El oxígeno (O2) se desarrolla durante el transporte de electrones fotosintético cuando el agua es dividida por el complejo de evolución del oxígeno para proporcionar protones y electrones a la cadena de electrones del cloroplasma, generando así ATP y NADPH, la fuente de energía y poder reductor del metabolismo de la planta. La mayor parte de esta energía química se utiliza para impulsar el metabolismo fotosintético del carbono, que consiste en la carboxilación de la ribulosa-1,5-bisfosfato (ciclo de reducción del carbono fotosintético) y la oxigenación (ciclo de oxidación del carbono fotosintético); con un requerimiento combinado de electrones = JA. Se requieren cuatro electrones por cada O2 evolucionado, de modo que la producción bruta de O2 (GOP) está relacionada con el transporte lineal de electrones (J) según J/4. Cuando el transporte lineal de electrones se utiliza sólo para impulsar la fijación de CO2, el consumo de O2 y la liberación de CO2 por la oxidación fotosintética del carbono y la respiración mitocondrial es tal que la producción neta de O2 (NOP) es igual a la asimilación neta de CO2 (Anet; siempre que el cociente respiratorio sea 1, pero véase Tcherkez et al, 2017).
Además, los electrones pueden utilizarse para el transporte alternativo no cíclico de electrones (ANCET), incluyendo, por ejemplo, la fotorreducción del propio O2 formando especies reactivas de oxígeno (reacciones de Mehler-peroxidasa o «ciclo agua-agua»; Asada, 1999), el anabolismo cloroplástico (por ejemplo, lípidos; Stumpf et al, 1963), la reducción de oxaloacetato a malato (que se exporta a la mitocondria; Scheibe, 2004), y la asimilación de nitrógeno (Bloom et al., 1989). Se ha planteado la hipótesis de que la ANCET es una forma de regular la relación ATP/NADPH para satisfacer las cambiantes demandas de energía del metabolismo celular y como un mecanismo para prevenir el fotodaño mediante la utilización de un exceso de reductor cuando la densidad de flujo de fotones excede el requerimiento de energía para la fijación de CO2 (por ejemplo, bajo alta irradiación, temperaturas frías, estrés hídrico que cierra los estomas; por ejemplo, Badger, 1985; Ort y Baker, 2002; Robinson, 1988). Es importante destacar que no hay evidencia formal de cómo interactúan los flujos de electrones, particularmente bajo condiciones de luz fluctuante (Morales et al., 2018).
Como ANCET permite sostener mayores tasas de transporte lineal de electrones, el transporte total de electrones (Jt) será mayor que JA. Por el contrario, el efecto sobre la captación de O2 dependerá de la vía metabólica implicada. Por ejemplo, en las reacciones de Mehler-peroxidasa, no hay un cambio neto en el O2 por lo que NOP permanecerá igual a Anet. Pero en la reducción del nitrato, la relación entre la producción de O2 ligado al N y el consumo de O2 depende en gran medida del aminoácido sintetizado (Noctor y Foyer, 1998). En este caso, NOP no siempre será igual a Anet porque el O2 y el CO2 pueden no estar equilibrados en el metabolismo (Skillman, 2008). En consecuencia, las mediciones concomitantes de los flujos de CO2 y O2 son importantes para entender cómo las plantas regulan el uso de la energía de la luz, con diferentes destinos que tienen resultados metabólicos muy diferentes.
Las primeras mediciones de la evolución del O2 no pudieron distinguir la GOP de la captación de O2 (Hill, 1937). El método de espectrometría de masas establecido por Mehler y Brown (1952) resolvió este problema empleando trazadores de isótopos de O2 para monitorizar independientemente los flujos de 16O2 y 18O2. En este método, se suministraba 18O2 puro al espacio de cabeza de gas de una cámara cerrada, y la disminución de 18O2 se atribuía a la captación de O2. El O2 evolucionado tiene la misma composición isotópica que el agua a partir de la cual se genera; en este caso, el isótopo dominante en el agua era el 16O (Fig. 1). El enfoque de etiquetado con 18O se aplicó posteriormente a discos de hoja (por ejemplo, Tourneux y Peltier, 1995), hojas enteras extirpadas (por ejemplo, Volk y Jackson, 1972) y plantas enteras (Gerbaud y André, 1980), iluminando el destino del O2 in vivo.
Representación simple de las reacciones que pueden estar involucradas en la producción y captación bruta de O2 de una célula fotosintetizadora, mostrando cómo el agua etiquetada con 18O resulta en la producción de 18O2 en el enfoque desarrollado por Gauthier et al. (2018). En el caso de las reacciones dentro del peroxisoma y la mitocondria, esto solo representa el consumo neto de O2, es decir, se produce tanto la captación como la liberación. PSII, fotosistema II; PSI, fotosistema I; Fd, ferredoxina; M, reacción de Mehler; PCR, reducción del carbono fotosintético; PCO, oxidación del carbono fotosintético; PGA, 3-fosfoglicerato; P-Glyc, fosfoglicolato; Glyox, glioxilato; OAA, oxaloacetato; Mal, malato.
La limitación de los sistemas cerrados de intercambio de gases es que las mediciones sólo pueden realizarse durante cortos períodos de tiempo (de segundos a minutos) antes de que se agote la concentración de CO2. En consecuencia, la relación CO2:O2 no es constante, lo que modifica las tasas relativas de carboxilación y oxigenación, de modo que las estimaciones de la captación de GOP y O2 serán inexactas. Esta limitación se superó en el enfoque de la espectrometría de masas sustituyendo el CO2 consumido mediante la entrada periódica de CO2 en la cámara, lo que permitió una cuantificación en estado estacionario y amplió la capacidad de medir los flujos de O2 en una serie de condiciones y estados fisiológicos (Canvin et al., 1980). Al mismo tiempo, se estaban produciendo avances en el uso de la fluorescencia de la clorofila, que proporciona información sobre el rendimiento cuántico del PSII (Baker, 2008). Genty et al. (1989) proporcionaron el vínculo empírico entre la fluorescencia y la tasa de transporte de electrones, sustituyendo la necesidad de medir directamente la evolución del O2. La fluorescencia de la clorofila es ahora una de las técnicas más populares en la fisiología de las plantas debido a su facilidad de uso y a su coste relativamente bajo. A ello ha contribuido la capacidad de multiplexar las mediciones de fluorescencia con el intercambio de gases de H2O y CO2 en instrumentos portátiles disponibles en el mercado, abriendo la posibilidad de medir la función de las plantas fuera del laboratorio. En consecuencia, las mediciones in vivo de los flujos de O2 han disminuido sustancialmente en los últimos 20 años.
En este número de Plant Physiology, Gauthier et al. (2018) nos recuerdan por qué es tan importante devolver nuestra atención al O2, proporcionándonos un nuevo y elegante sistema de vía abierta para medir los flujos de O2. Su método es un enfoque isotópico «inverso», que implica el etiquetado de 18O del agua de la hoja en lugar del aire, de modo que la composición isotópica del O2 que evoluciona durante la división del agua tiene una firma muy diferente a la del O2 ambiental (Fig. 1). El uso de un enriquecimiento considerable de 18O es imperativo, ya que la contribución de NOP en un fondo de 21% de O2 es probablemente del orden del 0,05% (por ejemplo, 100 μmol mol-1 de NOP/210.000 μmol mol-1 de O2 ambiental), lo que dificulta normalmente la detección precisa de un cambio en el δ18O del O2 asociado a NOP en el aire que rodea a la hoja.
El método sigue siendo muy técnico y requiere el uso de tres instrumentos de alta precisión. La composición isotópica y la concentración de vapor de CO2 y H2O se miden por espectroscopia láser, y el δ18O2 y el δO2/N2 (para estimar la concentración de O2) por espectrometría de masas. También se requiere una cámara hecha a medida para alojar la hoja extirpada y su fuente de agua marcada con 18O, lo que ayuda a evitar fugas a través de las juntas de alrededor del pecíolo. Es importante destacar que el sistema de intercambio de gas abierto mejora la capacidad de lograr mediciones en estado estacionario, y el etiquetado de agua frente al uso de gas puro 18O2 resuelve el problema de la asequibilidad, que ha limitado en gran medida la adopción de sistemas abiertos.
Aunque la fluorescencia de la clorofila se ha convertido en la opción popular para medir la tasa de transporte de electrones, no está exenta de suposiciones. Por ejemplo, con frecuencia se asume que las hojas absorben el 84% de los fotones incidentes y que el 50% de estos fotones son absorbidos por el PSII; sin embargo, este puede no ser siempre el caso (Baker, 2008). Esto puede conducir a una sobreestimación de la tasa de transporte de electrones cuando se calcula a partir de la fluorescencia en comparación con las mediciones de GOP. Además, la determinación precisa de JA es particularmente relevante para la estimación de la conductancia del mesófilo, que fue una aplicación destacada por Gauthier et al. (2018). Las reacciones de Mehler-peroxidasa, que se ha demostrado que oscilan entre el 0% y el 30% (Driever y Baker, 2011), conducirían a una sobreestimación de los flujos de electrones asociados a los ciclos de reducción/oxigenación del carbono fotosintético en ambos métodos. Sin embargo, la ventaja del enfoque de etiquetado isotópico es que la contribución de la reacción de Mehler a la producción bruta de O2 puede cuantificarse mediante el acoplamiento de las mediciones de GOP con NOP (por ejemplo, Furbank et al., 1982; véase la Fig. 1). Ahora que tenemos una capacidad renovada para medir los flujos de O2, estos supuestos no deben ser ignorados.
Además de entender el compromiso entre la eficiencia y la fotoprotección para mejorar la producción agrícola (Murchie y Niyogi, 2011), los diferentes destinos de los electrones tienen importantes implicaciones para entender los flujos globales de O2. En particular, la captación de O2 asociada a la fotorrespiración, la respiración mitocondrial y las reacciones de Mehler-peroxidasa tienen diferentes factores de fraccionamiento isotópico (Guy et al., 1993), por lo que la cuantificación de los flujos de las vías individuales es necesaria para restringir las estimaciones de la producción primaria global a partir de la información de δ18O (Welp et al., 2011).
Ya es hora de que volvamos a medir los flujos de O2, y el nuevo método desarrollado por Gauthier et al. (2018) nos proporciona la capacidad necesaria para hacerlo.