Entsyymikatalyysi

Nämä konformaatiomuutokset tuovat myös aktiivisen alueen katalyyttiset jäännökset lähelle substraatin kemiallisia sidoksia, jotka muuttuvat reaktiossa. Kun sitoutuminen on tapahtunut, yksi tai useampi katalyysimekanismi alentaa reaktion siirtymätilan energiaa tarjoamalla reaktiolle vaihtoehtoisen kemiallisen reitin. On olemassa kuusi mahdollista ”esteen yli” katalyysin mekanismia sekä ”esteen läpi” mekanismi:

Läheisyys ja orientaatioEdit

Ensiymin ja substraatin väliset vuorovaikutukset kohdistavat reaktiiviset kemialliset ryhmät toisiinsa ja pitävät ne lähekkäin optimaalisessa geometriassa, mikä lisää reaktion nopeutta. Tämä pienentää reaktanttien entropiaa ja tekee siten additio- tai siirtoreaktioista epäedullisempia, koska kokonaisentropia pienenee, kun kahdesta reaktantista tulee yksi tuote. Tämä on kuitenkin yleinen vaikutus, ja se näkyy myös muissa kuin additio- tai siirtoreaktioissa, joissa se johtuu reagenssien ”tehollisen konsentraation” kasvusta. Tämä ymmärretään, kun tarkastellaan, miten konsentraation kasvu johtaa reaktionopeuden kasvuun: kun reagoivat aineet ovat konsentroituneempia, ne törmäävät toisiinsa useammin ja reagoivat siten useammin. Entsyymikatalyysissä reagenssien sitoutuminen entsyymiin rajoittaa reaktanttien konformaatiotilaa pitämällä ne ”oikeassa orientaatiossa” ja lähellä toisiaan, jolloin ne törmäävät toisiinsa useammin ja oikealla geometrialla halutun reaktion mahdollistamiseksi. ”Tehollinen konsentraatio” on konsentraatio, joka reagoivan aineen pitäisi olla vapaana liuoksessa, jotta se kokisi saman törmäystiheyden. Usein tällaiset teoreettiset efektiiviset konsentraatiot ovat epäfysikaalisia ja mahdottomia toteuttaa todellisuudessa – mikä on osoitus monien entsyymien suuresta katalyyttisestä tehosta, jossa nopeus kasvaa valtavasti katalysoimattomaan tilaan verrattuna.

Esimerkiksi:

Samankaltaiset reaktiot tapahtuvat paljon nopeammin, jos reaktio on intramolekulaarinen.

Sisämolekulaarisessa reaktiossa asetaatin teholliseksi konsentraatioksi voidaan arvioida k2/k1 = 2 x 105 molaria.

Tilanne saattaa kuitenkin olla monimutkaisempi, sillä nykyaikaisissa laskennallisissa tutkimuksissa on todettu, että perinteisiä esimerkkejä läheisyysvaikutuksista ei voida suoraan liittää entsyymin entrooppisiin vaikutuksiin. Lisäksi alkuperäisen entrooppisen ehdotuksen on todettu yliarvioivan suurelta osin orientaatioentropian osuutta katalyysiin.

Protoninluovuttajat tai -akseptoritEdit

Protoninluovuttajat ja -akseptorit eli hapot ja emäkset voivat luovuttaa ja vastaanottaa protoneja stabiloidakseen kehittyviä varauksia siirtymätilassa. Tämä liittyy katalyysin yleiseen periaatteeseen, energiaesteiden pienentämiseen, sillä yleensä siirtymätilat ovat korkean energian tiloja, ja stabiloimalla niitä tämä korkea energia pienenee, mikä alentaa estettä. Entsyymikatalyysin keskeinen piirre moniin muihin kuin biologisiin katalyyseihin verrattuna on se, että samassa reaktiossa voidaan yhdistää sekä happo- että emäskatalyysi. Monissa abioottisissa systeemeissä hapot (suuret ) tai emäkset (suuret konsentraatiot H+ -nieluja tai lajeja, joilla on elektronipareja) voivat lisätä reaktion nopeutta; mutta luonnollisesti ympäristössä voi olla vain yksi yleinen pH (happamuuden tai emäksisyyden (emäksisyyden) mitta). Koska entsyymit ovat kuitenkin suuria molekyylejä, ne voivat sijoittaa sekä happoryhmiä että emäksisiä ryhmiä aktiiviseen alueeseensa vuorovaikutukseen substraattiensa kanssa ja käyttää molempia moodeja riippumatta kokonais-pH:sta.

Yleistä happo- tai emäskatalyysiä käytetään usein nukleofiilisten ja/tai elektrofiilisten ryhmien aktivoimiseksi tai poistuvien ryhmien stabiloimiseksi. Monet aminohapot, joilla on happamia tai emäksisiä ryhmiä, käytetään tätä aktiivisessa keskuksessa, kuten glutamiini- ja asparagiinihappo, histidiini, kystiini, tyrosiini, lysiini ja arginiini sekä seriini ja treoniini. Lisäksi käytetään usein peptidirunkoa, jossa on karbonyyli- ja amidi-N-ryhmiä. Kystiini ja histidiini ovat hyvin yleisesti mukana, koska niiden molempien pKa on lähellä neutraalia pH:ta ja ne voivat siksi sekä vastaanottaa että luovuttaa protoneja.

Monissa happo-/emäskatalyysiä sisältävissä reaktiomekanismeissa oletetaan huomattavasti muuttunut pKa. Tämä pKa:n muuttaminen on mahdollista jäännöksen paikallisen ympäristön kautta.

Olosuhteet	Hapot	Maasit
Hydrofobinen ympäristö	Lisää pKa:ta	Vähentää pKa:ta
Varauskyvyltään samankaltaiset, vierekkäin olevat jäännökset	Nostaa. pKa	Vähentää pKa
Suolasiltojen (ja vety- sidosten) muodostuminen	Vähentää pKa	Vähentää pKa	Vähentää pKa

pKa:n muodostumiseen voi vaikuttaa merkittävästi myös ympäristö, siinä määrin, että jäännökset, jotka ovat emäksisiä liuoksessa, voivat toimia protonien luovuttajina ja päinvastoin.

Esimerkiksi:

Seriiniproteaasin katalyyttinen triadi

Seriiniproteaasin katalyyttisen mekanismin alkuvaiheeseen kuuluu, että aktiivisen keskuksen histidiini ottaa vastaan protonin seriinijäännöksestä. Tämä valmistelee seriinin nukleofiiliksi hyökkäämään substraatin amidisidokseen. Tähän mekanismiin kuuluu protonin luovutus seriiniltä (emäs, pKa 14) histidiinille (happo, pKa 6), mikä mahdollistuu emästen paikallisen ympäristön ansiosta.

On tärkeää selventää, että pKa:n muuttaminen on puhdas osa sähköstaattista mekanismia. Lisäksi edellä mainitun esimerkin katalyyttinen vaikutus liittyy pääasiassa oksyanionin pKa:n alenemiseen ja histidiinin pKa:n nousuun, kun taas protonin siirto seriinistä histidiiniin ei katalysoidu merkittävästi, koska se ei ole nopeutta määräävä este.

Sähköstaattinen katalyysiEdit

Varautuneiden siirtymätilojen vakauttaminen voi tapahtua myös siten, että aktiivisen keskuksen jäännökset muodostavat ionisidoksia (tai osittaisia ionisia varausvuorovaikutuksia) välituotteen kanssa. Nämä sidokset voivat olla peräisin joko happamista tai emäksisistä sivuketjuista, joita esiintyy aminohapoissa, kuten lysiinissä, arginiinissa, asparagiinihapossa tai glutamiinihapossa, tai metallikofaktorista, kuten sinkistä. Metalli-ionit ovat erityisen tehokkaita, ja ne voivat alentaa veden pKa:ta niin paljon, että siitä tulee tehokas nukleofiili.

Systemaattisissa tietokonesimulointitutkimuksissa todettiin, että sähköstaattiset vaikutukset vaikuttavat ylivoimaisesti eniten katalyysiin. Se voi lisätä reaktionopeutta jopa 107-kertaisesti. Erityisesti on havaittu, että entsyymi tarjoaa ympäristöä, joka on polaarisempi kuin vesi, ja että ionisia siirtymätiloja stabiloivat kiinteät dipolit. Tämä on hyvin erilaista kuin siirtymätilan stabilointi vedessä, jossa vesimolekyylien on maksettava ”uudelleenorganisoitumisenergialla”. Ionisten ja varattujen tilojen vakauttamiseksi. Siten katalyysi liittyy siihen, että entsyymin polaariset ryhmät ovat esijärjestäytyneet

Entsyymin aktiivisen keskuksen aiheuttaman sähköstaattisen kentän suuruuden on osoitettu korreloivan voimakkaasti entsyymin katalyyttisen nopeuden paranemisen kanssa

Substraatin sitoutuminen sulkee yleensä veden pois aktiivisesta keskuksesta, jolloin paikallinen dielektrisyysvakio laskee orgaanisen liuottimen dielektrisyysvakion tasolle. Tämä vahvistaa sähköstaattisia vuorovaikutuksia varautuneiden/polaaristen substraattien ja aktiivisten paikkojen välillä. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että aktiivisten paikkojen varausjakaumat järjestyvät siten, että ne stabiloivat katalysoitujen reaktioiden siirtymätiloja. Useissa entsyymeissä nämä varausjakaumat ilmeisesti ohjaavat polaarisia substraatteja niiden sitoutumiskohtiin niin, että näiden entsymaattisten reaktioiden nopeudet ovat suuremmat kuin niiden näennäiset diffuusio-ohjatut rajat.

Esimerkiksi:

Karboksipeptidaasin katalyyttinen mekanismi

Tetraedrinen välitila stabiloituu osittaisella ionisidoksella Zn2+-ionin ja hapen negatiivisen varauksen välillä.

Kovalenttinen katalyysiEdit

Kovalenttisessa katalyysissä substraatti muodostaa ohimenevän kovalenttisen sidoksen entsyymin aktiivisen paikan jäännösten tai kofaktorin kanssa. Tämä lisää reaktioon ylimääräisen kovalenttisen välituotteen ja auttaa vähentämään reaktion myöhempien siirtymätilojen energiaa. Kovalenttinen sidos on reaktion myöhemmässä vaiheessa katkaistava entsyymin uudistamiseksi. Tätä mekanismia käytetään entsyymien, kuten proteaasien, kuten kymotrypsiinin ja trypsiinin, katalyyttisessä triadissa, jossa muodostuu asyyli-entsyymivälituotetta. Vaihtoehtoinen mekanismi on skiff-emäksen muodostus, jossa käytetään lysiinijäännöksen vapaata amiinia, kuten glykolyysin aikana esiintyvässä aldolaasientsyymissä.

Jotkut entsyymit käyttävät muita kuin aminohappoja sisältäviä kofaktoreita, kuten pyridoksaalifosfaattia (PLP) tai tiamiinipyrofosfaattia (TPP), muodostaakseen kovalenttisia välituotteita reagoivien molekyylien kanssa. Tällaiset kovalenttiset välituotteet toimivat vähentääkseen myöhempien siirtymätilojen energiaa samaan tapaan kuin aktiivisen paikan aminohappojäämien kanssa muodostetut kovalenttiset välituotteet mahdollistavat stabiloinnin, mutta kofaktorien kyvyt mahdollistavat sen, että entsyymit voivat toteuttaa reaktioita, joita aminohappojen sivujäämät eivät yksinään pystyisi tekemään. Tällaisia kofaktoreita hyödyntäviä entsyymejä ovat muun muassa PLP-riippuvainen aspartaattitransaminaasi ja TPP-riippuvainen pyruvaattidehydrogenaasi.

Kovalenttinen katalyysi tarjoaa reaktiolle vaihtoehtoisen reitin (kovalenttisen välituotteen kautta) sen sijaan, että se pienentäisi reaktiotien aktivoitumisenergiaa, ja se eroaa siten todellisesta katalyysistä. Esimerkiksi kymotrypsiinin seriinimolekyyliin muodostuvan kovalenttisen sidoksen energiatekniikkaa olisi verrattava hyvin tunnettuun kovalenttiseen sidokseen nukleofiilin kanssa katalysoimattomassa liuosreaktiossa. Todellinen ehdotus kovalenttisesta katalyysistä (jossa este on matalampi kuin vastaava este liuoksessa) edellyttäisi esimerkiksi entsyymiryhmän osittaista kovalenttista sidosta siirtymätilaan (esim. erittäin vahvaa vetysidosta), eivätkä tällaiset vaikutukset edistä merkittävästi katalyysiä.

Metalli-ionikatalyysiEdit

Aktiivisessa keskuksessa oleva metalli-ioni osallistuu katalyysiin koordinoimalla varauksen vakauttamista ja suojaamista. Metallin positiivisen varauksen vuoksi metalli-ionien avulla voidaan stabiloida vain negatiivisia varauksia. Metalli-ionit ovat kuitenkin eduksi biologisessa katalyysissä, koska pH:n muutokset eivät vaikuta niihin. Metalli-ionit voivat myös ionisoida vettä toimimalla Lewisin happona. Metalli-ionit voivat toimia myös hapettumisen ja pelkistymisen tekijöinä.

Sidoksen rasitusEdit

Tämä on indusoidun fit-sidoksen pääasiallinen vaikutus, jossa entsyymin affiniteetti siirtymätilaan on suurempi kuin itse substraattiin. Tämä indusoi rakenteellisia uudelleenjärjestelyjä, jotka rasittavat substraatin sidoksia lähemmäs siirtymätilan konformaatiota, jolloin substraatin ja siirtymätilan välinen energiaero pienenee ja auttaa katalysoimaan reaktiota.

Mutta rasitusvaikutus on itse asiassa pikemminkin perustilaa destabiloiva vaikutus kuin siirtymätilaa stabiloiva vaikutus. Lisäksi entsyymit ovat hyvin joustavia, eivätkä ne voi soveltaa suurta rasitusvaikutusta.

Substraattiin kohdistuvan sidosrasituksen lisäksi sidosrasitus voi indusoitua myös entsyymissä itsessään aktivoimaan aktiivisen keskuksen jäännöksiä.

Esimerkiksi:

Lysotsyymin substraatin, sidotun substraatin ja siirtymätilan konformaatiot.

Substraatti sitoutuessaan, vääristyy heksoosirenkaan puolituolikonformaatiosta (koska proteiinin aminohappojen aiheuttama steerinen este pakottaa ekvatoriaalisen c6:n aksiaaliseen asentoon) tuolikonformaatioon

Kvanttitunnelointi Muokkaa

Nämä perinteiset ”esteen yli”-mekanismit on joissakin tapauksissa kyseenalaistettu malleilla ja havainnoinneilla, jotka koskevat mekanismeja, jotka kulkevat esteen läpi (kvanttitunnelointi). Jotkin entsyymit toimivat kinetiikalla, joka on nopeampi kuin mitä klassinen ΔG‡ ennustaisi. ”Esteen läpi” -malleissa protoni tai elektroni voi tunneloitua aktivaatioesteiden läpi. Protonien kvanttitunneloitumista on havaittu tryptamiinin hapetuksessa aromaattisen amiinidehydrogenaasin toimesta.

Kvanttitunneloituminen ei näytä tarjoavan merkittävää katalyyttistä etua, koska tunneloitumisen osuus on samanlainen katalysoiduissa ja katalysoimattomissa reaktioissa liuoksessa. Tunnelointiosuus (joka tyypillisesti kasvattaa nopeusvakioita ~1000-kertaisesti verrattuna klassisen ”esteen yli kulkevan” reaktion nopeuteen) on kuitenkin todennäköisesti ratkaiseva biologisten organismien elinkelpoisuuden kannalta. Tämä korostaa tunneloituvien reaktioiden yleistä merkitystä biologiassa.

Vuosina 1971-1972 muotoiltiin ensimmäinen kvanttimekaaninen malli entsyymikatalyysistä.

Aktiivinen entsyymiEdit

Ensi- ja substraattikompleksin sitoutumisenergiaa ei voida pitää ulkoisena energiana, joka on välttämätön substraatin aktivoimiseksi. Suuren energiasisällön omaava entsyymi voi ensin siirtää jonkin tietyn energeettisen ryhmän X1 entsyymin katalyyttisestä kohdasta ensimmäisen sidotun reagoijan lopulliseen paikkaan, minkä jälkeen toinen ryhmä X2 toisesta sidotusta reagoijasta (tai yksittäisen reagoijan toisesta ryhmästä) on siirrettävä aktiiviseen kohtaan, jotta voidaan viimeistellä substraatin muuntaminen tuotteeksi ja entsyymin regenerointi.

Voidaan esittää koko entsymaattinen reaktio kahtena kytkentäreaktiona:

S 1 + EX 1 ⟶ S 1 EX 1 ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {{S1}+ EX1 -> S1EX1 -> {P1}+ EP2}}}}

(1)

S 2 + EP 2 ⟶ S 2 EP 2 ⟶ P 2 + EX 2 {\displaystyle {\ce {{S2}+ EP2 -> S2EP2 -> {P2}+ EX2}}}}

(2)

Reaktiosta (1) voidaan nähdä, että aktiivisen entsyymin ryhmä X1 esiintyy tuotteessa, mikä johtuu entsyymin sisällä tapahtuvan vaihtoreaktion mahdollisuudesta välttää sekä sähköstaattinen inhibitio että atomien repulsio. Aktiivinen entsyymi on siis entsymaattisen reaktion voimakas reaktantti. Reaktio (2) osoittaa substraatin epätäydellistä muuntumista, koska sen ryhmä X2 jää entsyymin sisään. Tätä lähestymistapaa oli aiemmin ehdotettu hypoteettisen erittäin korkean entsymaattisen konversion (katalyyttisesti täydellinen entsyymi) perusteella.

Tämän lähestymistavan todentamisen kannalta ratkaisevaa on, että katalyytin on oltava entsyymin ja reaktion siirtoryhmän kompleksi. Tätä kemiallista näkökohtaa tukevat useiden entsymaattisten reaktioiden hyvin tutkitut mekanismit. Tarkastellaan peptidisidoksen hydrolyysireaktiota, jota katalysoi puhdas proteiini α-kymotrypsiini (entsyymi, joka toimii ilman kofaktoria), joka on hyvin tutkittu seriiniproteaasien perheen jäsen, ks.

Esitämme kokeelliset tulokset tästä reaktiosta kahtena kemiallisena vaiheena:

S 1 + EH ⟶ P 1 + EP 2 {\displaystyle {\ce {{S1}+ EH -> {P1}+ EP2}}}}}

(3)

EP 2 + H – O – H ⟶ EH + P 2 {\displaystyle {\ce {{EP2}+ {H-O-H}-> {EH}+ P2}}}}

(4)

jossa S1 on polypeptidi, P1 ja P2 ovat tuotteita. Ensimmäinen kemiallinen vaihe (3) sisältää kovalenttisen asyylientsyymivälituotteen muodostumisen. Toinen vaihe (4) on deasylaatiovaihe. On tärkeää huomata, että ryhmä H+, jota alun perin esiintyy entsyymissä, mutta ei vedessä, esiintyy tuotteessa ennen hydrolyysivaihetta, joten sitä voidaan pitää entsymaattisen reaktion lisäryhmänä.

Reaktio (3) osoittaa siis, että entsyymi toimii reaktion voimakkaana reagoijana. Ehdotetun konseptin mukaan entsyymin H-kuljetus edistää ensimmäisen reaktantin muuntumista, ensimmäisen alkuperäisen kemiallisen sidoksen hajoamista (ryhmien P1 ja P2 välillä). Hydrolyysivaihe johtaa toisen kemiallisen sidoksen hajoamiseen ja entsyymin regeneroitumiseen.

Ehdotettu kemiallinen mekanismi ei riipu substraattien tai tuotteiden pitoisuudesta väliaineessa. Niiden konsentraation muutos aiheuttaa kuitenkin pääasiassa vapaan energian muutoksia reaktioiden (1) ja (2) ensimmäisessä ja viimeisessä vaiheessa johtuen jokaisen molekyylin, olipa kyseessä S tai P, vapaan energiasisällön muutoksista vesiliuoksessa.Tämä lähestymistapa on sopusoinnussa seuraavan lihassupistuksen mekanismin kanssa. ATP:n hydrolyysin viimeinen vaihe luurankolihaksessa on tuotteen vapautuminen, joka johtuu myosiinipäiden liittymisestä aktiiniin. Aktiinia sitovan raon sulkeutuminen assosiaatioreaktion aikana on rakenteellisesti kytköksissä myosiinin aktiivisen keskuksen nukleotidia sitovan taskun avautumiseen.

Periaatteessa ATP:n hydrolyysin loppuvaiheisiin kuuluu fosfaatin nopea vapautuminen ja ADP:n hidas vapautuminen.Fosfaattianionin vapautumista sitoutuneesta ADP-anionista vesiliuokseen voidaan pitää eksergonisena reaktiona, koska fosfaattianionilla on pieni molekyylimassa.

Siten päädymme siihen johtopäätökseen, että epäorgaanisen fosfaatin H2PO4- primäärinen vapautuminen johtaa siihen, että merkittävä osa ATP:n hydrolyysin vapaasta energiasta muuttuu liuenneen fosfaatin kineettiseksi energiaksi, jolloin syntyy aktiivinen virtaus. Tämä oletus paikallisesta mekaanis-kemiallisesta transduktiosta on sopusoinnussa Tiroshin lihassupistuksen mekanismin kanssa, jossa lihasvoima on peräisin ATP:n hydrolyysin synnyttämän aktiivisen virtauksen integroidusta vaikutuksesta.