Les composants d’un système de base de chromatographie liquide à haute performance sont représentés dans le schéma simple de la figure E.
Un réservoir contient le solvant . Une pompe haute pression est utilisée pour générer et doser un débit spécifié de phase mobile, généralement des millilitres par minute. Un injecteur est capable d’introduire l’échantillon dans le flux de phase mobile à écoulement continu qui transporte l’échantillon dans la colonne HPLC. La colonne contient le matériau de garnissage chromatographique nécessaire pour effectuer la séparation. Ce matériau de garnissage est appelé phase stationnaire car il est maintenu en place par le matériel de la colonne. Un détecteur est nécessaire pour voir les bandes de composés séparés lorsqu’ils sont élués de la colonne HPLC. La phase mobile sort du détecteur et peut être envoyée à la poubelle ou collectée, selon les besoins. Lorsque la phase mobile contient une bande de composé séparé, la CLHP offre la possibilité de collecter cette fraction de l’éluat contenant ce composé purifié pour une étude plus approfondie. C’est ce qu’on appelle la chromatographie préparative .
Notez que des tubes et des raccords à haute pression sont utilisés pour interconnecter les composants de la pompe, de l’injecteur, de la colonne et du détecteur afin de former le conduit pour la phase mobile, l’échantillon et les bandes de composés séparés.
Figure E : Système de chromatographie liquide haute performance
Le détecteur est câblé à la station de données de l’ordinateur, le composant du système HPLC qui enregistre le signal électrique nécessaire pour générer le chromatogramme sur son écran et pour identifier et quantifier la concentration des constituants de l’échantillon (voir la figure F). Comme les caractéristiques des composés de l’échantillon peuvent être très différentes, plusieurs types de détecteurs ont été mis au point. Par exemple, si un composé peut absorber la lumière ultraviolette, on utilise un détecteur d’absorption des UV. Si le composé est fluorescent, on utilise un détecteur de fluorescence. Si le composé ne présente aucune de ces caractéristiques, on utilise un type de détecteur plus universel, tel qu’un détecteur à diffusion de lumière par évaporation. L’approche la plus puissante consiste à utiliser plusieurs détecteurs en série. Par exemple, un détecteur UV et/ou ELSD peut être utilisé en combinaison avec un spectromètre de masse pour analyser les résultats de la séparation chromatographique. Cela permet d’obtenir, à partir d’une seule injection, des informations plus complètes sur un analyte. La pratique consistant à coupler un spectromètre de masse à un système HPLC est appelée LC/MS.
Figure F : Un système HPLC typique
Fonctionnement de la HPLC
Un moyen simple de comprendre comment nous réalisons la séparation des composés contenus dans un échantillon est de visualiser le diagramme de la figure G.
La phase mobile entre dans la colonne par la gauche, traverse le lit de particules et sort à droite. La direction du flux est représentée par des flèches vertes. Tout d’abord, considérez l’image supérieure ; elle représente la colonne au temps zéro , lorsque l’échantillon entre dans la colonne et commence à former une bande. L’échantillon représenté ici, un mélange de colorants jaunes, rouges et bleus, apparaît à l’entrée de la colonne comme une seule bande noire.
Après quelques minutes , pendant lesquelles la phase mobile s’écoule de façon continue et régulière devant les particules du matériau de garnissage, on peut voir que les colorants individuels se sont déplacés en bandes séparées à des vitesses différentes. Ceci est dû au fait qu’il y a une compétition entre la phase mobile et la phase stationnaire pour attirer chacun des colorants ou analytes. Remarquez que la bande de colorant jaune se déplace le plus rapidement et est sur le point de sortir de la colonne. Le colorant jaune aime la phase mobile plus que les autres colorants. Par conséquent, il se déplace à une vitesse plus rapide, plus proche de celle de la phase mobile. La bande de colorant bleu aime davantage le matériau de garnissage que la phase mobile. Sa plus forte attraction pour les particules fait qu’elle se déplace beaucoup plus lentement. En d’autres termes, c’est le composé le plus retenu dans ce mélange d’échantillons. La bande de colorant rouge a une attraction intermédiaire pour la phase mobile et se déplace donc à une vitesse intermédiaire dans la colonne. Comme chaque bande de colorant se déplace à une vitesse différente, nous sommes en mesure de la séparer par chromatographie.
Figure G : Comprendre le fonctionnement d’une colonne chromatographique – les bandes
Qu’est-ce qu’un détecteur ?
Lorsque les bandes de colorant séparées quittent la colonne, elles passent immédiatement dans le détecteur. Le détecteur contient une cellule à écoulement qui voit chaque bande de composé séparée contre un fond de phase mobile . Un détecteur approprié a la capacité de détecter la présence d’un composé et d’envoyer son signal électrique correspondant à une station de données informatique. Un choix est fait parmi de nombreux types de détecteurs, en fonction des caractéristiques et des concentrations des composés qui doivent être séparés et analysés, comme nous l’avons vu précédemment.
Qu’est-ce qu’un chromatogramme ?
Un chromatogramme est une représentation de la séparation qui s’est produite chimiquement dans le système HPLC. Une série de pics s’élevant à partir d’une ligne de base est dessinée sur un axe de temps. Chaque pic représente la réponse du détecteur pour un composé différent. Le chromatogramme est tracé par la station de données informatique .
Figure H : Comment les pics sont créés
Dans la figure H, la bande jaune a complètement traversé la cellule d’écoulement du détecteur ; le signal électrique généré a été envoyé à la station de données informatique. Le chromatogramme résultant a commencé à apparaître à l’écran. Notez que le chromatogramme commence lorsque l’échantillon a été injecté pour la première fois et qu’il s’agit d’une ligne droite située près du bas de l’écran. C’est ce qu’on appelle la ligne de base ; elle représente la phase mobile pure qui traverse la cellule d’écoulement au fil du temps. Lorsque la bande jaune de l’analyte traverse la cellule d’écoulement, un signal plus fort est envoyé à l’ordinateur. La ligne s’incurve, d’abord vers le haut, puis vers le bas, proportionnellement à la concentration du colorant jaune dans la bande d’échantillon. Cela crée un pic dans le chromatogramme. Une fois que la bande jaune est complètement sortie de la cellule du détecteur, le niveau du signal revient à la ligne de base ; la cellule d’écoulement contient à nouveau uniquement de la phase mobile pure. Comme la bande jaune se déplace le plus rapidement, en éluant en premier de la colonne, elle est le premier pic dessiné.
Un peu plus tard, la bande rouge atteint la cellule d’écoulement. Le signal s’élève à partir de la ligne de base lorsque la bande rouge entre pour la première fois dans la cellule, et le pic représentant la bande rouge commence à être dessiné. Dans ce diagramme, la bande rouge n’a pas entièrement traversé la cellule d’écoulement. Le diagramme montre ce à quoi ressembleraient la bande rouge et le pic rouge si nous arrêtions le processus à ce moment-là. Comme la plus grande partie de la bande rouge a traversé la cellule, la plus grande partie du pic a été dessinée, comme le montre la ligne continue. Si nous pouvions redémarrer, la bande rouge traverserait complètement la cellule d’écoulement et le pic rouge serait terminé. La bande bleue, la plus fortement retenue, se déplace à la vitesse la plus lente et s’élue après la bande rouge. La ligne en pointillé vous montre comment le chromatogramme terminé apparaîtrait si nous avions laissé l’analyse se poursuivre jusqu’à son terme. Il est intéressant de noter que la largeur du pic bleu sera la plus large car la largeur de la bande bleue de l’analyte, bien que la plus étroite sur la colonne, devient la plus large lorsqu’elle est éluée de la colonne. Cela est dû au fait qu’il se déplace plus lentement à travers le lit de matériau de garnissage chromatographique et nécessite plus de temps pour être élué complètement. Comme la phase mobile s’écoule en continu à un débit fixe, cela signifie que la bande bleue s’élargit et est plus diluée. Comme le détecteur réagit proportionnellement à la concentration de la bande, le pic bleu est plus bas en hauteur, mais plus large.