DNE:t TRANSKRIPTIONAALISESSA SÄÄTELYSSÄ
DNE:t voivat syntyä myös transkriptionaalisen säätelyn yhteydessä. DNE voidaan saada esimerkiksi poistamalla modulaarisen TF:n transaktivaatiodomeeni, jolloin jäljelle jää vain DNA:ta sitova domeeni. Tämä typistetty tekijä voi toimia kilpailullisena transkription estäjänä. Tämän tiedetään esiintyvän luonnossa. Esimerkiksi nisäkkäiden C/EBP-proteiini ilmentyy kolmena vaihtoehtoisena polypeptidinä. Pidemmät polypeptidit sisältävät N-terminaalisen transkription aktivointidomeenin, kun taas lyhyestä muodosta se puuttuu. Koska pitkät ja lyhyet isomuodot yhdistyvät homo- ja heterodimeereiksi, jälkimmäinen käyttäytyy luonnollisena DN:nä (Zahnow et al., 1997). Näin on myös selkärankaisten Stats 5:n ja 6:n kohdalla, jotka pystyvät dimeroitumaan. Niiden proteolyyttinen prosessointi vastauksena fysiologisiin signaaleihin johtaa C-terminaalisen aktivointidomeenin poistamiseen ja muuttaa ne voimakkaiksi inhibiittoreiksi, jotka säätelevät negatiivisesti signaalinsiirtoa (Nakajima ym., 2003). Kasveissa suuri määrä MYB-proteiineja toimii transkription säätelijöinä. Arabidopsiksessa proteiinit, jotka sisältävät yhden MYB:n DNA:ta sitovan toiston, mutta joilta puuttuu transaktivaatiodomeeni, osallistuvat epidermissolujen kohtalon määrittelyyn. Nämä proteiinit ovat vuorovaikutuksessa muiden TF:ien, kuten bHLH-proteiinien, kanssa, ja transaktivaattoridomeenin puuttumisen vuoksi ne käyttäytyvät DN:nä ja trans-DN:nä muodostamalla inaktiivisia komplekseja (Ramsay ja Glover, 2005).
DNA:ta sitovan domeenin poistaminen voi myös johtaa DNE:hin. Näin tapahtuu bHLH TF:ssä. Kuten edellä todettiin, Id-1-geeni koodaa tämän TF-perheen luonnossa esiintyvää DN-inhibiittoria. Täydellisiä bHLH-proteiineja (joissa on DNA:ta sitovat ja dimerisaatiodomeenit) voidaan ilmentää konstitutiivisesti. Pelkän dimerisaatiodomeenin sisältävän Id-1:n säännelty ilmentyminen kuitenkin säätelee bHLH-proteiinien aktiivisuutta (Sun, 1994). Samanlainen ilmiö on odotettavissa myös kasveissa. Esimerkiksi Arabidopsiksen genomi koodaa ∼120 bHLH-proteiinia, joiden ennustetaan sitovan DNA:ta, ja 27 proteiinia, joiden emäksinen alue on pienempi kuin sitomiseen tarvittava (Toledo-Ortiz ym., 2003). Nämä DNA:ta sitomattomat HLH-proteiinit saattavat toimia eläinten Id-proteiinien tavoin bHLH-proteiinien negatiivisina säätelijöinä muodostamalla heterodimeerejä, jotka eivät pysty sitomaan DNA:ta (Toledo-Ortiz ym., 2003). Samanlaisia vaikutuksia odotetaan TF:eillä, jotka kuuluvat bZIP-perheeseen (basic domain/leucine zipper), joka sisältää DNA:ta sitovan perusmotiivin, leusiinivetoketjun dimerisaatiodomeenin ja transaktivaatiota varten tarvittavat domeenit. Arabidopsis koodaa 67 bZIP-proteiinia, joiden kaikkien ennustetaan toimivan homo- ja/tai heterodimeereinä (Deppmann ym., 2004). Osa näistä proteiineista on hyvin pieniä, ja niistä saattaa puuttua aktivointidomeenit. Klassisena esimerkkinä kasveista Fukazawa ym. (2000) selvittivät bZIP TF REPRESSION OF SHOOT GROWTH (RSG) -proteiinin toimintaa gibberelliinisignaalin välityksessä käyttämällä RSG:n DN-muotoa, josta puuttui transkription aktivaatiodomeeni ja joka näin ollen toimi tukahduttaen villityyppisen proteiinin toimintaa, kun sitä ekspressoitiin siirtogeenisessä tupakassa. Lisäksi, kuten trans-DN-muotoja yliekspressiolla käsittelevässä jaksossa todettiin, DNA-proteiinien transkriptiokompleksit ovat myös herkkiä geenien annostasapainolle (Birchler ym., 2001; Veitia, 2002). Tämän tasapainon muutokset, jotka johtuvat yhden TF:n vähentyneestä tai lisääntyneestä ilmentymisestä suhteessa muihin samaan kompleksiin osallistuviin TF:iin, voivat aiheuttaa epänormaaleja fenotyyppejä.
Yksinkertaista transkriptionaalisen aktivaation mallia voidaan käyttää joidenkin DN-mutaatioiden kvantitatiivisten vivahteiden tutkimiseen tässä yhteydessä. Virusjärjestelmiä ja Drosofilaa koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että transkriptio osoittaa usein sigmoidista suhdetta TF:n pitoisuuden suhteen. Kun kyseessä on järjestelmä, joka reagoi yhdentyyppiseen aktivaattoriin (A), tämä sigmoidinen vaste voidaan jakaa kahteen pääkomponenttiin: A:n yhteistoiminnallinen sitoutuminen kohdegeenin promoottoriin (p) ja synergia (kuva 6). Synergia on seurausta promoottoriin jo sitoutuneiden A:n molekyylien ja transkriptiokoneiston välisestä koordinoidusta vuorovaikutuksesta (Carey, 1998; Veitia, 2003).
DNE:t transkriptiossa.
(A) Promoottori, jossa on kaksi sitoutumiskohtaa (harmaat kolmionmuotoiset kolmiot), jotka tunnistetaan yhteistoiminnallisina aktivaattorilla A:lla tai sen typistetyllä muodolla (truncated form) a:lla (a-cruncated shape a), joka käyttäytyy kilpailevana inhibitorina.
(B) Yhteistoiminnallisuus voi johtua DNA:lla istuvan A:n ja viereisen DNA:n sitoutumiskohdan saapuvan monomeerin yhteisestä vetovoimasta.
(C) Synergia: kaksi DNA:n sitoutumiskohdillaan istuvaa monomeeria vetää polymeraasia (pol) puoleensa paljon voimakkaammin kuin vain yksi DNA:han sitoutunut monomeeri. Synergia häiriintyy, kun monomeerilta puuttuu polymeraasia rekrytoiva domeeni.
Asettele promoottori p, jossa on kaksi sitoutumiskohtaa A:lle. Samoja sitoutumiskohtia tunnistaa myös variantti a, joka saattaa toimia kilpailullisena inhibiittorina. Oletamme, että A-molekyylien ja promoottorin välisessä vuorovaikutuksessa voi olla yhteistoimintaa. Näin saattaa olla myös A:n, a:n ja promoottorin välisissä vuorovaikutuksissa. Yksi mahdollinen yhteistoiminnan lähde mainittiin edellä (eli A:lla on taipumus muodostaa dimeerejä liuoksessa, mutta tämä voimistuu DNA:n sitoutumisen aikana). Toinen mahdollisuus on, että monomeerit eivät pysty vuorovaikutukseen liuoksessa ja että yhden monomeerin vuorovaikutus DNA:n kanssa johtaa allosteriseen muutokseen, joka lisää sidotun A:n affiniteettia saapuvaan monomeeriin. On myös mahdollista, vaikkakin epätodennäköisempää, että A-A-vuorovaikutuksia ei ole ja että yhden monomeerin sitoutuminen DNA:han johtaa muutokseen viereisessä paikassa, joka lisää sen affiniteettia uutta monomeeria kohtaan. Oli miten oli, yhteistoiminta tarkoittaa, että reaktio pA + A = pAA tapahtuu helpommin kuin reaktio p + A = pA.
Synergian olemassaolon vuoksi molekyylilaji, joka vaikuttaa eniten transkriptioon, on kahden aktivaattorimolekyylin miehittämä promoottori: pAA. Tämä tarkoittaa myös sitä, että jos kompleksin pA ja polymeraasin välisen assosiaation affiniteettivakio on KpolA, pAA:n ja polymeraasin assosiaation K on paljon suurempi kuin 2K (suuruusluokkaa K2polA; ks. Zlotnick, 1994). Osittaisen transaktivaatioaktiivisuuden huomioon ottamiseksi tässä mallissa käytämme Kpola (reaktiolle pa + pol) ja Kpola2 (reaktiolle paa + pol). Näillä oletuksilla voidaan johtaa yhtälö transkriptiovasteelle (TR) A:n (ja a:n) konsentraation funktiona Veitian (2003) sekä Veitian ja Nijhoutin (2006) kuvaamalla tavalla (ks. täydentävät materiaalit verkossa).
Kun käsillä on melko yksinkertainen yhtälö, voidaan tutkia useita ehtoja: (1) villin tyypin tilanne A/A, (2) kun on puuttuva alleeli (A/-) ja (3) kun A:n ja transaktivaatiodomeenin puuttuvan typistetyn version a yhteisekspressio. Jälkimmäisessä tapauksessa voidaan erottaa kaksi eri tilannetta: (3a) kun a:n mutaatio poistaa yhteistoiminnallisuuden tai (3b) kun A ja a ovat yhteistoiminnallisesti vuorovaikutuksessa. Lopuksi voimme tutkia myös tilannetta (4), jossa a:n transaktivaatiokyky on normaali ja yhteistoiminnallisuus puuttuu, ja (5), jossa yhteistoiminnallisuus on normaali mutta transaktivaatiokyky on osittainen.
Kuvasta 7 nähdään, että a:n TR:llä suhteessa promoottorin maksimituotokseen vs. sen suhteen on sigmoidinen suhde, joka vaihtelee välillä 0-1. Saturaatio kuvastaa systeemin maksimaalista vastetta, mutta tämä ei merkitse sitä, että promoottori toimisi vain kyllästysajassa. Kuvan mukaan ja yleisesti ottaen heterotsygootin A/- käyrän arvot ovat missä tahansa pisteessä alhaisemmat kuin A/A:lla (jokaisella suhteellisella arvolla heterotsygootilla A/- on absoluuttisesti kaksi kertaa vähemmän kuin villityypillä). Mielenkiintoista on, että pienillä A:n suhteellisilla pitoisuuksilla siirtymä käyrien välillä on hyvin voimakas Y(A/-) on ∼25 % Y(A/A):sta. Kuitenkin, kuten intuitiivisesti odotettiin, korkeilla A:n arvoilla kyllästyminen saavutetaan myös A/-:ssä. Jos tämä järjestelmä toimisi normaalisti pienillä A:n pitoisuuksilla, yksilöllä A/- olisi tyypillinen haploinsidenssi-fenotyyppi.
TR of a Promoter (with Two Sites) to the Activator A Alone or Coexpressed (in Equimolar Amounts) with Its DN Form a.
Käyrästö esittää TR:n funktiona A:n alleelikohtaisesta tuotannosta A:n (a:n) suhteessa maksimaaliseen tuotokseen. Tuotos A(a)-pitoisuuksina ilmaistuna riippuu suoraan sen signaalin voimakkuudesta (kestosta), joka ohjaa A(a)-tuotantoa. Erityistapauksessa heterotsygootti A/- tuottaa millä tahansa x:n arvolla kaksi kertaa vähemmän A-proteiinia kuin A/A. Näin ollen heterotsygootin A/- TR-arvot ovat missä tahansa kohdassa (vaaleansininen) pienemmät kuin normaalilla A/A:lla (tummansininen), mutta suurilla A:n arvoilla saavutetaan kyllästyminen. A/a:ssa, kun a:lta puuttuu transaktivaatiokapasiteetti ilman A:n ja a:n välistä yhteistoimintaa, on taipumus saavuttaa kyllästyminen A:n ja a:n pitoisuuksien kasvaessa, koska ensin mainitulla on taipumus miehittää promoottori rekrytoimalla yhteistoiminnallisesti muita A:n molekyylejä (vaaleanpunainen). Kun A:n ja a:n välinen yhteistoiminta säilyy, A/a:n käyrän tasanne saavutetaan TR = 0,25:ssä (vihreä), koska transkriptiivisesti aktiivinen pAA-lajin osuus on vain 25 % kokonaismäärästä. Kun transaktivaatiota on jäljellä ja yhteistyökyky on normaali, A/a:n tasoa ei saavuteta TR = 1:ssä vaan alemmalla tasolla (punainen). Näin ollen A/a:n käyrä ylittää A/-:n käyrän. Tämä alleeli a on hypomorfinen, jos järjestelmä toimii normaalisti matalilla A:n ja a:n kyllästystasoilla, kun taas se on DN korkeammilla pitoisuuksilla. Parametrit ovat lisäaineistossa verkossa.
Mitä tapahtuu A/a:ssa, kun a:lta puuttuu transaktivaatiodomeeni ilman yhteistoimintaa? Klassisen DN-määritelmän mukaan käyrä on missä tahansa pisteessä alempana kuin A/-:n käyrä. On kuitenkin havaittavissa taipumus saavuttaa kyllästyminen A:n ja a:n pitoisuuksien kasvaessa. Itse asiassa A:lla on taipumus miehittää mieluummin promoottori, koska se varmistaa yhteistoiminnalliset vuorovaikutukset saapuvien A-monomeerien kanssa. On kuitenkin ilmeistä, että promoottorin tunnistaminen matalilla proteiinipitoisuuksilla tapahtuu vähemmän helposti A/a:ssa kuin villityyppiolosuhteissa. Käytännössä typistetty monomeeri, joka ei pysty varmistamaan yhteistoiminnallisia vuorovaikutuksia, johtaa heikkoon DNE:hen. Tilanne on täysin erilainen toisessa ääripäässä, kun A:n ja a:n välinen yhteistoiminta säilyy täysin. A/a:n osalta käyrän tasolle päästään TR = 0,25:ssä. Tämä on odotettavissa, koska pAA, joka ohjaa transkriptiota (ts. pAa:n ja paa:n osuudet ovat merkityksettömiä), edustaa vain 25 % miehitetyistä promoottorilajeista saturaatiossa.
Potentiaalisen esimerkin tarjoaa keinotekoinen mutaatio TF FOXL2:ssa. Tämä TF repressoi ihmisen steroidogeenisen akuutin säätelygeenin promoottoria, joka sisältää useita oletettuja sitoutumiskohtia. FOXL2:n versio, joka sisältää DNA:ta sitovan domeenin mutta josta puuttuu C-terminaalinen domeeni, kykenee indusoimaan DNE:n, joka heikentää transkription repressiota. Tämä vaikutus saavutetaan kuitenkin vain silloin, kun DN-versio ilmentyy paljon voimakkaammin (5× ja 10×) kuin villityyppinen proteiini (Pisarska ym., 2004). Kuten edellä on esitetty, tämä saattaa johtua siitä, että FOXL2-molekyylien väliset yhteistoiminnalliset vuorovaikutukset tällä promoottorilla puuttuvat.
Kertomuksellisempi esimerkki on esitetty kuvassa 8, joka esittää kahden erilaisen promoottorin vastetta, jotka sisältävät yhden tai kaksi sitoutumiskohtaa TF PTX2a:lle ja sen DN-versiolle, kuten aiemmin on kuvattu (Saadi ym., 2003. Pienillä transfektoitavan DNA:n määrillä (0,05 μg kuvassa 8) kahta paikkaa sisältävän promoottorin vaste on yli kaksi kertaa voimakkaampi (eli 3 ×) kuin vain yhtä paikkaa sisältävän promoottorin vaste. Tämä on yhteistoiminnan ja synergian yhdistetty merkki. Lisäksi suurilla pitoisuuksilla transfektoimalla konstruktiot WT+DN, promoottorin, jossa on kaksi sitoutumiskohtaa, TR on ∼25 % pelkän villityypin vasteesta. Tämä on odotettavissa, koska suurilla proteiinikonsentraatioilla dimeerit voivat esikoostua jo ennen kohde-DNA:n saavuttamista. Tällöin vain 25 % dimeereistä on normaaleja. TR:n lasku on vähemmän dramaattinen promoottorissa, jossa on vain yksi sitoutumiskohta (odotettu 50 %). Käytännön näkökulmasta katsottuna, jotta mahdollinen DNE ei jäisi huomaamatta in vitro -kokeissa, pieniä määriä WT+DN-konstruktioita olisi transfektoitava ylijäämällä reportteripromoottoria, jotta vältetään sen kyllästyminen villin tyypin muotoon. Yleisemmin tällaisia transfektiokokeita varten olisi esitettävä vastekäyrät eri TF-konsentraatioille.
Kahden erilaisen keinotekoisen promoottorin (p), jotka sisältävät yhden tai kaksi bikoidin kaltaista sitoutumiskohtaa TF:n PITX2a:lle ja sen DN-versiolle (K88E), vaste.
Ympäröivät viivat: promoottorin aktiivisuus (luciferaasireportterisysteemissä) villin TF:n läsnä ollessa. Katkoviivat: villin tyypin ja sen DN-version yhteisekspressio. Huomatkaa, kuinka pienillä transfektoitavan DNA:n määrillä kahden paikan promoottorin vaste on >2 kertaa voimakkaampi (eli 3×) kuin vain yhden paikan promoottorin vaste, mikä johtuu yhteistoiminnasta ja synergiasta. Kuten ennustettiin, suurilla määrillä konstruktioita WT+DN, promoottorin, jossa on kaksi sitoutumiskohtaa, TR on ∼25 % pelkän villityypin vasteesta. TR:n lasku on odotetusti vähemmän dramaattinen promoottorilla, jossa on vain yksi sitoutumiskohta. Jäljennetty ja muokattu kirjoittajien luvalla ja lähteestä Molecular and Cellular Biology and the American Society for Microbiology (Saadi et al., 2003).
Kuten intuitiivisesti odotetaan, kun a:n transaktivaatiokapasiteetti on normaali ja yhteistoimintakyky puuttuu, syntyy hyvin lievä DNE, joka johtaa käytökseen, joka on lähellä nolla-alleelin käyttäytymistä heterotsygoottisessa tilassa. Tällaisen mutantin eristäminen on mahdollista Burzin ja Hanesin (2001) kuvaaman tyylikkään hiivageenisen seulan avulla. Mutaatio voi vaikuttaa yhteistyökykyisyyden tasoihin vähemmän dramaattisesti. Mielenkiintoinen tapaus on, kun yhteistoiminnallisuus laskee noin kymmenesosaan normaalista tasosta (kuvassa 7 esitettyjen tulosten perustana olevien parametrien mukaan) ja transaktivaatiokapasiteetti on normaali. Näissä olosuhteissa variantti a käyttäytyy hypomorfisena alleelina homotsygootissa a/a ja nolla-alleelina A/a:ssa (eli A/a = A/-; tietoja ei ole esitetty). Tämä korostaa jälleen kerran sitä, että hypomorfisten, DN- ja nolla-alleelien välillä ei ole selviä rajoja.
Kun transaktivaatio on jäljellä (ts. 1<Kpola<KpolA) ja yhteistoiminnallisuus on normaali, tasoa ei saavuteta A/a:ssa TR = 1:ssä vaan alemmalla tasolla. Osittaisen aktivaatiokapasiteetin omaavia alleeleja voidaan joissakin tapauksissa tuottaa helposti. Paradigman tarjoaa hiivan TF Gal4, joka sisältää kaksi aktivoivaa aluetta (ARI ja ARII), jotka osallistuvat transkriptiokoneiston rekrytointiin. Happaman alueen ARII:n deletointi johtaa transaktivaatiokapasiteetin vähenemiseen (Ptashne ja Gann, 2002; Ptashne, 2007). Tällaisen alleelin ja villityyppisen Gal4:n yhdistelmän pitäisi käyttäytyä kuvatulla tavalla. Kuten kuvasta 7 käy ilmi, A/a:n käyrä risteää A/-:n käyrän kanssa. Näin ollen sama alleeli voi olla hypomorfinen, jos järjestelmä toimii matalilla kylläisyystasoilla (ennen kuin käyrät leikkaavat toisensa), ja se voi olla DN molekyylitasolla korkeammilla proteiinipitoisuuksilla. Tähän voidaan antaa intuitiivinen selitys. Tarkastellaan esimerkiksi proteiinia a, joka vuorovaikuttaa polymeraasin kanssa vaikkapa 90 %:lla villityypin voimakkuudesta. Erilaisilla pitoisuuksilla heterotsygootti A/a käyttäytyy yleensä kuten A/A. Saturaatiossa kuitenkin vain 25 % promoottorilajista on pAA, joka vuorovaikuttaa polymeraasin kanssa maksimaalisella voimakkuudella. Sitä vastoin heterotsygoottisessa A/-:ssä alhaisilla proteiinipitoisuuksilla promoottorin miehittäminen on vaikeampaa, kun taas saturaatiossa 100 prosenttia promoottorilajeista on pAA:ta. Näin ollen A/a:n ja A/-:n käyrien on leikattava toisensa jossain vaiheessa.
Kaikki kohdepromoottorit solussa eivät ole yhtä herkkiä DN TF:lle. Kun yhteistoiminta ja synergia ovat voimakkaita, promoottorin herkkyyden DN-proteiinille pitäisi riippua DNA:ssa olevien sitoutumiskohtien määrästä. Yksinkertaisin havainnollistettava tapaus on, kun a:lta puuttuu transaktivaatiodomeeni, mutta se vuorovaikuttaa yhteistoiminnallisesti A:n kanssa. Jos transkriptiota ohjaava promoottorilaji on täysin villityyppisellä proteiinilla kuormitettu, kuten edellä on oletettu, maksimaalinen TR voidaan laskea käyttämällä kaavaa (binomitodennäköisyyksien kaavaa), joka on esitetty verkossa Supplemental Materials -julkaisussa. Promoottorilla, jossa on kaksi identtistä sitoutumiskohtaa, maksimaalinen TR on 25 % villin tyypin olosuhdetuotokseen nähden: kolmella sitoutumiskohteella 12,5 % ja neljällä sitoutumiskohteella 6,25 % (kun A ja a ilmaistaan ekvimolaarisina pitoisuuksina). Monimutkaisemmissa tilanteissa vastaus ei ole intuitiivinen ja edellyttää sellaisten mallien analysointia, joita ei käsitellä tässä.