Materiaalit ja menetelmät
Hankimme hyväksynnän ilmavoimien tutkimuslaboratorion ihmisten suojelun institutionaaliselta arviointilautakunnalta, protokollanumero FWR20180101H. Koehenkilöt perehdytettiin yksilöllisesti ja allekirjoittivat suostumusasiakirjat, jotka kolmas osapuoli todisti. Näytteet kerättiin viideltä koehenkilöltä käyttäen Epicentre Catch-All™ Sample Collection Swab -näytteenottopyyhettä (Epicentre, Madison, WI) ja Isohelix GeneFiX™ Saliva DNA Collection Kit -näytteenottosarjaa (Isohelix, Kent, UK). Kaikki kerätyt näytteet kerättiin samana päivänä siten, että kunkin näytteenoton välillä oli vähintään 30 minuuttia, tai osallistujien aikataulurajoitusten vuoksi kolmen päivän aikana. Kutakin koehenkilöä kohden kerättiin kaksi pyyhkäisynäytettä; kutakin pyyhkäisynäytettä hierottiin kummankin posken sisäpuolta vasten 10-15 sekunnin ajan. Kuusi sylkinäytettä kerättiin: valmistajan ohjeiden mukaisesti välittömästi vesijuoman ottamisen, lounaan syömisen, hiilihappoisen virvoitusjuoman juomisen, urheilujuoman juomisen tai kahvin juomisen jälkeen.
Pyyhkäisynäytteiden uuttamiseen käytettiin Epicentre QuickExtract™ DNA Extraction Solution 1.0:ta (Epicentre). Ensimmäinen pyyhkäisy käsiteltiin sellaisenaan ja toinen puhdistettiin Wizard™ SV Genomic DNA Purification System -järjestelmällä (Promega, Madison, WI) käyttäen mikrosentrifugointiprotokollaa genomisen DNA:n puhdistamiseksi kudosviljelmien solulysaateista. Solujen pesuvaihetta ei suoritettu, koska näytteet olivat jo liuoksessa. Sylkinäytteet uutettiin QIAamp Blood DNA Mini Kitillä (Qiagen, Valencia, CA) käyttäen valmistajan muokattua syljen uuttoprotokollaa.
Näytteet kvantifioitiin NanoDrop 1000:lla (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ja Qubit 4.0:lla (Thermo Fisher Scientific), jossa käytettiin Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kitiä. NanoDrop-laitetta käytettiin myös näytteiden puhtauden arviointiin vertaamalla absorbanssiarvoja 260 ja 280 nm:ssä (A260/A280). Molempia käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutetut näytteet, jotka normalisoitiin 10 ng/μL:aan Qubit-pitoisuuksien perusteella, analysoitiin käyttämällä 2 % E-Gel® Precast Agarose Gel -geeliä (Thermo Fisher Scientific). Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) yhdessä High Sensitivity DNA Chip -laitteen kanssa käytettiin uutetun DNA:n laadun määrittämiseen.
Näytteet analysoitiin sen jälkeen Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System -laitteella (Applied Biosystems, Foster City, CA), jotta voitiin testata kaksi geneettistä merkkiainetta, jotka on yhdistetty maapähkinäallergioihin: rs7192 ja rs9275596 . Genotyypin määrityksessä käytettiin nopeaa ramppia ennen polymeraasiketjureaktiota (PCR), jonka asetus oli 60 °C 1 minuutin ajan, pitosykliä 95 °C:ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan, sitten 60 °C:ssa 1 minuutin ajan ja post-PCR 60 °C:ssa 1 minuutin ajan. Käytettiin TaqPath ProAmp Master Mix -seosta (Thermo Fisher Scientific). Yksinukleotidipolymorfismimäärityksiä (SNP) käytettiin puolet valmistajan suosittelemasta pitoisuudesta. Lopullinen tilavuus oli 10 µl.
Tulokset
QuickExtract-liuosta käyttävällä pyyhkäisyn uuttomenetelmällä saatiin suuri määrä DNA:ta. Pyyhkäisystä ilman jatkokäsittelyä saadut DNA:n arvot vaihtelivat 1,38 ja 54,2 pg/µL välillä Bioanalysaattorilla määritettynä (lisätiedosto 1: taulukko S1). Aiemmat raportoimattomat tulokset laboratoriostamme osoittivat kuitenkin, että sekvensointikokeet estyivät, kun kirjastot valmistettiin suoraan QuickExtract-liuosuutteista. Siksi puhdistimme nämä näytteet käyttäen Wizard-pylvään puhdistusprotokollaa, jolloin konsentraatio pieneni odotetusti (vaihteluväli 2,59-38,2 pg/µl) ja A260/A280-suhteet paranivat lähemmäs yleisesti hyväksyttyä vaihteluväliä (1,8-2,1).
Valmistajan protokollan mukaisesti kerättyjen ja QIAamp Blood DNA Kit -paketin avulla uutettujen spitaalinäytteiden pitoisuus vaihteli välillä 1,01 ng/µl-8,20 ng/μl. A260/A280-mittauksen osoittama puhtaus oli tyypillisesti DNA:n osalta vaihteluväliä (ks. lisätiedosto 1: taulukko S1). Yhdessäkään sylkinäytteessä, joka kerättiin sen jälkeen, kun koehenkilöt olivat juoneet erilaisia juomia tai syöneet lounasta, ei havaittu DNA-pitoisuuksia ja puhtauslukemia, jotka erosivat merkittävästi valmistajan protokollaa käyttäen kerätyistä näytteistä (30 minuutin paasto) (kuva 1).
Näytteiden pitoisuudet kolmella eri kvantifiointimenetelmällä (Nanodrop, Qubit ja Bioanalyzer) ja puhtausarvio 260 ja 280 nm:n absorbanssin suhteen perusteella. ”CatchAll”-olosuhteet ovat kaksi pyyhkäisynäytteenottoa ja ”Genefix”-olosuhteet ovat kuusi syljenäytteenottoa. Pyyhkäisynäytteiden pitoisuudet on esitetty vasemmalla y-akselilla ja sylkinäytteiden pitoisuudet oikealla y-akselilla. Käytettiin kahta akselia, koska pyyhkäisynäyte ilman jälkipuhdistusta (CatchAll + QuickExtract) sisältää epäpuhtauksia, jotka absorboituvat 260 nm:ssä Nanodropissa. *p < 0,05, ***p < 0,001
Extraktoidut näytteet, jotka on normalisoitu 10 ng/μL:aan Qubit 4.0 -lukemien perusteella, ajettiin 2-prosenttisella E-Gel-geelillä, jossa käytettiin 1 kb:n tikapuita (Lisätiedosto 1: Kuva S1). Odotimme näkevämme geelin yläosassa kaistan, joka edustaa korkean molekyylipainon DNA-uutetta. Odotetusti eri syljenkeruumenetelmistä uutettu DNA oli suurimolekyylipainoista. Vaikka näytteet normalisoitiin 10 ng/µl:n tuloon, useimmissa näytepyyhkäisynäytteissä ei syntynyt selkeää kaistaa, mikä viittaa joko varauksen häiritseviin tekijöihin tai johonkin muuhun systemaattiseen ongelmaan.
Tarkempi koko- ja puhtausanalyysi Bioanalysaattorilla osoitti, että kaikissa näytteissä ja kaikissa olosuhteissa oli pääasiassa korkean molekyylipainon DNA:ta ja että niiden konsentraatiot olivat samankaltaisia (kuva 2). Lukuun ottamatta edellä mainittua matalaa konsentraatiota pyyhkäisyuutteen puhdistuksen jälkeen, DNA:n laadussa, koossa tai konsentraatiossa ei ole mitään keräystilanteeseen (syöminen tai juominen) liittyviä suuntauksia, jotka tulisivat esiin analysoitaessa elektropherogrammin signaaleja. Aiheesta riippuvaista muutosta näyttäisi kuitenkin olevan, vaikka tätä ilmiötä ei tutkittu tarkemmin.
Bioanalysaattorin elektropherogrammijäljet sylkinäytteistä. Kaikkien koehenkilöiden kaikista uutetuista näytteistä saatiin onnistuneesti käyttökelpoisia tuloksia kahden maapähkinäallergiaan liittyvän SNP:n genotyypitystä varten , lukuun ottamatta yhtä puhdistetuista pyyhkäisynäytteistä (koehenkilö 5B).
Allelisen erottelun plotit rs7192:lle ja rs9275596:lle. X tarkoittaa näytettä, joka ei monistunut (koehenkilö 5B). Punaiset/alimmaiset näytteet ovat homotsygootteja alleelin 1 suhteen (X-akseli), vihreät/keskimmäiset näytteet ovat heterotsygootteja ja siniset/vasemmat näytteet ovat homotsygootteja alleelin 2 suhteen (Y-akseli)
Keskustelua
Geettisen tutkimustutkimuksen, kaupallisen tuotteen tai terveydenhuoltotoimenpiteen suunnittelussa käytettävyys ja loppukäyttäjän vaatimustenmukaisuus ovat kaksi kriittistä näkökohtaa. Ihopistoja vaativien verenkeräyslaitteiden käyttömukavuus voi olla vähäisempää kipua kohtaan tunnetun vastenmielisyyden vuoksi. Laboratoriossamme tekemiemme havaintojen perusteella olemme anekdoottisesti havainneet, että tutkimuksiin osallistuvien määrä on vähentynyt, kun ensisijaisena erona on laskimopisto ja sylkinäytteenotto. Emme ole tehneet kontrolloitua tutkimusta tämän ilmiön tutkimiseksi, vaan olemme valinneet sylkinäytteenoton helppokäyttöisyyden, ilmoittautumisaktiivisuuden ilmeisen lisääntymisen ja laboratoriossamme pääasiassa tehtävien tutkimusten tyypin perusteella. Koska tutkimuksissamme sylkinäytteenotto tapahtuu itse, pyrimme määrittämään, onko DNA:n määrä ja laatu riittävän suuri, jotta sitä voidaan käyttää myöhemmissä molekyylisovelluksissa erilaisten todennäköisten kenttäkeräysolosuhteiden, ensisijaisesti erilaisten elintarvikkeiden ja juomien nauttimisen, jälkeen. Tutkimusasetelman tarkoituksena ei ollut vertailla yksilöiden välisiä vertailuja, vaan pikemminkin pyrimme vertailemaan näytteenoton koehenkilön sisäistä vaihtelua. Tätä tavoitetta silmällä pitäen emme havainneet merkittävää vähenemistä DNA:n määrässä, joka johtui poikkeamisesta valmistajan ohjeista paastota 30 minuuttia ennen näytteenottoa.
Vaikka DNA:n määrä on tärkeä, kehittyneiden molekyylibiologisten tekniikoiden kannalta kriittisempää on saadun DNA:n laatu. Tutkimuksessamme havaitsimme, että sylkinäytteiden kerääminen syömisen ja juomisen jälkeen ei vaikuttanut korkean molekyylipainon DNA:n saantoon. Tällainen DNA on ratkaisevan tärkeää seuraavan sukupolven sekvensointia, array-skannausta ja PCR-genotyypin määritystä varten. Lisäksi kokeellinen testi, jossa käytettiin kahta toisistaan riippumatonta geneettistä kohdetta PCR-genotyypityksessä, osoitti, että nämä näytteet soveltuivat molekyylianalyyseihin.
Tarkoituksemme tässä tutkimuksessa oli selvittää, vaikuttaisiko syljen DNA:n keräyspakkauksella kerätyn syljen DNA:n laatuun ja määrään se, jos ei noudatettaisi valmistajan ohjeita eli juominen tai syöminen juuri ennen keräystä. Hypoteesimme mukaisesti emme havainneet eroa eristetyn DNA:n määrässä tai laadussa.
Johtopäätökset
Genetiikkatutkimukset ovat laajentuneet puhtaasti tieteellisen toiminnan ulkopuolelle, ja ne ovat nykyään yleisiä kuluttajien keskuudessa. Jotta ihmisnäytteet voitaisiin optimoida näitä tutkimuksia varten, valmistajat pyrkivät kehittämään yksinkertaisia ja vankkoja keräysmenetelmiä. Sylkinäytteenotto on näistä menetelmistä vähiten invasiivinen, tuottaa korkealaatuista DNA:ta ja tarjoaa erinomaisen tuotevakauden. Tutkimuksemme syljestä eri juomien ja/tai välipalojen nauttimisen jälkeen saadusta DNA:sta on osoittanut, että Isohelix GeneFiX Saliva DNA Collection Kitillä (Isohelix) kerätyn DNA:n määrässä ja laadussa ei ole merkittävää eroa, kun näytteitä ei kerätä valmistajan protokollan mukaisesti. Vaikka tämän tutkimuksen otoskoko on pieni, laboratoriomme muissa tutkimuksissa tehdyt havainnot ovat yhdenmukaisia tässä esitettyjen systemaattisen vertailun tulosten kanssa. Näin ollen voimme päätellä, että syljen kerääminen on vankka, ei-invasiivinen tapa kerätä näytteitä sekä laboratoriossa että kentällä, ja 30 minuutin pidättäytymisvaatimus ruoasta ja juomasta on ihanteellinen eikä ehdoton.