Enteropathogens Associated with Diarrheal Disease in Infants of Poor Urban Areas of Porto Velho, Rondônia: a Preliminary Study
Vol. 96(5): 621-625, Jul 2001
Patrícia Puccinelli Orlandi+, Tatiane Silva, Gleiciene Felix Magalhães, Fabiana Alves, Roberto Penna de Almeida Cunha, Rui Durlacher, Luiz Hildebrando Pereira da Silva
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical, Rodovia BR 364, km 4.5, 78970-900 Porto Velho, RO, Brasil
Sataakolmekymmentä ripulitapausta ja 43 iältään vastaavaa 0-5-vuotiasta kontrollia tutkittiin Porto Velhon, Rondônian, köyhän kaupunkialueen köyhässä avohoitoyksikössä. Kahdeksankymmentä prosenttia ripulitapauksista havaittiin alle 2-vuotiaiden ryhmissä. Rotavirus (19,2 %) oli yleisin ripuliin liittyvä enteropatogeeni, jota seurasivat Shigella flexneri (6,15 %) ja S. sonnei (1,5 %) sekä Salmonella sp. (6,9 %). Lisäksi todettiin neljä tapausta E. coli -enterotoksigeenistä infektiota (3,1 %), E. coli -enteropatogeenista (EPEC) (2,3 %), yksi tapaus E. coli -enteroinvasiivista infektiota (0,8 %) ja yksi tapaus Yersinia enterocoliticaa (0,8 %). Sekainfektiot olivat yleisiä, ja niihin liittyi rotavirus, EPEC ja Salmonella sp. sekä Entamoeba histolytica ja Giardia lamblia.
Avainsanat: ripulitauti – enteropatogeenit – rotavirusinfektiot – epidemiologia – Rondônia – Brasilia
Ripulitauti aiheuttaa vuosittain arviolta viisi miljoonaa kuolemantapausta alle viisivuotiaiden imeväisikäisten keskuudessa kaikkialla maailmassa (Georges ym. 1984). Tärkeimmät riskitekijät ripulin aiheuttamalle kuolleisuudelle tunnetaan hyvin, ja ne liittyvät useimpien kehitysmaiden köyhillä alueilla asuvien väestönosien huonoon elämänlaatuun sekä sanitaation ja puhtaan veden saannin puutteeseen.
Kertomusten mukaan ripuli on tärkeä lapsuuden sairaus monilla Latinalaisen Amerikan maiden alueilla, ja sen osuus lapsikuolleisuudesta on yli 20 prosenttia (Bern ym. 1992). Brasiliassa ripulitautia esiintyy kaikkialla maassa, ja se on edelleen merkittävä syy lasten kuolleisuuteen köyhimmillä kaupunki- ja maaseutualueilla sekä koillis- että pohjoisilla alueilla (Guerrant & Kirchhoff 1983).
Pitkittäistutkimus, joka tehtiin vuosina 1990-1992 Belémin kaupungissa, Amazonin itäisellä alueella, tuotti 5,9 ripulitapausta lasta kohti vuodessa (Linhares 1997).
Vähemmän aikaa Fortalezasta, maan koillisosasta, saadut tiedot osoittivat, että 6-12 kuukauden ikäisten ripulijaksojen määrä ylittää 7 ja 9 jaksoa henkilöä kohden vuodessa köyhillä kaupunki- ja köyhillä maaseutualueilla asuvissa perheissä, ja vähenee asteittain kahteen jaksoon henkilöä kohden aikuisten keskuudessa (Guerrant & Kirchhoff 1983). Tähän mennessä Rondôniassa ja läntisellä Amazonin alueella ei ole tehty tutkimusta ripulitautien esiintyvyyden selvittämiseksi, mutta virallisten terveyspalvelujen tiedot osoittavat, että ripuli on tärkein kuolleisuuden syy 0-5-vuotiaiden lasten keskuudessa (Plano Plurianual de Saúde de Rondônia 1996).
Brasilian etelä- ja kaakkoisosissa on tehty useita tutkimuksia, joissa on pyritty tunnistamaan ripuliin liittyviä etiologisia tekijöitä sekä arvioimaan taudin epidemiologisia ja kliinisiä piirteitä (Riley ym. 1984, Trabulsi ym. 1985a, Gomes ym. 1991). Koillisalueella on tehty muutamia tutkimuksia, erityisesti Fortalezassa (Guerrant & Kirchhoff 1983) ja Recifessä (Leal ym. 1988). Brasilian pohjoisella Amazonin alueella ei ole tehty yhtään tutkimusta, lukuun ottamatta rotavirusta koskevia erityistutkimuksia Belémissä.
Esitämme tässä alustavia tietoja ripulin etiologiasta ja kliinisistä piirteistä köyhällä kaupunkialueella asuvilla 0-5-vuotiailla pikkulapsilla, jotka ohjattiin lastentautien avohoitoyksikköön Porto Velhossa, Rondôniassa (läntinen Amazonin alue). Enteropatogeenien suhteellinen esiintymistiheys on samanlainen kuin Koillis-Brasiliassa.
AINEISTO JA MENETELMÄT
TULOKSET
KESKUSTELU
.
KIITOKSET
AINEISTO JA MENETELMÄT
Tutkimusalue –
. Tutkimus suoritettiin heinäkuun 1998 ja maaliskuun 1999 välisenä aikana ”Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEPEM)” -laitoksen henkilökunnan toimesta, Porto Velho, ”Policlínica Hamilton Gondin” -ambulanssiyksikössä. Porto Velhon pääkaupungin väkiluku on kasvanut merkittävästi kolmen viime vuosikymmenen aikana, mikä on johtunut muuttoliikkeestä Brasilian eri alueilta sen jälkeen, kun BR364-tietä, joka yhdistää kaupungin maan keski- ja eteläosiin, on rakennettu. Kaupungin nykyinen väkiluku on noin 200 000 asukasta. Kaupungilla on nykyaikainen geometrinen muotoilu, mutta sillä ei ole riittävää saniteettijärjestelmää. Policlínica sijaitsee kaupungin köyhällä pohjoisella laitamilla. Juomaveden saanti rajoittuu vain pieneen osaan ikääntyneistä asunnoista, eikä viemäriverkostoa ole, vaan jokaisessa talossa on käymäläkuopat.
Tutkimuksen yleiskatsaus – Äidit toivat ”Policlínicaan” ripulitautien vuoksi sata kolmekymmentä 0-5-vuotiasta pikkulasta; lisäksi tutkimukseen valittiin 43 iältään vastaavaa ”Policlínicaan” tullutta, ripulitautia sairastamatonta vertailulasta. CEPEM:n lastenlääkärit haastattelivat mukana olleita aikuisia, saivat kirjallisen suostumuksen, täyttivät kyselylomakkeen ja suorittivat lääkärintarkastuksen. Erityistä huomiota kiinnitettiin aiempiin oireisiin, ripulijaksojen määrään, kuumeeseen (kainalolämpö > 37o,8), oksenteluun, kuivumiseen sekä liman ja veren esiintymiseen ulosteessa.
Laboratoriomenetelmät – Ulostenäytteet kerättiin joko luonnollisen tyhjennyksen jälkeen tai stimuloimalla glyseriinipannalla. Näytteet jaettiin kahteen fraktioon: toista fraktiota käytettiin parasitologiseen tutkimukseen ja rotaviruksen testaamiseen Slidex Kitillä (Biomerieux). Toinen näyte viljeltiin tavanomaisten bakteriologisten menetelmien mukaisesti. Lyhyesti sanottuna noin 3 g ulostetta suspendoitiin 3 ml:aan PBS:ää ja asetettiin seuraaville selektiivisille väliaineille: MacConkey-, SS- ja briljanttivihreä-agariin (sen jälkeen, kun se oli rikastettu 40 µg/ml novobiosiinia sisältävällä tetrationaatti-liemellä) seuraavien enteropatogeenisten bakteerien eristämiseksi ja tunnistamiseksi: enteropatogeeninen Escherichia coli (EPEC), enterohemorraginen (Shigan kaltaista toksiinia tuottava) E. coli (EHEC), enteroinvasiivinen E. coli (EIEC), Shigella, Salmonella sp.., Yersinia-lajit, Campylobacter jejuni ja C. coli. Levyjä inkuboitiin 37oC:ssa 24-48 tuntia lukuun ottamatta niitä, joita käytettiin kampylobakteerilajien tunnistamiseen; ne havaittiin käyttäen muunnettuja Skirrow-levyjä, joita inkuboitiin 42oC:ssa 48 tuntia Gaspak-purkissa.
Viisi E. colille tyypillistä positiivista pesäkettä ja yksi laktoosinegatiivinen pesäke, jotka olivat morfologialtaan erityyppisiä, kasvatettiin MacConkey-agar-levyille sekä SS- ja briljanttivihreä-agar-levyiltä eristetyt laktoosipositiiviset ja -negatiiviset pesäkkeet identifioitiin biokemiallisilla testeillä, joissa käytettiin EPM-millikraattikittiä (EPM millicitrate Kit) (ProBac, Brasil). Kampylobakteerilajeja muistuttaville pesäkkeille, jotka kasvoivat Skirrow-muunnetuilla levyillä, tehtiin Gram-värjäys sekä katalaasi- ja oksidaasitestit suvun vahvistamiseksi. MacConkey-agarilta eristetyille E. coli -kannoille tehtiin diaagglutinaatiotestit käyttäen moniarvoisia seerumeita EPEC-seroryhmiä A, B ja C vastaan. Agglutinoitumattomat isolaatit testattiin EHEC-seroryhmän O157 antiseerumilla ja moniarvoisilla seerumeilla EIEC-seroryhmiä A ja B vastaan. Biokemiallisilla testeillä Shigella- ja Yersinia- lajeiksi tunnistetut isolaatit serotyypiteltiin tavanomaisilla tekniikoilla. Kaupallisesti saatavilla olevia ProBacin ja Promicron (São Paulo) antiseerumeita käytettiin serotyyppien määrittämiseen.
E. coli -isolaateista, jotka eivät kuuluneet EPEC-, EHEC- tai EIEC-serotyyppeihin, testattiin lämpöherkän enterotoksiinin (LT) ja lämpöstabiilin (ST) enterotoksiinin tuotanto PCR:llä. Käytetyt alukkeet (Tornieporth ym. 1995) ovat komplementaarisia seuraaviin kohtiin:
59-76 (ET-LT1,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)
765-746 (ET-LT2,5’GCGACAAATTATACCGTGCT3′)
79-98 (ET-ST1,5’CTGTATTGTCTTTTTTTCTCACCT3′) ja
260-241 (ET-ST2, 5’GCACCCGGTACAAGCAGGAT3′).
Monistaminen suoritettiin 30 syklillä Perkin-Elmerin lämpösyklilaitteessa seuraavasti: denaturointi 2 minuutin ajan 92ºC:ssa, hehkutus 1 minuutin ajan 50oC:ssa ja pidennys 2 minuutin ajan 72ºC:ssa. Monistusprosessi lopetettiin 5 minuutin pidennyksellä 72 ºC:ssa, ja putket jäähdytettiin nopeasti 4 ºC:ssa. Viisitoista µl kustakin näytteestä elektroforeesattiin 2 % etidiumbromidilla värjätyllä agaroosigeelillä 100 V:ssa 2 tunnin ajan PCR-tuotteen visualisoimiseksi.
TULOKSET
Ripulitautien ikäryhmittäinen jakaantuminen – 130 ripulitapauksen tautitapauksen joukossa havaittiin selvästi korkeampi ilmaantuvuus ikäryhmissä 0-2 vuotta vanhoissa ikäluokissa ”Policlínicassa”. Erityisen paljon sairastuivat alle 1-vuotiaat pikkulapset, joita oli 62 tapausta (47,7 %), joista 28 (21,4 %) oli alle 6 kuukauden ikäisiä (taulukko I).
Enteropatogeenien esiintyvyys – 130 ripulitautitapauksen joukossa laboratoriotutkimukset olivat negatiivisia enteropatogeenisten bakteerien ja rotaviruksen osalta 16 imeväisellä. Taulukossa II esitetään 53 ripulitautia sairastaneen imeväisen (40,7 %) ja 2 kontrollin (4,6 %) ulosteesta löytyneiden taudinaiheuttajien jakautuminen. Rotavirus oli yleisin löydetty patogeeni (19,2 % ripulitapauksista ja 2,4 % kontrolleista). Shigellalajeja todettiin 10 tapauksessa (7,7 %) eikä kontrolleissa, ja S. flexneri (8/10) oli erittäin yleinen suhteessa S. sonnei (2/10). Salmonella sp. todettiin 9 tapauksessa (6,9 % ripulitapauksista ja 1 kontrolli – 2,4 %). ETEC:tä todettiin 4 ripulitapauksessa, joissa kaikissa oli sekä LT- että ST-enterotoksiineja. EPEC:tä todettiin kolmessa ripulitapauksessa (2 E. coli O111 ja 1 E. coli O125). Yksi EIEC- ja yksi Y. enterocolitica -tartuntatapaus todettiin ripulilapsista. Kampylobakteeria todettiin joko ripulitapauksissa tai kontrolleissa. Parasitologisissa tutkimuksissa todettiin kahdeksassa tapauksessa E. histolytican ripulitautikystia. G. lamblian kystia löydettiin 19 ripulitapauksessa ja 4 kontrollitapauksessa. Sekainfektiot olivat suhteellisen yleisiä, ja ne jakautuivat seuraavasti: kahdessa tapauksessa S. flexneri ja rotavirus, kolmessa tapauksessa Salmonella sp. ja G. lamblia sekä kahdessa tapauksessa EPEC:n ja E. histolytican samanaikainen infektio.
Aikajakaumat – Kuvassa on esitetty 114 ripulitautitapauksen yhteydessä todettujen eri enteropatogeenien ikäryhmien jakautuminen. Kuten taulukosta I on jo käynyt ilmi, 80,5 prosenttia ripulitapauksista esiintyi alle 2-vuotiaiden ikäryhmissä. Rotaviruspositiivisuusaste on yhtä korkea alle 1-vuotiailla imeväisillä sekä 1-2-vuotiaiden ikäryhmässä. Muita taudinaiheuttajia esiintyy kaikissa ikäryhmissä, mutta niiden esiintymistiheyttä ei voida määritellä, koska yli 2-vuotiailla lapsilla havaittiin vain vähän ripulitapauksia.
Epidemiologiset ja kliiniset piirteet – Vaikka kaikkia bakteeriperäisiä taudinaiheuttajia esiintyi ripulitapauksissa yhtä paljon koko tutkimusjakson ajan, rotaviruspositiivisten tapausten määrä, 70 %, oli suurempi loka-helmikuussa (sadekausi) kuin touko-syyskuussa (kuiva kausi). Taulukossa III on yhteenveto lastenlääkäreiden vastaanottohetkellä ilmoittamista kliinisistä oireista ja oireista; mukana on myös mukana mukana olleilta aikuisilta saadut tiedot oksentelusta. Kuumetta todettiin esiintyvän useammin rotavirusinfektioissa (60 % c2 14,85, P= 0,011, 5df) kuin veren esiintyminen ulosteessa oli yleinen löydös S. sonnei -infektioissa (80 % c2 36,45, P= 0,00001 5df) samoin kuin oksentelu (c2 18,84, P=0,002). Liman esiintymistä ulosteessa havaittiin kaikissa ripulitapauksissa etiologiasta riippumatta.
KESKUSTELU
Tässä tutkimuksessa tutkittiin 130 ripulitapausta ja 43 iältään vastaavaa kontrollitapausta ikäryhmässä 0-5 vuotta Porto Velhon kaupunkialueella sijaitsevassa lastentautien poliklinikassa. Ripulitapaukset keskittyivät alle 2-vuotiaiden ikäryhmiin (80 %), mikä viittaa asteittaiseen immuniteetin kehittymiseen enteropatogeenejä vastaan. Koska ripulitapaukset havaittiin passiivisesti, vanhempien ja yhteiskunnan tapa kiinnittää enemmän huomiota nuorempiin lapsiin voi kuitenkin osittain selittää tapausten ikäjakaumassa havaitun harhan. Fortalezassa tehdyssä pitkittäistutkimuksessa, jossa ripulitapauksia etsittiin aktiivisesti, havaittiin samanlainen ikäjakauma (Guerrant & Kirchhoff 1983), mikä vahvistaa immuniteetin tärkeän roolin ikäjakauman profiilin selittäjänä.
Ripuliepisodeihin liittyvien enteropatogeenien osalta Porto Velhon näytteessä havaittiin suuri rotaviruksen esiintyvyys (19,2 % ripulitapauksista ja 2,4 % kontrolleista).
Rotavirus on yleisin enteropatogeeni, jota havaittiin kolmella tutkitulla alueella (noin 20 %). Porto Velhossa, kuten jo São Paulossa (Trabulsi ym. 1985) ja Belémissä (Linhares 1997) havaittiin, rotavirus liittyy useammin kuumeeseen (60 % tapauksista Porto Velhossa).
ETEC oli Guerrantsin Fortalezan tutkimuksessa yleisin E. coli -bakteerin alaryhmä, joka liittyi ripuliin, kun taas Trabulsin São Paulossa tekemässä tutkimuksessa (Trabulsi ym. 1985b) ja tässä tutkimuksessa Porto Velhossa se aiheutti pienemmän osan potilaista. São Paulon ja Fortalezan näytteistä löytyi aina LT-toksiinipositiivisia E. coli -kantoja, mutta Porto Velhon neljästä ETEC-isolaatista löytyi sekä LT- että ST-toksiinia.
Salmonella- ja Shigella-infektiot, jotka olivat harvinaisia São Paulon tutkimuksissa (Gomes ym. 1991), ovat yleisempiä Koillismaalla (Guerrant & Kirchhoff 1983) ja Porto Velhossa, jossa ne yhdistettiin 6,9 %:iin ja 7,7 %:iin ripulitautijaksoista. Shigella-infektiot, jotka ovat yhtä yleisiä myös muissa kehitysmaissa, kuten Etelä-Afrikassa (Scragg ym. 1978), Meksikossa (Munhoz ym. 1979) ja Bangladeshissa (Stool ym. 1982), aiheuttavat vakavimpia ripulin muotoja, ja Porto Velhon näytteessä niihin liittyi usein oksentelua (90 %) ja veren esiintymistä ulosteessa (80 %), mikä viittaa vakavaan suolen limakalvon vaurioon.
Porto Velhon ripulitapauksissa ei havaittu yhtään kampylobakteeri-infektiotapausta, kun taas São Paulossa tätä enteropatogeeniä esiintyy usein (Gomes ym. 1991). Porto Velhon näytteessä havaittiin yksi Y. enterocolitica -bakteeriin liittyvä ripulitapaus. Vaikka Y. enterocolytica -bakteeria on jo kuvattu Rio de Janeirossa esiintyneissä ripulitapauksissa, sitä on harvoin tavattu muilla alueilla. Huomionarvoista on, että se liittyy usein ripuliin Kanadassa, mikä viittaa tämän lajin parempaan sopeutumiseen kylmään ympäristöön.
Johtopäätöksenä voidaan todeta, että tämä tutkimus on osoittanut, että ripuliin liittyvien enteropatogeenien jakauma Porto Velhossa on samankaltainen kuin Parán osavaltion koillis- ja itäisillä Amazonin alueilla. Myös jotkin tässä tutkimuksessa havaitut erityispiirteet herättävät kiinnostusta läntisen Amazonin alueen enteropatogeenejä koskevaan lisätutkimukseen, jonka tavoitteena on tunnistaa paremmin alueella esiintyvien virus- ja bakteeripatogeenien ryhmät, alaryhmät ja variantit sekä antibioottiresistenssiä koskevat tiedot. Ripulitautien maailmanlaajuisen ongelman laajuus: kymmenen vuoden päivitys. Bull WHO 70: 705-714.
Georges MC, Wachsmuth IK, Meunier DMV, Nebout N, Didier F, Siopathis MR, Gorges AJ 1984. Ripuliin liittyvät lois-, bakteeri- ja viruspatogeenit Keski-Afrikan tasavallassa. J Clin Microbiol 19: 571-575.
Gomes T, Rassi V, Macdonald K, Ramos S, Trabulsi LR, Vieira M, Guth B, Candeias J, Ivey C, Toledo MR, Blake P 1991. Akuuttiin ripulitautiin liittyvät enteropatogeenit kaupunkilaislapsilla São Paulossa, Brasiliassa. J Infect Dis 7: 164-331.
Guerrant RL, Kirchhoff LV 1983. Koillis-Brasiliassa esiintyviä ripulitauteja koskeva prospektiivinen tutkimus: tautimallit, ravitsemukselliset vaikutukset, etiologiat ja riskitekijät. J Infect Dis 7: 753-759.
Leal N, Cavalcanti T, Hofer E 1988. Terveistä lapsista löydetyt enteropatogeenit kolmessa pienituloisessa yhteisössä Recifessä, Pernambucon osavaltiossa, Brasiliassa. Mem Inst Oswaldo Cruz 83: 153-159.
Linhares AC 1997. Rotavirusinfektio Brasiliassa: epidemiologia, immuniteetti ja mahdollinen rokotus. Braz J Infect Dis 1: 284-293.
Munhoz OH, Coelho-Ramirez P, Serafin FA, Olarte J, Pickering LK, Du Pont H, Gutierrez G 1979. Gastroenteritis infecciosa aguda. Etiologia y su correlacion con las manifestaciones clínicas y el moco fecal. Arch Invest Med 10: 135-145.
Plano Plurianual de Saúde, Rondônia 1996. Rondônian terveysministeriön sihteeristö, 168 sivua.
Riley LW, Ceballos BJO, Trabulsi LR, Toledo MRF, Blake PA 1984. Sairaaloiden merkitys Brasilian kaupunkilaislapsille infektioita aiheuttavan endeemisen moniresistentin Salmonella typhimuriumin reservoireina. J Infect Dis 150: 236-241.
Scragg JN, Rubidge CJ, Appelbaum PC 1978. Shigella-infektio afrikkalaisilla ja intialaisilla lapsilla ja erityisesti Shigella-septikemia. J Pediatr 93: 796-797.
Stool BJ, Glass RJ, Huq MI, Khan MU, Bann H, Holt J 1982. Bangladeshin ripulitautisairaalassa käyneiden Shigella-tartunnan saaneiden lasten epidemiologiset ja kliiniset piirteet. J Infect Dis 146: 177-183.
Tornieporth NG, John J, Salgado K, Jesus P, Latham E, Melo MCN, Gunzburg ST, Riley LW 1995. Patogeenisten Escherichia coli -kantojen erilaistaminen brasilialaisissa lapsissa PCR:n avulla. J Clinical Microbiol 33: 1371-1374.
Trabulsi LR, Toledo MRF, Ceballos BSO, Candeias JAN 1985a. Ripulitautien epidemiologia Etelä-Amerikassa. Elsevier Science Publisher 12: 121-125.
Trabulsi LR, Toledo, MRF, Murahovschi J, Neto UF, Candeias JAN 1985b. Lapsuusiän bakteeriripulitautien epidemiologia Brasiliassa. Bact Diar Dis 20: 25-36.
Kuvio | Taulukko I | Taulukko II | Taulukko III
.