El Laboratorio Berg

Esta guía es una adaptación del Programa de Biología General para Profesores de Ciencias del Departamento de Bioquímica y Biofísica Molecular de la Universidad de Arizona: Drosophila Melanogaster and Mendelian Genetics, de Pete Geiger.

Una introducción a Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster es una mosca pequeña y común que se encuentra cerca de la fruta inmadura y podrida. Se ha utilizado durante más de un siglo para estudiar la genética y el comportamiento. Thomas Hunt Morgan fue el principal biólogo que estudió la Drosophila a principios del siglo XX. Fue el primero en descubrir el enlace sexual y la recombinación genética, lo que situó a la pequeña mosca en la vanguardia de la investigación genética. Debido a su pequeño tamaño, su facilidad de cultivo y su corto tiempo de generación, los genetistas han estado utilizando la Drosophila desde entonces.

Las moscas de la fruta se obtienen fácilmente de la naturaleza y muchas empresas de ciencias biológicas tienen una variedad de mutaciones diferentes. Además, estas empresas venden todo el equipo necesario para cultivar las moscas. Los costes son relativamente bajos y la mayoría de los equipos pueden utilizarse año tras año. Hay una variedad de ejercicios de laboratorio que uno podría comprar, aunque la necesidad de hacerlo es cuestionable.

¿Por qué usar Drosophila?

Los profesores deberían usar moscas de la fruta para los estudios genéticos de la escuela secundaria por varias razones:
1. Son pequeñas y fáciles de manipular.
2. Pueden ser fácilmente anestesiadas y manipuladas individualmente con equipos poco sofisticados.
3. Son sexualmente dimórficas (los machos y las hembras son diferentes), por lo que es bastante fácil diferenciar los sexos.
4. Las moscas de la fruta vírgenes son físicamente distintas de las adultas, por lo que es fácil obtener machos y hembras vírgenes para los cruces genéticos.
5. Las moscas tienen un tiempo de generación corto (10-12 días) y se desarrollan bien a temperatura ambiente.
6. El cuidado y cultivo de las moscas de la fruta requiere poco equipo, es de bajo coste y utiliza poco espacio incluso para grandes cultivos.

Al utilizar Drosophila, los estudiantes:
1. Comprender la genética mendeliana y la herencia de los rasgos
2. Sacar conclusiones de los patrones de herencia a partir de los datos obtenidos
3. Construir trampas para capturar poblaciones silvestres de D. melanogaster
4. Comprender el ciclo vital de D. melanogaster, un insecto que presenta una metamorfosis completa
5. Construir cruces de moscas capturadas y conocidas de tipo salvaje y mutadas
6. Aprender técnicas para manipular las moscas, sexarlas y mantener notas concisas en el diario
7. Aprender técnicas de cultivo para mantener las moscas sanas
8. Darse cuenta de que muchos experimentos científicos no pueden realizarse y concluirse en una o dos sesiones de laboratorio

Estándares nacionales cubiertos en estas lecciones:
Contenido:
1. Los organismos requieren un conjunto de instrucciones para especificar los rasgos (herencia)
2. La información hereditaria se localiza en los genes.
3. Las combinaciones de rasgos pueden describir las características de un organismo.

Objetivos de los estudiantes:
1. Identificar preguntas y conceptos que guían las investigaciones científicas
2. Diseñar y llevar a cabo investigaciones científicas
3. Formular y revisar explicaciones y modelos científicos utilizando la lógica y las pruebas
4. Comunicar y defender un argumento científico

La genética de Drosophila está bien documentada y varios sitios web de dominio público presentan el genoma completo anotado. Por lo tanto, aquellos profesores o estudiantes que deseen ver dónde se producen sus mutaciones tienen una referencia lista disponible.

Dado que Drosophila ha sido tan ampliamente utilizada en genética, hay muchos tipos diferentes de mutaciones disponibles para comprar. Además, el estudiante atento puede encontrar mutaciones dentro de sus propios cultivos silvestres ya que, debido a un corto tiempo de generación, las mutaciones son relativamente comunes en comparación con otras especies animales.
Clasificación
Dominio: Eukarya
Reino: Animalia
Phylum: Arthropoda
Clase: Insecta
Orden: Dípteros
Familia: Drosophilidae
Género: Drosophila («amante del rocío»)
Especie: melanogaster («tripa oscura»)
Ciclo vital de Drosophila melanogaster
Drosophila melanogaster presenta un metamorfismo completo, lo que significa que el ciclo vital incluye un huevo, una forma larvaria (parecida a un gusano), una pupa y finalmente la emergencia (eclosión) como adulto volador. Es lo mismo que la conocida metamorfosis de las mariposas. La fase larvaria tiene tres instares o mudas.

Día 0: La hembra pone los huevos
Día 1: Los huevos eclosionan
Día 2: Primer instar (un día de duración)
Día 3: Segundo instar (un día de duración)
Día 5: Tercer y último instar (dos días de duración)
Día 7: Las larvas comienzan la fase de vagabundeo. La pupariación (formación de la pupa) se produce 120 horas después de la puesta de huevos
Día 11-12: Eclosión (los adultos emergen de la caja de la pupa).

Las hembras alcanzan la madurez sexual 8-10 horas después de la eclosión

– El tiempo de generación de Drosophila melanogaster varía con la temperatura. El ciclo anterior es para una temperatura de unos 22°C (72°F). Las moscas criadas a una temperatura más baja (a 18°C, o 64°F) tardarán aproximadamente el doble de tiempo en desarrollarse.
– Las hembras pueden poner hasta 100 huevos/día.
– Las hembras vírgenes son capaces de poner huevos; sin embargo, serán estériles y poco numerosas.

Después de que los huevos eclosionen, deberían ser visibles pequeñas larvas en el medio de cultivo. Si su medio es blanco, busque la pequeña zona negra (los ganchos de la boca) en la cabeza de las larvas. Algunos medios premezclados secos son azules para ayudar a identificar las larvas, pero no es necesario y, con un poco de paciencia y práctica, las larvas se ven fácilmente. Además, a medida que las larvas se alimentan, alteran la superficie lisa del medio y, por lo tanto, con sólo mirar la superficie se puede saber si hay larvas. Sin embargo, siempre es una buena idea volver a comprobarlo con un microscopio estereoscópico. Después del tercer instar, las larvas comenzarán a migrar hacia arriba en el vial de cultivo para pupar.

Cuidado, mantenimiento y manipulación de Drosophila

Introducción
Para incorporar las moscas de la fruta en el aula, será necesario mantener cultivos de moscas para su manipulación en cruces y como reserva para cualquier percance que pueda ocurrir. El cultivo es muy sencillo y se recomienda que los alumnos mantengan sus propios cultivos de moscas. De esta manera, cada estudiante o grupo sería directamente responsable del cuidado y mantenimiento a largo plazo de las moscas, incluyendo la realización de grandes poblaciones de cultivo para sus cruces. Cuando se involucran directamente, los estudiantes adquieren competencia y una mayor comprensión de los requisitos y el comportamiento de las moscas. El profesor debe permanecer como entrenador, no como conferenciante, asistiendo a los estudiantes en las técnicas. El instructor necesita mantener cultivos de reserva de todas las cepas y mutantes utilizados por los estudiantes en caso de que ocurra el mencionado incidente imprevisible y los cultivos de los estudiantes mueran o se entremezclen. La pérdida de cultivos es la excepción y no la regla, y siempre que los estudiantes vuelvan a cultivar sus moscas con regularidad y no se produzca una contaminación masiva, las moscas pueden mantenerse durante décadas.
Frascos y viales
Thomas Hunt Morgan utilizaba botellas de leche de vidrio para sus experimentos y, de hecho, cualquier recipiente servirá, incluidos los tarros de bebé y recipientes variados. Sin embargo, para facilitar el cultivo y la transferencia de los cultivos, los frascos y viales uniformes son la mejor opción. Ambos pueden adquirirse en una tienda de suministros biológicos. Los frascos se utilizan principalmente para el mantenimiento de grandes poblaciones de moscas, mientras que los frascos de cultivo son útiles para mantener poblaciones más pequeñas y son el recipiente preferido para construir cruces de estudiantes. Si se desea mantener cultivos de reserva durante un largo periodo de tiempo, o reutilizar botellas y viales, es importante limpiarlos y esterilizarlos completamente. Esto es para prevenir brotes de plagas y enfermedades.

Para limpiar los frascos y viales, primero hay que congelarlos para matar cualquier mosca que haya en ellos. Retire los alimentos, lávelos bien y, a continuación, esterilícelos en autoclave (durante 20 minutos a 121°C y 15 psi; si los recipientes son de plástico, asegúrese de que se pueden esterilizar en autoclave) o lávelos en una solución de cloro al 10%.

Los frascos y viales se pueden comprar en una variedad de tamaños y materiales. El vidrio es eficaz, sin embargo si se cae un estudiante podría perder 2 semanas de datos en un solo derrame. Existen frascos de plástico esterilizados en autoclave que son preferibles para el uso de los estudiantes. Los tamaños de los viales van desde 96 mm por 25 mm hasta tamaños más grandes, sin embargo, se recomienda el tamaño más pequeño para hacer cruces y mantener cultivos pequeños. Hay una gran variedad de tapones disponibles, desde los de algodón suave hasta los de espuma. Esto es una cuestión de preferencia y costes, sin embargo el algodón funciona bien y se puede comprar en una farmacia local en un apuro.
Donde comprar suministros:
Carolina Biological Supply Company
FlyStuff.com, A division of Genesee Scientific
Cómo son:

Microscopio estereoscópicoFrasco de DrosophilaFrascos de Drosophila

Alimentos para moscas
El primer paso para preparar los frascos de cultivo es añadir los medios de alimentación. Hay una variedad de tipos de alimentos disponibles para las moscas; algunos requieren cocción y otros se compran ya preparados y deshidratados. Estos últimos pueden adquirirse en una empresa de suministros biológicos. Esto es, por supuesto, mucho más rápido y fácil que preparar medios cocinados, tanto que los estudiantes pueden llenar sus propios viales con medios. Sin embargo, debe estar completamente rehidratado para obtener los mejores resultados, ya que es la única fuente de agua para los adultos y las larvas. Por lo tanto, siga las siguientes sugerencias para asegurar un medio completamente hidratado:

Medio deshidratado
Agregue medio seco al frasco o vial hasta aproximadamente 1/5 a 2/5 de volumen. Añada agua hasta que el medio esté completamente humedecido. Deje reposar el vial durante unos minutos, añadiendo agua adicional si es necesario hasta que el medio esté completamente hidratado. La superficie debe estar húmeda con un aspecto brillante y no debe haber espacios en el medio. Si el medio no está completamente hidratado, la producción de cultivos vigorosos se ve comprometida. Las moscas pueden añadirse minutos después de que el medio se haya hidratado. Recuerde añadir varios granos (pero no más) de levadura a la superficie del medio antes de añadir las moscas.

Medios cocidos
Cuando dispense medios cocidos, debe llenar el vial de cultivo, la botella o el frasco entre 1/5 y 2/5 de su capacidad. Mantenga los medios fuera durante la noche para que se curen, manteniendo los viales cubiertos con un paño para evitar que las moscas silvestres pongan huevos en ellos. Al día siguiente, añada la levadura y los tapones. Refrigere los viales de medios que no haya utilizado. Los medios cocidos pueden conservarse en el frigorífico durante varias semanas. Deje que los medios se calienten a temperatura ambiente antes de añadir las moscas. No permita que los medios se sequen.
Ambiente
La forma más fácil de criar moscas es a temperatura ambiente. Sin embargo, la condición óptima de cría es una temperatura de 25°C y una humedad del 60%. En estas condiciones el tiempo de generación es más corto (9-10 días desde el huevo hasta el adulto). A menos que se disponga de un equipo, no es necesario para criar y cruzar moscas con éxito. Es preferible mantener las moscas alejadas de las corrientes de aire y de la luz solar directa o de las fuentes de calor. Éstas secarán rápidamente el medio, necesitando cambios frecuentes de medio y la posibilidad de deshidratar a las moscas.
Anestesiar a las moscas
El problema con las moscas de la fruta es que vuelan. Por lo tanto, se han desarrollado diversos métodos para anestesiar a las moscas. Se incluyen el éter, las marcas comerciales como Flynap, el dióxido de carbono y el enfriamiento. Cada uno tiene sus puntos fuertes y débiles. El éter es inflamable, tiene un fuerte olor y mata a las moscas si se las anestesia en exceso (¡y puede anestesiar a los estudiantes más jóvenes!). El Flynap, de Carolina Biological, es sucio y tiene un olor que algunos encuentran ofensivo. Sin embargo, cada uno de ellos requiere un equipo de bajo coste que puede adquirirse fácilmente. El dióxido de carbono funciona muy bien, manteniendo a las moscas inmóviles durante largos periodos de tiempo sin efectos secundarios, sin embargo las esteras de CO2 (bloques) son caras y se necesita una fuente de CO2 (normalmente una botella) y un sistema de suministro (viales y pinzas), lo que aumenta los costes. Si se es ingenioso, se puede utilizar el CO2 emitido por las pastillas de Alka-Seltzer para anestesiar a las moscas durante cortos periodos de tiempo. Prepare un tubo de ensayo grande con un sistema de tubo y tapón. Añade agua en el tubo y luego la pastilla de Alka-Seltzer. Se emitirá gas de dióxido de carbono.

Lo menos perjudicial para las moscas es anestesiar con dióxido de carbono o con frío. De estas dos opciones, la refrigeración es la más sencilla, ya que sólo requiere un congelador, hielo y placas de Petri. Además, es el único método que no afecta a la neurología de las moscas, por lo que los estudios de comportamiento pueden comenzar después de que las moscas se hayan calentado lo suficiente.
Anestesiar a las moscas por enfriamiento
Para incapacitar a las moscas, coloque el frasco de cultivo en el congelador hasta que las moscas no se muevan, generalmente entre 8 y 12 minutos. Vierta las moscas sobre una superficie refrigerada. Ésta puede construirse utilizando la parte superior de una placa de Petri, añadiendo hielo picado y colocando después el fondo de la placa de Petri encima. La adición de moscas a este sistema las mantendrá refrigeradas el tiempo suficiente para realizar cada experimento. Simplemente coloque las moscas de nuevo en el frasco de cultivo cuando termine. Las moscas se «despiertan» relativamente rápido una vez fuera del hielo, así que manténgalas frías. Este método no tiene efectos secundarios duraderos, aunque las moscas que se dejan en la nevera demasiado tiempo pueden no recuperarse. Otra forma de mantener las moscas frías es añadir agua a bolsas de congelación tipo zip-lock, colocarlas en el congelador con una placa de Petri encajada en la bolsa, y dejar que se congelen.
Transferencia de moscas de un vial a otro
Las moscas deben ser transferidas cada 10 a 14 días. Los estudiantes deberían mantener un cultivo de reserva de sus moscas y el instructor debería mantener cultivos de reserva de todas las cepas de moscas. Hay dos formas básicas de transferir moscas cuando se forman nuevos cultivos. Una de ellas no requiere anestesia pero sí manos rápidas.
A) Coloque un embudo en la boca de un vial de cultivo fresco que ya tenga medio añadido. En el vial viejo (el que tiene las moscas), golpee suavemente las moscas hacia abajo apisonando el vial sobre una superficie blanda, como una alfombrilla de ratón. Las moscas caerán al fondo y permanecerán allí durante unos segundos (¡no más que eso!), tiempo suficiente para sacar rápidamente el tapón del vial, invertirlo en el embudo y apisonar suavemente, juntos, los dos viales para forzar a las moscas a bajar al nuevo vial.
B) Una forma alternativa es poner las moscas en el congelador durante unos 8 minutos. Esto hará que las moscas caigan en un estado de estupor. Después de colocar un embudo en el nuevo vial, invierta el vial con las moscas inmóviles en el embudo. Esto no es tan divertido pero no tendrá ninguna mosca volando por el aula.
Sexo de las moscas
Es bastante fácil distinguir los machos de las hembras y con un poco de práctica los estudiantes se sentirán seguros de su capacidad para hacerlo. Observe que los machos son generalmente más pequeños y tienen un abdomen más oscuro y redondeado. La coloración del abdomen es la más fácil de reconocer. Además, los machos tienen peines sexuales tarsales en el primer par de patas. Son negros y muy característicos, pero sólo pueden verse con un aumento relativamente grande. Con un poco de práctica, observando el abdomen, los estudiantes se volverán competentes en la determinación del sexo de las moscas. La determinación del sexo de las moscas es fundamental a la hora de realizar cruces, así que asegúrese de que los alumnos se sienten seguros a la hora de identificar la diferencia entre los sexos. Para que los estudiantes se sientan cómodos sexando moscas, entregue o haga que obtengan 25 o más moscas de sexo mixto y permita que clasifiquen las moscas en dos montones, macho y hembra. Otros estudiantes del grupo y el instructor deben verificar la clasificación. Cada miembro del grupo debe ser capaz de sexar las moscas.
Imágenes de machos y hembras

Nótese el abdomen más oscuro y el aspecto más redondeado del macho. Las hembras también tienden a ser más grandes.
Colección de hembras vírgenes
Aunque es una simple cuestión de colocar a las hembras vírgenes con los machos, es importante reconocer el factor tiempo que implica la obtención de vírgenes. Las hembras permanecen vírgenes durante sólo 8-10 horas después del eclosionamiento y deben ser recolectadas dentro de este marco de tiempo. NOTA: Las hembras tienen la capacidad de almacenar esperma después de un solo apareamiento, por lo que si la hembra para un cruce no es virgen, usted no sabrá el genotipo del macho utilizado para su cruce. Se recomienda encarecidamente obtener vírgenes adicionales por si se comete un error en la identificación o la mosca muere antes de que pueda producirse el apareamiento y la puesta de huevos. En un cultivo fuerte, deberían obtenerse fácilmente múltiples hembras vírgenes. Aunque las hembras pueden poner huevos como vírgenes, serán estériles y no se producirán larvas. A continuación se indican tres formas de obtener vírgenes, siendo el «método de eliminación» el más recomendable para los principiantes.
Método de eliminación
Elimine todas las moscas 8-10 horas antes de la recolección (generalmente esto se hace a primera hora de la mañana). Inspeccione visualmente la superficie de la comida para asegurarse de que se han eliminado todas las moscas. Después de 8-10 horas (generalmente antes de salir del trabajo) recoja todas las hembras que estén presentes. Todas serán vírgenes. Colóquelas en un vial de cultivo fresco y espere 2-3 días para buscar larvas. Las hembras vírgenes pueden poner huevos, pero serán estériles. Como son sensibles al fotoperiodo, las hembras tienden a eclosionar temprano en la mañana. Por lo tanto, las recolecciones tempranas garantizarán el mayor número de vírgenes para la experimentación. Sin embargo, la recolección es posible más tarde en el día.
Método visual
Poder reconocer a las hembras vírgenes elimina la necesidad de vaciar los frascos de cultivo en el momento oportuno y permite a los estudiantes recolectar los suyos sin la necesidad de venir a clase a horas extrañas del día. Tenga en cuenta que las hembras vírgenes son mucho más grandes que las hembras mayores y no tienen la coloración oscura de las hembras maduras. Además, en las primeras horas después de la eclosión, será visible una mancha verdosa oscura (el meconio, los restos de su última comida antes de pupar) en la parte inferior del abdomen.
Ciclo de temperatura
Es posible maximizar el número de vírgenes en una recolección matinal utilizando el ciclo de temperatura. Cuando los cultivos se mantienen a una temperatura de 18°C, el desarrollo se ralentiza, por lo que las hembras no se aparean hasta 16 horas después del encierro. Si se extraen las moscas por la tarde/noche y se colocan los frascos en una incubadora a 18°C, el 98% de las moscas obtenidas por la mañana serán vírgenes. Colocando las vírgenes en sus propios viales durante 2-3 días se eliminará ese 2% que no son vírgenes.
Fotos de machos y hembras vírgenes:

Cruzamiento de moscas
Una vez que las hembras son consideradas vírgenes, añadir los machos. Al establecer los cruces, lo ideal es una proporción de 3:1 de hembras vírgenes con respecto a los machos. Por lo general, los machos se aparearán más eficazmente si han madurado 3 días o más. Asegúrese de seleccionar machos robustos y sanos; cuanto más viejas sean las moscas, menor será la eficacia del apareamiento. El apareamiento se produce rápidamente y el comportamiento es interesante de observar, pero no se abordará aquí. Las hembras comienzan a poner huevos fértiles poco después del apareamiento. Consulte el cuadro del ciclo de vida para ver las pruebas de las larvas F1. Retire los adultos una vez que se haya establecido que hay suficientes larvas (normalmente 7-8 días después del cruce), ya que es posible que no pueda distinguir a los padres de la generación F1.
Matando moscas: La Morgue
Esto es una desafortunada necesidad cuando se utilizan moscas. Generalmente se utiliza una botella o vaso de precipitados con agua jabonosa, o aceite mineral. Vierta las moscas anestesiadas directamente en el agua jabonosa o el aceite mineral donde se ahogan. Una botella (vaso de precipitados, o tarro con tapa de rosca) llena de etanol o isopropanol también puede utilizarse como morgue.
Nomenclatura y definiciones básicas de la genética de Drosophila

Las moscas Drosophila melanogaster tienen 4 cromosomas.
El genotipo se escribe como:

Cromosoma
Cromosoma o Cromosoma / Cromosoma

Esta nomenclatura común muestra un cromosoma en la parte superior y su homólogo en la parte inferior, tal como aparecerían los cromosomas durante la meiosis al aportar gametos.

Cuando se escribe el genotipo, en general, los cromosomas se separan con un punto y coma.

Cromosoma X; cromosoma II; cromosoma III; cromosoma IV

El tipo salvaje se denota como «+» o WT

Las mutaciones dominantes se escriben con mayúscula:
Por ejemplo: Bar o B

Las mutacionesecessivas se escriben con letra minúscula:
Por ejemplo: blanco o w

Las mutaciones son alelos (formas alternativas de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma) que se heredan con los cromosomas.

Homocigoto: individuo con el mismo alelo en los loci correspondientes de los cromosomas homólogos.

Heterocigoto – Individuo con diferentes alelos en los loci correspondientes de los cromosomas homólogos.

Genotipo – Los genes que posee un organismo.

Fenotipo – Los atributos observables de un organismo.

P1 – Generación parental.

F1 – Generación filial, o generación de descendientes. F1 es la primera generación de descendientes.

F2 – La segunda generación de descendientes.
Otros grandes recursos de la web:

Gerard Manning escribió una sencilla introducción a la genética de Drosophila.

Genética en la mosca: A Primer on the Drosophila Model System por Karen G. Hales et al (2015).

Taking Stock of the Drosophila Research Ecosystem por David Bilder y Kenneth D. Irvine (2017).