Le laboratoire Berg

Ce guide est adapté du programme de biologie générale pour les professeurs de sciences du département de biochimie et de biophysique moléculaire de l’université d’Arizona : Drosophila Melanogaster et génétique mendélienne, par Pete Geiger.

Une introduction à Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster est une petite mouche commune que l’on trouve près des fruits non mûrs et pourris. Elle est utilisée depuis plus d’un siècle pour étudier la génétique et le comportement. Thomas Hunt Morgan était le biologiste le plus éminent à étudier la drosophile au début des années 1900. Il a été le premier à découvrir la liaison sexuelle et la recombinaison génétique, ce qui a placé la petite mouche au premier plan de la recherche génétique. En raison de sa petite taille, de sa facilité de culture et de son temps de génération court, les généticiens ont utilisé la drosophile depuis lors.

Les mouches à fruits sont facilement obtenues dans la nature et de nombreuses entreprises de sciences biologiques possèdent une variété de mutations différentes. En outre, ces entreprises vendent tout équipement nécessaire à la culture des mouches. Les coûts sont relativement faibles et la plupart des équipements peuvent être utilisés année après année. Il existe une variété d’exercices de laboratoire que l’on pourrait acheter, bien que la nécessité de le faire soit discutable.

Pourquoi utiliser la drosophile?

Les enseignants devraient utiliser les mouches à fruits pour les études génétiques au secondaire pour plusieurs raisons:
1. Elles sont petites et faciles à manipuler.
2. Elles peuvent être facilement anesthésiées et manipulées individuellement avec un équipement non sophistiqué.
3. Elles sont sexuellement dimorphiques (les mâles et les femelles sont différents), ce qui rend assez facile la différenciation des sexes.
4. Les mouches des fruits vierges sont physiquement distinctes des adultes matures, ce qui facilite l’obtention de mâles et de femelles vierges pour les croisements génétiques.
5. Les mouches ont un temps de génération court (10-12 jours) et se comportent bien à température ambiante.
6. Le soin et la culture des mouches des fruits nécessitent peu d’équipement, sont peu coûteux et utilisent peu d’espace, même pour les grandes cultures.

En utilisant la drosophile, les élèves pourront :
1. Comprendre la génétique mendélienne et l’héritage des traits
2. Tirer des conclusions des modèles d’hérédité à partir des données obtenues
3. Construire des pièges pour attraper des populations sauvages de D. melanogaster
4. Acquérir une compréhension du cycle de vie de D. melanogaster, un insecte qui présente une métamorphose complète
5. Construire des croisements de mouches capturées et connues de type sauvage et muté
6. Apprendre des techniques pour manipuler les mouches, les sexer et tenir un journal concis
7. Apprendre des techniques de culture pour garder les mouches en bonne santé
8. Réaliser que de nombreuses expériences scientifiques ne peuvent pas être menées et conclues en une ou deux séances de laboratoire

Normes nationales couvertes dans ces leçons:
Contenu:
1. Les organismes ont besoin d’un ensemble d’instructions pour spécifier les traits (hérédité)
2. L’information héréditaire est située dans les gènes.
3. Des combinaisons de traits peuvent décrire les caractéristiques d’un organisme.

Buts des élèves:
1. Identifier les questions et les concepts qui guident les enquêtes scientifiques
2. Concevoir et mener des enquêtes scientifiques
3. Formuler et réviser des explications et des modèles scientifiques en utilisant la logique et les preuves
4. Communiquer et défendre un argument scientifique

La génétique de la drosophile est bien documentée et plusieurs sites Web du domaine public présentent le génome complet annoté. Par conséquent, les enseignants ou les étudiants qui souhaitent voir où se produisent leurs mutations ont une référence prête à l’emploi.

Puisque la drosophile a été si largement utilisée en génétique, il existe de nombreux types différents de mutations disponibles à l’achat. En outre, l’étudiant attentif peut trouver des mutations au sein de ses propres cultures sauvages puisque, en raison d’un temps de génération court, les mutations sont relativement courantes par rapport aux autres espèces animales.
Classification
Domaine : Eukarya
Règne : Animalia
Phylum : Arthropoda
Classe : Insecta
Ordre : Diptères
Famille : Drosophilidae
Genus : Drosophila (« amoureux de la rosée »)
Espèce : melanogaster (« boyau sombre »)
Cycle de vie de Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster présente un métamorphisme complet, ce qui signifie que le cycle de vie comprend un œuf, une forme larvaire (ressemblant à un ver), une pupe et enfin l’émergence (clôture) en tant qu’adulte volant. C’est la même chose que la métamorphose bien connue des papillons. Le stade larvaire comporte trois stades, ou mues.

Jour 0 : la femelle pond des œufs
Jour 1 : les œufs éclosent
Jour 2 : premier stade (un jour de longueur)
Jour 3 : deuxième stade (un jour de longueur)
Jour 5 : troisième et dernier stade (deux jours de longueur)
Jour 7 : les larves commencent leur stade de vagabondage. La nymphose (formation des pupes) se produit 120 heures après la ponte
Jour 11-12 : Eclosion (les adultes sortent de l’étui de la pupe).

Les femelles deviennent sexuellement matures 8 à 10 heures après l’éclosion

– Le temps de génération de Drosophila melanogaster varie avec la température. Le cycle ci-dessus correspond à une température d’environ 22°C (72°F). Les mouches élevées à une température plus basse (jusqu’à 18°C, ou 64°F) prendront environ deux fois plus de temps pour se développer.
– Les femelles peuvent pondre jusqu’à 100 œufs/jour.
– Les femelles vierges sont capables de pondre des œufs ; cependant, ils seront stériles et peu nombreux.

Après l’éclosion des œufs, de petites larves devraient être visibles dans le milieu de culture. Si votre milieu est blanc, cherchez la petite zone noire (les crochets de la bouche) à la tête des larves. Certains milieux de culture séchés prémélangés sont bleus pour aider à identifier les larves, mais ce n’est pas une nécessité et avec un peu de patience et de pratique, les larves sont facilement visibles. En outre, lorsque les larves se nourrissent, elles perturbent la surface lisse du milieu et c’est donc en regardant uniquement la surface que l’on peut savoir si des larves sont présentes. Cependant, il est toujours bon de vérifier à l’aide d’un stéréomicroscope. Après le troisième stade, les larves commenceront à migrer vers le haut du flacon de culture afin de se nymphoser.

Soins, entretien et manipulation de la drosophile

Introduction
Afin d’incorporer les mouches à fruits dans la salle de classe, il sera nécessaire de maintenir des cultures de mouches pour la manipulation dans les croisements et comme une sauvegarde pour les mésaventures qui pourraient se produire. La culture est très facile et il est recommandé de demander aux élèves de maintenir leurs propres cultures de mouches. De cette façon, chaque élève ou groupe sera directement responsable des soins et de l’entretien à long terme des mouches, y compris la production de grandes populations de cultures pour leurs croisements. Lorsqu’ils sont directement impliqués, les élèves acquièrent des compétences et une meilleure compréhension des besoins et du comportement des mouches. L’enseignant doit rester un coach, et non un conférencier, qui aide les étudiants à maîtriser les techniques. L’instructeur doit maintenir des cultures de réserve de toutes les souches et mutants utilisés par les étudiants au cas où l’incident imprévisible susmentionné se produirait et que les cultures des étudiants disparaissent ou se mélangent. La perte de cultures est l’exception plutôt que la règle, et tant que les étudiants remettent leurs mouches en culture régulièrement et qu’aucune contamination massive ne se produit, les mouches peuvent être maintenues pendant des décennies.
Bouteilles et flacons
Thomas Hunt Morgan utilisait des bouteilles de lait en verre pour ses expériences et, en fait, n’importe quel récipient fera l’affaire, y compris les pots de bébé et les récipients assortis. Cependant, pour faciliter la culture et le transfert des cultures, les bouteilles et les flacons uniformes constituent la meilleure approche. Les deux peuvent être achetés dans un magasin de fournitures biologiques. Les bouteilles sont principalement utilisées pour le maintien de grandes populations de mouches, tandis que les flacons de culture sont utiles pour le maintien de plus petites populations et sont le récipient préféré pour construire les croisements d’étudiants. Si l’on souhaite maintenir des cultures de stock pendant une longue période ou réutiliser des bouteilles et des flacons, il est important de les nettoyer et de les stériliser complètement. Ceci afin de prévenir les épidémies de parasites et de maladies.

Pour nettoyer les bouteilles et les flacons, il faut d’abord les congeler pour tuer les mouches qui s’y trouvent. Retirez les aliments, lavez-les bien, puis stérilisez-les en les passant à l’autoclave (pendant 20 minutes à 121°C et 15 psi ; si les récipients sont en plastique, assurez-vous qu’ils peuvent être passés à l’autoclave) ou en les lavant dans une solution d’eau de Javel à 10 %.

Les bouteilles et les flacons peuvent être achetés dans une variété de tailles et de matériaux. Le verre est efficace, mais s’il tombe, un étudiant peut perdre deux semaines de données en un seul déversement. Des flacons en plastique autoclavés (stériles) sont disponibles et sont préférables pour les étudiants. Les tailles des flacons vont de 96 mm par 25 mm à des tailles plus grandes, mais la plus petite taille est recommandée pour faire des croisements et maintenir de petites cultures. Il existe une grande variété de bouchons, allant du coton doux aux bouchons en mousse. C’est une question de préférence et de coûts, cependant le coton fonctionne bien et peut être acheté dans une pharmacie locale en cas de pincement.
Où acheter les fournitures:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, une division de Genesee Scientific
Ce à quoi ils ressemblent :

StéréomicroscopeFlacon de drosophileFlacons de drosophile

Nourriture pour mouche
La première étape de la préparation des flacons de culture consiste à ajouter des milieux alimentaires. Il existe une variété de types de nourriture pour les mouches ; certains nécessitent une cuisson et d’autres sont achetés déjà préparés et déshydratés. Ces derniers peuvent être achetés auprès d’une entreprise de fournitures biologiques. C’est, bien sûr, beaucoup plus rapide et facile que de préparer un milieu cuit, à tel point que les étudiants peuvent remplir leurs propres flacons de milieu. Cependant, il doit être complètement réhydraté pour de meilleurs résultats, car c’est la seule source d’eau pour les adultes et les larves. Par conséquent, suivez les suggestions ci-dessous pour assurer un milieu complètement hydraté:

Milieu déshydraté
Ajoutez du milieu sec dans la bouteille ou le flacon jusqu’à environ 1/5 à 2/5 du volume. Ajouter de l’eau jusqu’à ce que le milieu semble complètement humidifié. Laissez reposer le flacon pendant quelques minutes, en ajoutant de l’eau supplémentaire si nécessaire jusqu’à ce que le média soit complètement hydraté. La surface doit être humide et brillante et il ne doit pas y avoir d’espace dans le milieu. Si le milieu n’est pas complètement hydraté, la production de cultures vigoureuses est compromise. Les mouches peuvent être ajoutées quelques minutes après l’hydratation du milieu. N’oubliez pas d’ajouter plusieurs grains (mais pas plus) de levure à la surface du milieu avant d’ajouter des mouches.

Milieu cuit
Lorsque vous distribuez un milieu cuit, il doit remplir le flacon de culture, la bouteille ou la fiole de 1/5e à 2/5e. Gardez le milieu à l’extérieur pendant la nuit pour qu’il durcisse, en gardant les flacons couverts d’un tissu pour empêcher les mouches sauvages d’y pondre des œufs. Le jour suivant, ajoutez la levure et les bouchons. Réfrigérez les flacons de milieu non utilisés. Le milieu cuit peut être conservé au réfrigérateur pendant plusieurs semaines. Laissez le milieu se réchauffer à température ambiante avant d’ajouter les mouches. Ne laissez pas le milieu se dessécher.
Environnement
La façon la plus facile d’élever des mouches est à température ambiante. Cependant, la condition d’élevage optimale est une température de 25°C et une humidité de 60%. Dans ces conditions, le temps de génération est plus court (9-10 jours de l’œuf à l’adulte). A moins que l’équipement ne soit facilement disponible, il n’est pas nécessaire de le faire pour réussir l’élevage et le croisement des mouches. Il est préférable de garder les mouches à l’abri des courants d’air et de la lumière directe du soleil ou des sources de chaleur. Celles-ci assècheront rapidement le milieu, nécessitant des changements fréquents de milieu et le potentiel de déshydratation des mouches.
Anesthésier les mouches
Le problème avec les mouches à fruits est qu’elles volent ! Par conséquent, une variété de méthodes ont été développées pour anesthésier les mouches. On trouve notamment l’éther, des marques commerciales comme Flynap, le dioxyde de carbone et le refroidissement. Chacune a ses forces et ses faiblesses. L’éther est inflammable, a une forte odeur et tue les mouches si elles sont trop éthérisées (et peut anesthésier les jeunes étudiants !). Le Flynap, de Carolina Biological, est salissant et a une odeur que certains trouvent offensante. Chacun d’entre eux, cependant, nécessite un équipement peu coûteux qui peut être facilement acheté. Le dioxyde de carbone fonctionne très bien, gardant les mouches immobiles pendant de longues périodes sans effets secondaires, mais les tapis de CO2 (blocs) sont chers et une source de CO2 (généralement une bouteille) et un système de distribution (flacons et pinces) sont nécessaires, ce qui augmente les coûts. Si l’on est ingénieux, on peut utiliser le CO2 émis par les comprimés d’Alka-Seltzer pour anesthésier les mouches pendant de courtes périodes. Préparez un grand tube à essai avec un système de tubes et de bouchons. Ajoutez de l’eau dans le tube, puis le comprimé d’Alka-Seltzer. Du gaz carbonique sera émis.

Le moins nocif pour les mouches est l’anesthésie par le gaz carbonique ou le refroidissement. De ces deux choix, le refroidissement est le plus simple, ne nécessitant qu’un congélateur, de la glace et des boîtes de Pétri. En outre, c’est la seule méthode qui n’affectera pas la neurologie des mouches, donc les études de comportement peuvent commencer après que les mouches se soient suffisamment réchauffées.
Anesthésie des mouches par refroidissement
Afin de neutraliser les mouches, placez le flacon de culture dans le congélateur jusqu’à ce que les mouches ne bougent plus, généralement 8 à 12 minutes. Déposez les mouches sur une surface refroidie. Celle-ci peut être construite en utilisant le haut d’une boîte de Pétri, en ajoutant de la glace pilée, puis en plaçant le fond de la boîte de Pétri sur le dessus. L’ajout des mouches à ce système les maintiendra au frais suffisamment longtemps pour réaliser chaque expérience. Il suffit de replacer les mouches dans le flacon de culture lorsque vous avez terminé. Les mouches se « réveillent » relativement vite une fois sorties de la glace, il faut donc les garder au froid. Cette méthode n’a pas d’effets secondaires durables, mais les mouches laissées trop longtemps au réfrigérateur risquent de ne pas se réveiller. Une autre façon de garder les mouches au frais consiste à ajouter de l’eau dans des sacs de congélation de type zip-lock, à les placer dans le congélateur avec une boîte de Pétri nichée sur le sac, et à les laisser geler.
Transfert des mouches d’un flacon à l’autre
Les mouches doivent être transférées tous les 10 à 14 jours. Les étudiants devraient maintenir une culture de sauvegarde de leurs mouches et l’instructeur devrait maintenir des cultures de réserve de sauvegarde de toutes les souches de mouches. Il existe deux méthodes de base pour transférer les mouches lors de la formation de nouvelles cultures. L’une ne nécessite pas d’anesthésie mais des mains rapides.
A) Placez un entonnoir dans l’embouchure d’un flacon de culture frais auquel on a déjà ajouté du milieu. Dans le vieux flacon (celui où se trouvent les mouches), faites tomber les mouches en tassant doucement le flacon sur une surface souple, comme un tapis de souris. Les mouches tomberont au fond et y resteront pendant quelques secondes (pas plus !), suffisamment de temps pour retirer rapidement le bouchon du flacon, le renverser dans l’entonnoir, et tasser doucement, ensemble, les deux flacons pour forcer les mouches à descendre dans le nouveau flacon.
B) Une autre méthode consiste à mettre les mouches dans le congélateur pendant environ 8 minutes. Cela fera tomber les mouches dans un état de stupeur. Après avoir placé un entonnoir sur la nouvelle fiole, inversez la fiole avec les mouches immobiles dans l’entonnoir. Ce n’est pas aussi amusant, mais vous n’aurez pas de mouches qui volent dans la classe.
L’accouplement des mouches
Il est assez facile de distinguer les mâles des femelles et avec un peu de pratique, les élèves deviendront confiants dans leur capacité à le faire. Remarquez que les mâles sont généralement plus petits et ont un abdomen plus foncé et plus arrondi. La coloration de l’abdomen est la plus facile à reconnaître. En outre, les mâles ont des peignes sexuels tarsaux sur leur première paire de pattes. Ils sont noirs et très distinctifs mais ne peuvent être vus que sous un grossissement relativement élevé. Avec un peu de pratique, en regardant l’abdomen, les élèves deviendront compétents pour déterminer le sexe des mouches avec précision. Le sexage des mouches est essentiel lors des croisements, il faut donc s’assurer que les élèves sont capables d’identifier la différence entre les sexes. Pour que les élèves se sentent à l’aise pour déterminer le sexe des mouches, donnez-leur ou demandez-leur de se procurer 25 mouches de sexe mixte ou plus et laissez-les trier les mouches en deux piles, mâles et femelles. Les autres élèves du groupe et l’instructeur doivent vérifier le tri. Chaque membre du groupe devrait être capable de sexer les mouches.
Photographies de mâles et de femelles

Notez l’abdomen plus foncé et l’aspect plus arrondi du mâle. Les femelles ont également tendance à être plus grandes.
Collection des femelles vierges
Bien qu’il s’agisse d’une simple question de placement des femelles vierges avec les mâles, il est important de reconnaître le facteur temps impliqué pour obtenir des vierges. Les femelles ne restent vierges que pendant 8 à 10 heures après la fermeture et doivent être collectées dans ce laps de temps. NOTE : Les femelles ont la capacité de stocker le sperme après un seul accouplement, donc si la femelle pour un croisement n’est pas vierge, vous ne connaîtrez pas le génotype du mâle utilisé pour votre croisement. Il est fortement conseillé d’obtenir des vierges supplémentaires au cas où une erreur d’identification serait commise ou que la mouche meurt avant que l’accouplement et la ponte ne puissent avoir lieu. Dans une culture forte, il devrait être facile d’obtenir plusieurs femelles vierges. Bien que les femelles soient capables de pondre des œufs en tant que vierges, elles seront stériles et ne produiront pas de larves. Voici trois façons d’obtenir des vierges, la  » méthode d’enlèvement  » étant la plus encouragée pour les débutants.
Méthode d’enlèvement
Enlevez toutes les mouches 8 à 10 heures avant la collecte (généralement, cela se fait à la première heure du matin). Inspectez visuellement la surface de la nourriture pour vous assurer de l’élimination complète des mouches. Après 8 à 10 heures (généralement avant de quitter le travail), collectez toutes les femelles présentes. Toutes seront vierges. Placez-les dans un flacon de culture frais et attendez 2-3 jours pour rechercher des larves. Les femelles vierges peuvent pondre des œufs, mais elles seront stériles. Comme elles sont sensibles à la photopériode, les femelles ont tendance à s’écluser tôt le matin. Par conséquent, des collectes précoces assureront le plus grand nombre de vierges pour l’expérimentation. Cependant, la collecte est possible plus tard dans la journée.
Méthode visuelle
Pouvoir reconnaître les femelles vierges supprime la nécessité de vider les flacons de culture en temps voulu et permet aux étudiants de collecter les leurs sans avoir à venir en classe à des moments impairs de la journée. Notez que les femelles vierges sont beaucoup plus grandes que les femelles plus âgées et n’ont pas la coloration foncée des femelles matures. En outre, dans les premières heures après la fermeture, une tache verdâtre foncée (le méconium, les restes de leur dernier repas avant la nymphose) sera visible sur la face inférieure de l’abdomen.
Cycle de température
Il est possible de maximiser le nombre de vierges dans une collection matinale en utilisant le cycle de température. Lorsque les cultures sont maintenues à une température de 18°C, le développement est ralenti, de sorte que les femelles ne s’accouplent pas avant 16 heures après l’enclos. En retirant les mouches dans l’après-midi/soirée et en plaçant les flacons dans un incubateur à 18°C, 98% des mouches obtenues le matin seront vierges. En plaçant les vierges dans leurs propres flacons pendant 2 à 3 jours, on éliminera les 2 % qui ne sont pas vierges.
Photos de mâles et de femelles vierges :

Croisement des mouches
Une fois que les femelles sont jugées vierges, ajoutez les mâles. Lors de la mise en place de croisements, un rapport de 3:1 entre les femelles vierges et les mâles est idéal. En général, les mâles s’accoupleront plus efficacement s’ils ont mûri pendant 3 jours ou plus. Veillez à sélectionner des mâles robustes et en bonne santé ; plus les mouches sont âgées, plus l’efficacité de l’accouplement est faible. L’accouplement se produit rapidement et le comportement est intéressant à observer, mais ne sera pas abordé ici. Les femelles commencent à pondre des œufs fertiles peu après l’accouplement. Reportez-vous au tableau du cycle de vie pour trouver des preuves de la présence de larves F1. Retirez les adultes une fois qu’il a été établi que suffisamment de larves sont présentes (généralement 7-8 jours après le croisement), car vous risquez de ne pas pouvoir distinguer les parents de la génération F1.
Mouches tueuses : La morgue
C’est une nécessité malheureuse lorsqu’on utilise des mouches. On utilise généralement une bouteille ou un bécher avec de l’eau savonneuse, ou de l’huile minérale. Jetez les mouches anesthésiées directement dans l’eau savonneuse ou l’huile minérale où elles se noient. Une bouteille (bécher, ou bocal à bouchon à vis) remplie d’éthanol ou d’isopropanol peut également servir de morgue.
Nomenclature et définitions de base de la génétique de la drosophile

Les mouches Drosophila melanogaster possèdent 4 chromosomes.
Le génotype s’écrit comme suit :

Chromosome
Chromosome ou Chromosome / Chromosome

Cette nomenclature courante montre un chromosome en haut et son homologue en bas, comme les chromosomes apparaîtraient pendant la méiose lors de la contribution des gamètes.

Lorsque l’on écrit le génotype, en général, les chromosomes sont séparés par un point-virgule.

Chromosome X ; chromosome II ; chromosome III ; chromosome IV

Le type sauvage est noté « + » ou WT

Les mutations dominantes sont écrites avec une majuscule:
Par exemple : Bar ou B

Les mutations récessives s’écrivent avec une lettre minuscule :
Par exemple : blanc ou w

Les mutations sont des allèles (formes alternatives d’un gène occupant un locus donné sur un chromosome) qui sont hérités avec les chromosomes.

Homozygote – Individu possédant le même allèle aux loci correspondants sur les chromosomes homologues.

Hétérozygote – Un individu avec des allèles différents à des loci correspondants sur les chromosomes homologues.

Génotype – Les gènes qu’un organisme possède.

Phénotype – Les attributs observables d’un organisme.

P1 – Génération parentale.

F1 – Génération filiale, ou génération de la progéniture. F1 est la première génération de progéniture.

F2 – La deuxième génération de progéniture.
Autres grandes ressources web:

Gerard Manning a écrit une introduction simple à la génétique de la drosophile.

Génétique sur la mouche : A Primer on the Drosophila Model System par Karen G. Hales et al (2015).

Taking Stock of the Drosophila Research Ecosystem par David Bilder et Kenneth D. Irvine (2017).