Kuvan E yksinkertaisessa kaaviossa on esitetty korkean suorituskyvyn nestekromatografian perusjärjestelmän komponentit.
Säiliössä on liuotin . Korkeapainepumppua käytetään tuottamaan ja mittaamaan liikkuvan faasin tietty virtausnopeus, tyypillisesti millilitraa minuutissa. Injektori pystyy syöttämään näytteen jatkuvasti virtaavaan liikkuvaan faasivirtaan, joka kuljettaa näytteen HPLC-kolonniin. Kolonni sisältää kromatografisen pakkausmateriaalin, jota tarvitaan erottelun aikaansaamiseksi. Tätä pakkausmateriaalia kutsutaan stationäärifaasiksi, koska kolonnin laitteisto pitää sen paikallaan. Detektoria tarvitaan, jotta erotetut yhdisteiden kaistat voidaan nähdä, kun ne eluoituvat HPLC-kolonnista. Liikkuva faasi poistuu detektorista, ja se voidaan lähettää jätteeksi tai kerätä halutulla tavalla. Kun liikkuva faasi sisältää erotetun yhdisteen kaistaleen, HPLC:n avulla voidaan kerätä tämä puhdistettua yhdistettä sisältävä eluaatin fraktio jatkotutkimuksia varten. Tätä kutsutaan preparatiiviseksi kromatografiaksi .
Huomaa, että pumpun, injektorin, kolonnin ja detektorin komponenttien liittämiseen toisiinsa käytetään korkeapaineletkuja ja -liittimiä, jotka muodostavat kanavan liikkuvalle faasille, näytteelle ja erotetuille yhdisteiden kaistoille.
Kuva E: Korkean suorituskyvyn nestekromatografiajärjestelmä
Detektori on kytketty tietokoneen data-asemaan, HPLC-järjestelmän komponenttiin, joka tallentaa sähköisen signaalin, jota tarvitaan kromatogrammin luomiseksi sen näyttöön ja näytteen ainesosien pitoisuuksien tunnistamiseksi ja kvantifioimiseksi (ks. kuva F). Koska näyteyhdisteiden ominaisuudet voivat olla hyvin erilaisia, on kehitetty useita erilaisia ilmaisimia. Jos esimerkiksi yhdiste voi absorboida ultraviolettivaloa, käytetään UV-absorptiodetektoria. Jos yhdiste fluoresoi, käytetään fluoresenssidetektoria. Jos yhdisteellä ei ole kumpaakaan näistä ominaisuuksista, käytetään yleisempää ilmaisintyyppiä, kuten haihtumisvalon sirontailmaisinta. Tehokkain lähestymistapa on käyttää useita detektoreita sarjassa. Esimerkiksi UV- ja/tai ELSD-detektoria voidaan käyttää yhdessä massaspektrometrin kanssa kromatografisen erottelun tulosten analysoimiseksi. Näin saadaan yhdellä injektiolla kattavampaa tietoa analyytistä. Käytäntöä, jossa massaspektrometri kytketään HPLC-järjestelmään, kutsutaan LC/MS:ksi.
Kuva F: Tyypillinen HPLC-järjestelmä
HPLC:n toiminta
Yksinkertainen tapa ymmärtää, miten saamme aikaan näytteen sisältämien yhdisteiden erottelun, on tarkastella kuvan G kaaviota.
Liikkuva faasi tulee pylvääseen vasemmalta puolelta, kulkee hiukkasvuoteen läpi ja poistuu oikealla. Virtaussuunta on esitetty vihreillä nuolilla. Tarkastellaan ensin ylintä kuvaa; se esittää kolonnia ajankohtana nolla , jolloin näyte tulee kolonniin ja alkaa muodostaa kaistaa. Kuvassa näkyvä näyte, keltaisen, punaisen ja sinisen väriaineen seos, näkyy kolonnin sisääntulossa yhtenä mustana kaistaleena.
Muutaman minuutin kuluttua , jolloin liikkuva faasi virtaa jatkuvasti ja tasaisesti pakkausmateriaalihiukkasten ohi, voidaan nähdä, että yksittäiset väriaineet ovat liikkuneet erillisinä kaistoina eri nopeuksilla. Tämä johtuu siitä, että liikkuvan faasin ja stationäärifaasin välillä on kilpailua kunkin väriaineen tai analyytin houkuttelemisesta. Huomaa, että keltaisen väriaineen kaistale liikkuu nopeimmin ja on poistumassa kolonnista. Keltainen väriaine pitää liikkuvasta faasista enemmän kuin muut väriaineet. Siksi se liikkuu nopeammin, lähempänä liikkuvan faasin nopeutta. Sininen väriainekaista pitää enemmän pakkausmateriaalista kuin liikkuvasta faasista. Sen voimakkaampi vetovoima hiukkasia kohtaan saa sen liikkumaan huomattavasti hitaammin. Toisin sanoen se on tässä näyteseoksessa eniten pidättyvä yhdiste. Punainen väriaineskaistale vetää liikkuvaa faasia puoleensa keskinkertaisesti, ja siksi se liikkuu kolonnin läpi keskinopeudella. Koska kukin väriainekaista liikkuu eri nopeudella, pystymme erottamaan sen kromatografisesti.
Kuva G: Kromatografiakolonnin toiminnan ymmärtäminen – kaistat
Mikä on detektori?
Kun erotetut väriainekaistat poistuvat kolonnista, ne kulkevat välittömästi detektoriin. Detektori sisältää virtauskennon, joka näkee jokaisen erotetun yhdisteen kaistan liikkuvan faasin taustaa vasten . Asianmukainen detektori kykenee havaitsemaan yhdisteen läsnäolon ja lähettämään sitä vastaavan sähköisen signaalin tietokoneen data-asemalle. Valinta tehdään monien erityyppisten detektoreiden joukosta riippuen eroteltavien ja analysoitavien yhdisteiden ominaisuuksista ja pitoisuuksista, kuten edellä on käsitelty.
Mikä on kromatogrammi?
Kromatogrammi on esitys erottelusta, joka on tapahtunut kemiallisesti HPLC-järjestelmässä. Sarja perusviivasta nousevia piikkejä piirretään aika-akselille. Kukin piikki edustaa eri yhdisteen detektorin vastetta. Tietokonetietoasema piirtää kromatogrammin .
Kuva H: Miten piikit syntyvät
Kuvassa H keltainen kaistale on kokonaan läpäissyt detektorin virtauskennon; syntynyt sähköinen signaali on lähetetty tietokonetietoasemalle. Tuloksena oleva kromatogrammi on alkanut näkyä näytöllä. Huomaa, että kromatogrammi alkaa, kun näyte injektoitiin ensimmäisen kerran, ja se alkaa suorana viivana lähellä näytön alareunaa. Tätä kutsutaan perusviivaksi; se edustaa puhdasta liikkuvaa faasia, joka kulkee virtauskennon läpi ajan kuluessa. Kun keltainen analyyttikaistale kulkee virtauskennon läpi, tietokoneelle lähetetään voimakkaampi signaali. Viiva kaartuu ensin ylöspäin ja sitten alaspäin suhteessa näytekaistan keltaisen väriaineen pitoisuuteen. Tämä luo piikin kromatogrammiin. Kun keltainen kaistale on kokonaan poistunut detektorikennosta, signaalitaso palaa perusviivalle; virtauskennossa on nyt jälleen vain puhdasta liikkuvaa faasia. Koska keltainen kaista liikkuu nopeimmin ja eluoituu ensimmäisenä pylväästä, se on ensimmäinen piikki, joka piirtyy.
Hieman myöhemmin punainen kaista saapuu virtauskennoon. Signaali nousee perusviivasta, kun punainen kaista saapuu ensimmäisen kerran soluun, ja punaista kaistaa edustava piikki alkaa piirtyä. Tässä kuvassa punainen kaista ei ole vielä kokonaan kulkenut virtauskennon läpi. Kaaviossa näkyy, miltä punainen kaista ja punainen huippu näyttäisivät, jos prosessi pysäytettäisiin tällä hetkellä. Koska suurin osa punaisesta kaistasta on kulkenut kennon läpi, suurin osa piikistä on piirretty, kuten yhtenäinen viiva osoittaa. Jos voisimme aloittaa uudelleen, punainen kaistale kulkisi kokonaan virtauskennon läpi ja punainen piikki olisi valmis . Sininen kaistale, joka on voimakkaimmin pidättynyt, kulkee hitaimmalla nopeudella ja eluoituu punaisen kaistan jälkeen. Katkoviiva osoittaa, miltä valmis kromatogrammi näyttäisi, jos olisimme antaneet ajon jatkua loppuun asti. On mielenkiintoista huomata, että sinisen piikin leveys on levein, koska sinisen analyyttikaistaleen leveys, joka on kapein pylväässä, muuttuu leveimmäksi, kun se eluoituu pylväästä. Tämä johtuu siitä, että se liikkuu hitaammin kromatografisen pakkausmateriaalipedin läpi ja vaatii enemmän aikaa eluoituakseen kokonaan. Koska liikkuva faasi virtaa jatkuvasti kiinteällä nopeudella, tämä tarkoittaa, että sininen kaistale levenee ja laimenee. Koska detektori reagoi suhteessa kaistan pitoisuuteen, sinisen piikin korkeus on pienempi, mutta leveys suurempi.