Comparaison de la quantité et de la qualité de l’ADN en utilisant la collecte de salive après la consommation d’aliments et de boissons

Matériels et méthodes

Nous avons obtenu l’approbation du comité d’examen institutionnel de protection des sujets humains du Laboratoire de recherche de l’armée de l’air, numéro de protocole FWR20180101H. Les sujets ont été informés individuellement et ont signé les documents de consentement en présence d’un tiers. Des échantillons ont été prélevés sur cinq sujets à l’aide de l’écouvillon de prélèvement Epicentre Catch-All™ (Epicentre, Madison, WI) et du kit de prélèvement d’ADN salivaire Isohelix GeneFiX™ (Isohelix, Kent, UK). Tous les échantillons collectés l’ont été le même jour avec au moins 30 min entre chaque prélèvement ou sur une période de 3 jours, en raison des contraintes de temps des participants. Deux écouvillons ont été collectés par sujet ; chaque écouvillon a été frotté contre l’intérieur de chaque joue pendant 10 à 15 s. Six échantillons de crachat ont été collectés : selon les instructions du fabricant, immédiatement après avoir pris un verre d’eau, mangé un repas, bu une boisson gazeuse, bu une boisson pour sportifs ou bu du café.

Les écouvillons ont été extraits à l’aide de la solution d’extraction d’ADN Epicentre QuickExtract™ 1.0 (Epicentre). Le premier écouvillon a été traité tel quel et le second a été purifié à l’aide du système de purification de l’ADN génomique Wizard™ SV (Promega, Madison, WI) en utilisant le protocole de microcentrifugation pour la purification de l’ADN génomique à partir de lysats de cellules de culture tissulaire. Il n’y a pas eu d’étape de lavage des cellules car les échantillons étaient déjà en solution. Les échantillons de salive ont été extraits à l’aide du QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) avec le protocole d’extraction de salive modifié du fabricant.

Les échantillons ont été quantifiés à l’aide du NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) et du Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) avec le Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. Le NanoDrop a également été utilisé pour évaluer la pureté des échantillons en comparant les valeurs d’absorbance à 260 et 280 nm (A260/A280). Les deux appareils ont été utilisés conformément aux protocoles du fabricant. Les échantillons extraits, normalisés à 10 ng/μL sur la base des concentrations Qubit, ont été analysés à l’aide d’un gel d’agarose préfabriqué E-Gel® à 2 % (Thermo Fisher Scientific). Le bioanalyseur Agilent (Agilent, Santa Clara, CA) ainsi que la puce à ADN haute sensibilité ont été utilisés pour déterminer la qualité de l’ADN extrait.

Les échantillons ont ensuite été analysés sur le système Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) pour tester deux marqueurs génétiques liés aux allergies aux arachides : rs7192 et rs9275596 . Génotypage avec réglage de la pré-réaction en chaîne de la polymérase (PCR) à rampe rapide de 60 °C pendant 1 min, un cycle de maintien de 95 °C pendant 10 min, 40 cycles de 95 °C pendant 15 s puis 60 °C pendant 1 min, et une post-PCR à 60 °C pendant 1 min. Le mélange maître TaqPath ProAmp (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé. Les tests de polymorphisme mononucléotidique (SNP) ont été utilisés à la moitié de la concentration recommandée par le fabricant. Le volume final était de 10 µL.

Résultats

La méthode d’extraction sur écouvillon utilisant la solution QuickExtract a permis d’obtenir une quantité élevée d’ADN. Les valeurs d’ADN obtenues à partir de l’écouvillon sans autre traitement variaient de 1,38 à 54,2 pg/µL, comme déterminé par le Bioanalyseur (fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Cependant, des résultats antérieurs non rapportés de notre laboratoire ont démontré que les expériences de séquençage étaient inhibées lorsque les bibliothèques étaient préparées directement à partir des extractions de la solution QuickExtract. Par conséquent, nous avons purifié ces échantillons à l’aide d’un protocole de purification sur colonne Wizard, en diminuant la concentration, comme prévu (allant de 2,59 à 38,2 pg/µL), et en améliorant les rapports A260/A280 pour qu’ils se rapprochent de la plage généralement acceptée (1,8-2,1).

Les échantillons de crachat recueillis selon le protocole du fabricant et extraits à l’aide du kit d’ADN sanguin QIAamp avaient une plage de 1,01 ng/μL à 8,20 ng/μL. La pureté indiquée par la mesure A260/A280 était généralement dans la fourchette pour l’ADN (voir le fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Aucun des échantillons de crachats recueillis après que les sujets aient bu diverses boissons ou déjeuné n’a présenté des concentrations d’ADN et des lectures de pureté significativement différentes de celles recueillies selon le protocole du fabricant (30 min de jeûne) (figure 1).

Les échantillons extraits normalisés à 10 ng/μL comme déterminé par les lectures Qubit 4.0 ont été exécutés sur un E-Gel à 2 % en utilisant une échelle de 1 kb (fichier supplémentaire 1 : figure S1). Nous nous attendions à voir une bande vers le haut du gel représentant une extraction d’ADN de poids moléculaire élevé. Comme prévu, l’ADN extrait des différentes méthodes de collecte de salive avait un poids moléculaire élevé. Bien qu’ils aient été normalisés à une entrée de 10 ng/µL, la plupart des échantillons d’écouvillons n’ont pas donné lieu à une bande claire, ce qui suggère soit la présence d’interférents de charge, soit un autre problème systématique.

Une analyse plus détaillée de la taille et de la pureté sur un Bioanalyzer a montré que tous les échantillons et toutes les conditions présentaient principalement de l’ADN de poids moléculaire élevé et des concentrations similaires (figure 2). Mis à part la faible concentration susmentionnée après la purification de l’extraction par écouvillon, aucune tendance liée aux conditions de prélèvement (manger ou boire) n’apparaît dans la qualité, la taille ou la concentration de l’ADN lors de l’analyse des signaux de l’électrophérogramme. Il semble y avoir un changement dépendant du sujet, bien que ce phénomène n’ait pas été approfondi.

Enfin, nous avons utilisé le génotypage SNP pour tester l’adéquation de l’ADN extrait pour les processus moléculaires en aval (figure 3). Tous les échantillons extraits de tous les sujets ont réussi à produire des résultats utilisables pour le génotypage de deux SNP associés aux allergies aux arachides , à l’exception d’un des échantillons d’écouvillons purifiés (sujet 5B).

Discussion

Lors de la conception d’une étude de recherche génétique, d’un produit commercial ou d’une intervention de soins de santé, la facilité d’utilisation et la conformité de l’utilisateur final sont deux considérations essentielles. Les dispositifs de collecte de sang qui nécessitent des piqûres cutanées peuvent avoir une conformité plus faible en raison de l’aversion à la douleur. D’après les observations faites dans notre laboratoire, nous avons remarqué une diminution du taux d’inscription dans les études lorsque la différence principale est la ponction veineuse par rapport au prélèvement de salive. Nous n’avons pas réalisé d’étude contrôlée pour examiner ce phénomène ; nous avons plutôt choisi de procéder à un prélèvement de salive en raison de sa facilité d’utilisation, de l’augmentation apparente du nombre d’inscriptions et du type d’études de recherche principalement réalisées dans notre laboratoire. Comme nos études impliquent l’auto-administration de l’échantillon de salive, nous avons cherché à déterminer si la quantité et la qualité de l’ADN présent sont suffisamment élevées pour être utilisées dans des applications moléculaires en aval, après diverses conditions probables de collecte sur le terrain, principalement la consommation de différents aliments et boissons. La conception de l’étude ne visait pas à établir des comparaisons entre les individus, mais plutôt à comparer la variabilité intra-sujet du prélèvement d’échantillons. Avec cet objectif à l’esprit, nous n’avons observé aucune diminution significative des quantités d’ADN causée par la variation des instructions du fabricant de rester à jeun pendant 30 minutes avant le prélèvement.

Bien que la quantité d’ADN soit importante, plus critique pour les techniques avancées de biologie moléculaire est la qualité de l’ADN obtenu. Dans notre étude, nous avons constaté que le prélèvement d’échantillons de salive après avoir mangé et bu n’avait pas d’impact sur le rendement de l’ADN de poids moléculaire élevé. Cet ADN est essentiel pour le séquençage de nouvelle génération, le balayage des réseaux et le génotypage par PCR. En outre, un test expérimental utilisant deux cibles génétiques indépendantes dans le génotypage par PCR a démontré que ces échantillons se prêtaient à des analyses moléculaires.

Notre objectif prévu avec cette étude était de voir si la qualité et la quantité de l’ADN provenant du prélèvement de salive par un kit de prélèvement d’ADN salivaire seraient affectées par le non-respect des instructions du fabricant, c’est-à-dire boire ou manger juste avant le prélèvement. Conformément à notre hypothèse, nous n’avons pas constaté de différence dans la quantité ou la qualité de l’ADN isolé.

Conclusion

Les études génétiques ont dépassé le cadre d’une démarche purement scientifique et sont désormais courantes auprès du public consommateur. Afin d’optimiser les échantillons humains pour ces études, les fabricants s’efforcent de développer des méthodes de collecte simples et robustes. L’échantillonnage de salive est la moins invasive de ces méthodes, donne un ADN de haute qualité et assure une excellente stabilité du produit. Notre étude de l’ADN obtenu à partir de la salive après la consommation de diverses boissons et/ou collations a montré qu’il n’y a pas de différence significative dans la quantité et la qualité de l’ADN recueilli à l’aide du kit de prélèvement d’ADN de salive GeneFiX d’Isohelix (Isohelix) lorsque les échantillons ne sont pas prélevés selon le protocole du fabricant. Même si la taille de l’échantillon de cette étude est faible, les observations d’autres études de notre laboratoire sont cohérentes avec les résultats de notre comparaison systématique présentée ici. Nous concluons donc que le prélèvement de salive est un moyen robuste et non invasif de recueillir des échantillons à la fois en laboratoire et sur le terrain, et que l’exigence de 30 minutes d’abstinence de nourriture et de boisson est un idéal et non un absolu.