 mais à un niveau inférieur. Des allèles avec une capacité d’activation partielle peuvent être facilement produits dans certains cas. Le paradigme est fourni par le TF de levure Gal4, qui contient deux régions activatrices (ARI et ARII) impliquées dans le recrutement de la machinerie transcriptionnelle. Des délétions dans la région acide ARII conduisent à une diminution de la capacité de transactivation (Ptashne et Gann, 2002 ; Ptashne, 2007). Une combinaison d’un tel allèle avec le Gal4 de type sauvage devrait se comporter comme décrit. Comme le montre la figure 7, la courbe pour A/a croise celle de A/-. Ainsi, le même allèle peut être hypomorphe si le système fonctionne à de faibles niveaux de saturation (avant que les courbes ne se croisent) et peut être DN en termes moléculaires à des concentrations de protéines plus élevées. Une explication intuitive peut être fournie. Considérons, par exemple, une protéine a qui interagit avec la polymérase avec, disons, 90% de la force de type sauvage. Pour une gamme de concentrations, l’hétérozygote A/a aura tendance à se comporter comme A/A. Cependant, à saturation, seulement 25% de l’espèce du promoteur sera pAA, qui interagit avec la polymérase avec une force maximale. En revanche, chez un hétérozygote A/-, à faible concentration de protéines, il est plus difficile d’occuper le promoteur, alors qu’à saturation, 100 % de l’espèce promotrice sera pAA. Ainsi, les courbes pour A/a et A/- doivent se croiser à un moment donné.

Tous les promoteurs cibles d’une cellule ne sont pas également sensibles à une TF DN. Lorsqu’il existe une forte coopérativité et une synergie, la sensibilité d’un promoteur à une protéine DN doit dépendre du nombre de sites de liaison sur l’ADN. Le cas le plus simple à visualiser est celui où a est dépourvu de domaine de transactivation mais interagit de manière coopérative avec A. Si l’espèce de promoteur qui dirige la transcription est celle qui est entièrement chargée en protéine de type sauvage, comme on l’a supposé ci-dessus, le TR maximal peut être calculé en utilisant la formule (des probabilités binomiales) donnée dans les Matériaux supplémentaires en ligne. Pour un promoteur avec deux sites de liaison identiques, le TR maximal sera de 25 % par rapport à la production de la condition de type sauvage : pour trois sites de liaison, 12,5 %, et pour quatre sites de liaison, 6,25 % (lorsque A et a sont exprimés à des concentrations équimolaires). Pour des situations plus complexes, la réponse n’est pas intuitive et nécessite l’analyse de modèles non traités ici.