DNEs en la regulación transcripcional
Las DNEs también pueden surgir en el contexto de la regulación transcripcional. Por ejemplo, se puede obtener un DNE eliminando el dominio de transactivación de un TF modular, dejando sólo el dominio de unión al ADN. Este factor truncado puede comportarse como un inhibidor competitivo de la transcripción. Se sabe que esto ocurre en la naturaleza. Por ejemplo, la proteína C/EBP en los mamíferos se expresa como tres polipéptidos alternativos. Los polipéptidos más largos contienen un dominio de activación transcripcional N-terminal, mientras que la forma corta carece de él. Como las isoformas largas y cortas se ensamblan en homo- y heterodímeros, esta última se comporta como un DN natural (Zahnow et al., 1997). Este es también el caso de las Stats 5 y 6 en los vertebrados, que son capaces de dimerizarse. Su procesamiento proteolítico en respuesta a señales fisiológicas conduce a la eliminación del dominio de activación C-terminal y los convierte en potentes inhibidores que regulan negativamente la transducción de señales (Nakajima et al., 2003). En las plantas, un gran número de proteínas MYB funcionan como reguladores transcripcionales. En Arabidopsis, las proteínas que contienen una única repetición de unión al ADN de MYB pero que carecen del dominio de transactivación están implicadas en la especificación de aspectos del destino celular epidérmico. Estas proteínas interactúan con otros TFs, incluidas las proteínas bHLH, y debido a la ausencia de un dominio transactivador, se comportan como DN y trans-DNs formando complejos inactivos (Ramsay y Glover, 2005).
La eliminación del dominio de unión al ADN también puede dar lugar a DNEs. Esto ocurre en los TFs bHLH. Como se ha señalado anteriormente, el gen Id-1 codifica un inhibidor natural de DN de esta familia de TFs. Las proteínas bHLH completas (con dominios de unión al ADN y de dimerización) pueden expresarse de forma constitutiva. Sin embargo, la expresión regulada de Id-1, que contiene sólo el dominio de dimerización, impone la regulación de la actividad de la proteína bHLH (Sun, 1994). También se espera un fenómeno similar en las plantas. Por ejemplo, el genoma de Arabidopsis codifica ∼120 proteínas bHLH que se predice que se unen al ADN y 27 proteínas con una región menos básica que la requerida para la unión (Toledo-Ortiz et al., 2003). Estas HLHs que no se unen al ADN pueden funcionar como las proteínas Id animales, como reguladores negativos de las proteínas bHLH a través de la formación de heterodímeros incapaces de unirse al ADN (Toledo-Ortiz et al., 2003). Se esperan efectos similares en los TFs pertenecientes a la familia del dominio básico/cremallera de leucina (bZIP), que contienen un motivo básico de unión al ADN, un dominio de dimerización de la cremallera de leucina y dominios para la transactivación. Arabidopsis codifica 67 proteínas bZIP, todas las cuales se predice que funcionan como homo- y/o heterodímeros (Deppmann et al., 2004). Algunas de ellas son muy pequeñas y pueden carecer de dominios de activación. En un ejemplo clásico en las plantas, Fukazawa et al. (2000) dilucidaron la función del TF bZIP REPRESIÓN DEL CRECIMIENTO DEL POTENCIAL (RSG) en la señalización de la giberelina mediante el uso de una forma DN de RSG, que carecía de un dominio de activación transcripcional y, por tanto, actuaba para reprimir la función de la proteína de tipo salvaje cuando se expresaba en tabaco transgénico. Además, en consonancia con lo dicho en el apartado dedicado a los trans-DN por sobreexpresión, los complejos de transcripción ADN-proteína también son sensibles al equilibrio de la dosis génica (Birchler et al., 2001; Veitia, 2002). Las alteraciones de este equilibrio por disminución o aumento de la expresión de un TF en relación con otros implicados en el mismo complejo pueden inducir fenotipos anormales.
Un modelo simple de activación transcripcional puede utilizarse para explorar algunas sutilezas cuantitativas de las mutaciones de DN en este contexto. Los estudios de sistemas virales y de Drosophila han demostrado que la transcripción suele mostrar una relación sigmoidal con respecto a la concentración de un TF. En el caso de un sistema que responde a un único tipo de activador (A), esta respuesta sigmoidal puede diseccionarse en dos componentes principales: la unión cooperativa de A al promotor (p) de un gen objetivo y la sinergia (Figura 6). La sinergia es el resultado de las interacciones concertadas entre las moléculas de A ya unidas al promotor y la maquinaria transcripcional (Carey, 1998; Veitia, 2003).
DNEs en la transcripción.
(A) Promotor con dos sitios de unión (triángulos grises) reconocidos de forma cooperativa por el activador A o su forma truncada a, que se comporta como un inhibidor competitivo.
(B) La cooperatividad puede deberse a la atracción concertada de un monómero entrante por A sentado en el ADN y en un sitio de ADN vecino.
(C) Sinergia: dos monómeros sentados en sus sitios de unión al ADN atraerán a la polimerasa (pol) con mucha más fuerza que un solo monómero unido al ADN. La sinergia se interrumpe cuando un monómero carece del dominio de reclutamiento de la polimerasa.
Considere un promotor, p, que contiene dos sitios de unión para A. Los mismos sitios de unión también son reconocidos por la variante a, que podría actuar como un inhibidor competitivo. Suponemos que puede haber cooperatividad durante la interacción entre las moléculas de A con el promotor. Esto también podría ser así para las interacciones entre A, a y el promotor. Una posible fuente de cooperatividad se mencionó anteriormente (es decir, A tiende a formar dímeros en solución, pero esto se potencia durante la unión al ADN). Otra posibilidad es que los monómeros no puedan interactuar en solución y que la interacción de un monómero con el ADN provoque un cambio alostérico que aumente la afinidad del A unido por un monómero entrante. También es posible, aunque menos probable, que no haya interacciones A-A y que la unión de un monómero al ADN provoque un cambio en el sitio vecino que aumente su afinidad por un monómero recién llegado. Cualquiera que sea el caso, la cooperatividad significa que la reacción pA + A = pAA ocurre más fácilmente que p + A = pA.
Debido a la existencia de sinergia, la especie molecular que más contribuye a la transcripción es el promotor ocupado por dos moléculas de activador: pAA. Esto significa también que si la constante de afinidad para la asociación entre el complejo pA y la polimerasa es KpolA, la K para la asociación de pAA y la polimerasa será muy superior a 2K (del orden de K2polA; véase Zlotnick, 1994). Para acomodar la actividad de transactivación parcial en este modelo, utilizaremos Kpola (para la reacción pa + pol) y Kpola2 (para paa + pol). Bajo estas suposiciones, se puede derivar una ecuación para la respuesta transcripcional (TR) como función de la concentración de A (y a), tal y como describen Veitia (2003) y Veitia y Nijhout (2006) (ver Materiales Suplementarios en línea).
Con una ecuación bastante simple en la mano, se pueden explorar varias condiciones: (1) la situación de tipo salvaje A/A, (2) cuando hay un alelo ausente (A/-), y (3) cuando hay coexpresión de A y una versión truncada a que carece del dominio de transactivación. En este último caso, podemos distinguir dos situaciones diferentes (3a) cuando la mutación de a suprime la cooperatividad o (3b) cuando A y a interactúan cooperativamente. Por último, también podemos explorar una situación (4) en la que la capacidad de transactivación de a es normal y la cooperatividad ausente, y (5) cuando la cooperatividad es normal pero la capacidad de transactivación es parcial.
La figura 7 muestra que el TR de a, en relación con la salida máxima del promotor frente a exhibe una relación sigmoidal, que oscila entre 0 y 1. La saturación refleja la respuesta máxima del sistema, pero esto no implica que el promotor funcione sólo en saturación. De acuerdo con la figura, y en general, los valores de la curva para el heterocigoto A/- en cualquier punto son menores que en A/A (para cada valor de relativo , el heterocigoto A/- tiene dos veces menos en términos absolutos que el tipo salvaje). Curiosamente, a bajas concentraciones relativas de A, el desplazamiento entre las curvas es muy pronunciado Y(A/-) es ∼25% de Y(A/A). Sin embargo, como se esperaba intuitivamente, para valores altos de A, la saturación también se alcanza en A/-. Si este sistema fuera normalmente funcional a bajas concentraciones de A, un individuo A/- mostraría un fenotipo típico de haploinsuficiencia.
TR de un promotor (con dos sitios) al activador A solo o coexpresado (en cantidades equimolares) con su forma DN a.
El gráfico representa TR en función de la producción por alelo de A (a) en relación con una salida máxima. La salida en términos de concentraciones de A (a) depende directamente de la fuerza (duración) de una señal que impulsa la producción de A (a). En el caso particular del heterocigoto A/-, para cualquier valor de x, tendrá dos veces menos proteína A que A/A. Así, los valores de TR para el heterocigoto A/- en cualquier punto (azul claro) son menores que en el A/A normal (azul oscuro), pero para valores altos de A se alcanza la saturación. En A/a, cuando a carece de capacidad de transactivación en ausencia de cooperatividad entre A y a, se tiende a alcanzar la saturación con concentraciones crecientes de A y a, ya que el primero tiende a ocupar el promotor reclutando cooperativamente a otras moléculas de A (rosa). Cuando se mantiene la cooperatividad entre A y a, la meseta de la curva para A/a se alcanza a TR = 0,25 (verde), ya que la especie transcripcionalmente activa pAA representa sólo el 25% del total. Cuando hay transactivación residual y la cooperatividad es normal, la meseta de A/a no se alcanza en TR = 1, sino en un nivel inferior (rojo). En consecuencia, la curva de A/a se cruza con la de A/-. Este alelo a es hipomórfico si el sistema funciona normalmente a niveles bajos de saturación de A y a, mientras que es DN para concentraciones más altas. Los parámetros están en los Materiales Suplementarios en línea.
¿Qué ocurre en A/a cuando a carece del dominio de transactivación en ausencia de cooperatividad? Según la definición clásica de DN, la curva es más baja en cualquier punto que la de A/-. Sin embargo, hay una tendencia a alcanzar la saturación con concentraciones crecientes de A y a. De hecho, A tiende a ocupar preferentemente el promotor, ya que asegura las interacciones cooperativas con los monómeros de A entrantes. Sin embargo, es evidente que el reconocimiento del promotor a baja concentración de proteína se produce menos fácilmente en A/a que en la condición de tipo salvaje. En la práctica, un monómero truncado incapaz de asegurar interacciones cooperativas dará lugar a una DNE débil. La situación es completamente diferente en el otro extremo, cuando la cooperatividad entre A y a se mantiene completamente. De hecho, la meseta de la curva para A/a se alcanza en TR = 0,25. Esto se espera porque pAA, que impulsa la transcripción (es decir, las contribuciones de pAa y paa son insignificantes), representa sólo el 25% de la especie de promotor ocupado en la saturación.
Un ejemplo potencial es proporcionado por una mutación artificial en el TF FOXL2. Este TF reprime el promotor del gen regulador agudo esteroidogénico humano, que contiene múltiples sitios de unión putativos. Una versión de FOXL2 que contiene el dominio de unión al ADN pero que carece del dominio C-terminal es capaz de inducir una DNE que perjudica la represión transcripcional. Sin embargo, este efecto se obtiene sólo cuando la versión DN se expresa mucho más fuertemente (5× y 10×) que la proteína de tipo salvaje (Pisarska et al., 2004). Como se ha señalado anteriormente, esto puede deberse a la ausencia de interacciones cooperativas entre las moléculas de FOXL2 en este promotor.
Un ejemplo más revelador se proporciona en la Figura 8, que representa la respuesta de dos promotores diferentes que contienen uno o dos sitios de unión para el TF PTX2a y su versión DN, como se ha descrito anteriormente (Saadi et al., 2003. A bajas cantidades de ADN transfectado (0,05 μg en la Figura 8), la respuesta del promotor con dos sitios es más de dos veces más fuerte (es decir, 3×) que la respuesta del promotor con un solo sitio. Esta es la firma combinada de la cooperatividad y la sinergia. Además, a altas concentraciones de transfección de las construcciones WT+DN, el TR del promotor con dos sitios de unión es ∼25% de la respuesta del tipo salvaje solo. Esto es esperado porque a una alta concentración de proteína los dímeros pueden ser preensamblados incluso antes de alcanzar el ADN objetivo. En este caso, sólo el 25% de los dímeros serán normales. La caída del TR es menos dramática para el promotor con un solo sitio de unión (se espera un 50%). Desde un punto de vista práctico, para evitar pasar por alto un potencial DNE en los experimentos in vitro, deberían transfectarse cantidades bajas de las construcciones WT+DN con un exceso de promotor reportero para evitar su saturación por la forma de tipo salvaje. De forma más general, deberían proporcionarse curvas de respuesta para diferentes concentraciones de TF para tales experimentos de transfección.
Respuesta de dos promotores artificiales diferentes (p) que contienen uno o dos sitios de unión similares a los bicoides para el TF PITX2a y su versión DN (K88E).
Líneas sólidas: actividad del promotor (sistema reportero de luciferasa) en presencia del TF de tipo salvaje. Líneas punteadas: coexpresión del tipo salvaje y su versión DN. Obsérvese cómo a bajas cantidades de ADN transfectado, la respuesta del promotor con dos sitios es >2 veces más fuerte (es decir, 3×) que la respuesta del promotor con un solo sitio debido a la cooperatividad y la sinergia. Como se predijo, a altas cantidades de construcciones WT+DN, el TR del promotor con dos sitios de unión es ∼25% de la respuesta del tipo salvaje solo. La caída de TR es, como se esperaba, menos dramática para el promotor con un solo sitio de unión. Reproducido y modificado con permiso de los autores y de Molecular and Cellular Biology and the American Society for Microbiology (Saadi et al., 2003).
Como se esperaba intuitivamente, cuando la capacidad de transactivación de a es normal y la cooperatividad ausente, aparece una DNE muy leve que conduce a un comportamiento cercano a un alelo nulo en estado heterocigoto. El aislamiento de este tipo de mutantes es posible mediante un elegante cribado genético en levadura descrito por Burz y Hanes (2001). Una mutación puede afectar a los niveles de cooperatividad de forma menos dramática. Un caso interesante se da cuando la cooperatividad desciende a aproximadamente una décima parte del nivel normal (según los parámetros subyacentes a los resultados presentados en la Figura 7) y la capacidad de transactivación es normal. En estas condiciones, la variante a se comporta como un alelo hipomórfico en el homocigoto a/a y como un alelo nulo en A/a (es decir, A/a = A/-; datos no mostrados). Esto subraya de nuevo la falta de límites distintos entre los alelos hipomorfos, DN y nulos.
Cuando hay transactivación residual (es decir, 1<Kpola<KpolA) y la cooperatividad es normal, la meseta en A/a no se alcanza en TR = 1 sino en un nivel inferior. En algunos casos se pueden producir fácilmente alelos con capacidad de activación parcial. El paradigma lo proporciona el TF Gal4 de levadura, que contiene dos regiones activadoras (ARI y ARII) implicadas en el reclutamiento de la maquinaria transcripcional. Las deleciones en la región ácida ARII conducen a una disminución de la capacidad de transactivación (Ptashne y Gann, 2002; Ptashne, 2007). Una combinación de dicho alelo con el Gal4 de tipo salvaje debería comportarse como se describe. Como se muestra en la Figura 7, la curva de A/a se cruza con la de A/-. Así, el mismo alelo puede ser hipomórfico si el sistema funciona a niveles de saturación bajos (antes de que las curvas se crucen entre sí) y puede ser DN en términos moleculares a concentraciones de proteína más altas. Se puede dar una explicación intuitiva. Consideremos, por ejemplo, una proteína a que interactúa con la polimerasa con, digamos, el 90% de la fuerza del tipo salvaje. Para un rango de concentraciones, el heterocigoto A/a tenderá a comportarse como A/A. Sin embargo, en la saturación, sólo el 25% de la especie promotora será pAA, que interactúa con la polimerasa con la máxima fuerza. Por el contrario, en un heterocigoto A/-, a bajas concentraciones de proteína es más difícil ocupar el promotor, mientras que a la saturación el 100% de las especies del promotor serán pAA. Por lo tanto, las curvas para A/a y A/- deben intersecarse en algún punto.
Todos los promotores objetivo dentro de una célula no son igualmente sensibles a un DN TF. Cuando hay una fuerte cooperatividad y sinergia, la sensibilidad de un promotor a una proteína DN debería depender del número de sitios de unión en el ADN. El caso más sencillo de visualizar es cuando a carece de un dominio de transactivación pero interactúa cooperativamente con A. Si la especie de promotor que impulsa la transcripción es la que está totalmente cargada con la proteína de tipo salvaje, como se ha supuesto anteriormente, el TR máximo puede calcularse utilizando la fórmula (de las probabilidades binomiales) que se da en los Materiales Suplementarios en línea. Para un promotor con dos sitios de unión idénticos, el TR máximo será del 25% con respecto a la salida de la condición de tipo salvaje: para tres sitios de unión, el 12,5%, y para cuatro sitios de unión, el 6,25% (cuando A y a se expresan en concentraciones equimolares). Para situaciones más complejas, la respuesta no es intuitiva y requiere el análisis de modelos no tratados aquí.