Diagnóstico de la infección por Legionella

Abstract

Las Legionellas, que son importantes causas de neumonía en el ser humano, siguen siendo etiquetadas incorrectamente como patógenos exóticos. La capacidad para diagnosticar la infección por Legionella está limitada por la naturaleza inespecífica de las características clínicas y las deficiencias de las pruebas de diagnóstico. A pesar de las recientes mejoras, las pruebas de diagnóstico existentes para la infección por Legionella carecen de sensibilidad para detectar todas las legionelas clínicamente importantes o son incapaces de proporcionar resultados dentro de un marco de tiempo clínicamente útil. Comprender la epidemiología local de la Legionella es importante para tomar decisiones sobre la conveniencia de realizar pruebas de detección de la infección por Legionella y sobre qué pruebas diagnósticas utilizar. En la mayoría de las situaciones, el uso de la prueba del antígeno urinario más el cultivo de esputo es la mejor combinación diagnóstica. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramienta prometedora, pero los ensayos estandarizados no están disponibles comercialmente. Hay que seguir trabajando en el desarrollo de pruebas de antígeno urinario que detecten una gama más amplia de legionelas patógenas y en el desarrollo de ensayos de PCR estandarizados.

La enfermedad del legionario sigue teniendo la reputación de ser una infección exótica. Por el contrario, cuando se busca sistemáticamente, las especies de Legionella se reconocen sistemáticamente como una de las causas comunes de neumonía. Sin embargo, fuera del ámbito de la investigación, los diagnósticos confirmados de legionelosis son infrecuentes. Este fracaso en el diagnóstico de la legionelosis en la práctica rutinaria es en gran parte el resultado de 3 factores: la incapacidad de distinguir clínica y radiográficamente la legionelosis de otras causas de neumonía, la falta de solicitud de pruebas diagnósticas para la infección por Legionella y las deficiencias de las pruebas diagnósticas disponibles. La enfermedad del legionario se describe con más precisión como un diagnóstico elusivo que como una infección exótica.

Aunque los métodos de diagnóstico han mejorado durante los 25 años transcurridos desde que se describió por primera vez la Legionella pneumophila, ninguna de las pruebas disponibles en la actualidad es capaz de diagnosticar la enfermedad del legionario de forma oportuna con un alto grado de sensibilidad y especificidad. De hecho, algunos autores han cuestionado la solicitud rutinaria de cualquier prueba microbiológica para los pacientes con neumonía, apoyándose en datos que sugieren que dichas pruebas no influyen significativamente en la elección del tratamiento antibiótico y en el resultado del paciente . Recientemente, Marrie argumentó que este enfoque del diagnóstico de la legionelosis era erróneo. La falta de pruebas para detectar la infección por Legionella puede retrasar el reconocimiento de los brotes de legionelosis, puede pasar por alto los cambios en la epidemiología de la enfermedad (incluido el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos), y puede impedir que las personas reclamen una indemnización por la infección adquirida en el trabajo. Es importante destacar que es posible seleccionar un subconjunto de pacientes para los que el rendimiento de las pruebas diagnósticas de la infección por Legionella es alto y que se beneficiarían de un diagnóstico específico.

Esta revisión se centra en las pruebas diagnósticas actuales para la infección por Legionella, haciendo especial hincapié en las pruebas que proporcionan un diagnóstico en un plazo de tiempo que afectará al manejo inicial de la infección. Al revisar las distintas pruebas de diagnóstico de la infección por Legionella, es importante tener en cuenta varios factores. En primer lugar, se requieren pruebas especializadas para diagnosticar la infección por Legionella, y éstas deben ser solicitadas específicamente por el clínico. En segundo lugar, es importante apreciar la distinción entre el rendimiento de una prueba en un laboratorio de investigación y lo que se puede conseguir de forma realista en un laboratorio de diagnóstico local. Se ha documentado una considerable variación entre laboratorios en cuanto a la capacidad de cultivar legionela, y es probable que esto se extienda también a otras pruebas. En tercer lugar, la interpretación del rendimiento de las pruebas de diagnóstico se ve dificultada por la falta de un «patrón oro» adecuado. Los datos de sensibilidad y especificidad calculados variarán con diferentes estándares de comparación. En cuarto lugar, la utilidad de las pruebas de diagnóstico está influida por la epidemiología local de la Legionella. El serogrupo 1 de L. pneumophila es la causa predominante de legionelosis en muchas, si no en la mayoría, de las zonas del mundo, y la infección por este organismo es más fácil de diagnosticar que la infección por otras especies y serogrupos de Legionella. En algunas regiones, otras especies y serogrupos son más importantes. Por ejemplo, Legionella longbeachae es una de las principales causas de legionelosis en Australia y Nueva Zelanda, donde a menudo se asocia con la exposición a la mezcla para macetas. La infección por esta especie no será detectada por las pruebas actuales de antígenos urinarios y no será detectada por los laboratorios que realizan ensayos serológicos sólo para L. pneumophila.

Cultivo

El diagnóstico por cultivo requiere medios especiales, un procesamiento adecuado de las muestras y experiencia técnica (tabla 1). Se necesitan varios días para obtener un resultado positivo, y la mayoría de las colonias de Legionella se detectan en 3-5 días. El medio estándar utilizado para el cultivo de Legionella es el agar de extracto de levadura de carbón tamponado (BCYE) complementado con α-cetoglutarato, con o sin agentes antimicrobianos. Este medio proporciona hierro y L-cisteína, ambos esenciales para el crecimiento de las legionelas. El crecimiento de algunas especies de Legionella (por ejemplo, Legionella micdadei y Legionella bozemanii) se ve favorecido por la suplementación del agar BCYE con albúmina de suero bovino, y la adición de colorantes indicadores al medio puede ayudar a su identificación. Los medios de cultivo que contienen cefamandol inhiben el crecimiento de las especies de Legionella que no producen β-lactamasas, como L. micdadei y L. bozemanii.

Las Legionellas pueden aislarse de una gran variedad de tipos de muestras, aunque las secreciones del tracto respiratorio inferior (por ejemplo, esputo y muestras de broncoscopia) son las muestras de elección. La principal limitación del cultivo de esputo es que menos de la mitad de los pacientes con legionelosis producen esputo. Otros factores influyen en la sensibilidad del cultivo una vez que se obtiene una muestra de esputo. Las bacterias de la legionela pueden sobrevivir mal en las secreciones respiratorias, y estas muestras deben procesarse rápidamente. Algunos pacientes con legionelosis producen esputo que tiene relativamente poca purulencia; estas muestras pueden ser rechazadas por los laboratorios que descartan las muestras de esputo que contienen pocos leucocitos polimorfonucleares . Por consiguiente, no deben aplicarse criterios de rechazo a las muestras de esputo enviadas para el cultivo de Legionella. La experiencia del personal del laboratorio también es importante, y los laboratorios con experiencia en el cultivo de Legionella tienen más probabilidades de recuperar el organismo.

Las sensibilidades estimadas del cultivo de esputo oscilan entre el <10% y el ∼80% y varían en función de los diferentes estándares de comparación y de los laboratorios individuales . En la práctica, es probable que los mejores resultados sólo los consigan los laboratorios con un interés especial en la infección por Legionella, y las sensibilidades suelen ser <50% cuando se utilizan los resultados serológicos como estándar. Es probable que las muestras broncoscópicas produzcan un mayor rendimiento diagnóstico que las muestras de esputo expectorado.

Las especies de Legionella pueden aislarse de los cultivos de sangre, pero el rendimiento es escaso. El crecimiento de las legionelas se mantiene en los medios de hemocultivo habituales, pero puede no activar la alarma de las máquinas de hemocultivo comerciales . En consecuencia, es necesario realizar subcultivos ciegos en medios sólidos. En general, el rendimiento de los hemocultivos es bajo y es poco probable que influya en la gestión clínica.

Tinción con anticuerpos fluorescentes directos (Dfa)

La tinción con DFA puede detectar legionelas en secreciones respiratorias y muestras de tejido. Esta técnica tiene la ventaja de proporcionar un resultado en 2-4 horas, pero es técnicamente exigente y debe ser realizada por personal de laboratorio experimentado. Las sensibilidades notificadas de la tinción con DFA varían, son sistemáticamente inferiores a las del cultivo y se conocen con menos precisión para las especies distintas de L. pneumophila. En el caso de las secreciones del tracto respiratorio inferior, las sensibilidades suelen oscilar entre el 25% y el 66%, y las muestras de líquido de lavado broncoalveolar tienen un mayor rendimiento que las muestras transtraqueales o de esputo. La especificidad de la tinción DFA se ha estimado en ∼94% , aunque es probable que la prueba sea menos específica en manos inexpertas. Pueden producirse resultados falsos positivos debido a reacciones cruzadas con otras bacterias, como Bacteroides fragilis, especies de Pseudomonas, especies de Stenotrophomonas y especies de Flavobacterium. Las reacciones cruzadas pueden ser un problema menor cuando se utilizan agentes DFA de anticuerpos monoclonales. Los problemas de sensibilidad y especificidad han limitado el uso de la tinción DFA, y un resultado positivo de DFA en ausencia de otras pruebas de apoyo no se acepta ahora generalmente como suficiente para el diagnóstico de la infección por Legionella.

Detección de antígenos en orina

La detección de antígenos solubles de Legionella en muestras de orina es un método rápido que proporciona un diagnóstico temprano de la infección por Legionella y ha sido una herramienta útil para la investigación de brotes de legionelosis . Los kits comerciales que utilizan las metodologías RIA y EIA han estado disponibles durante varios años y tienen características de rendimiento similares. Recientemente, se ha desarrollado un ensayo inmunocromatográfico (NOW Legionella Urinary Antigen Test; Binax) que tiene una sensibilidad y especificidad similares a la EIA . Esta prueba es fácil de realizar y puede proporcionar un resultado en 15 minutos.

Para la detección de L. pneumophila serogrupo 1, las pruebas de antígeno urinario tienen sensibilidades en el rango del 70%-100% y especificidades cercanas al 100% . Las sensibilidades pueden incrementarse hasta en un 20% mediante la concentración de 25 veces de las muestras de orina antes de la prueba. La principal desventaja de estas pruebas es su incapacidad para detectar de forma fiable organismos distintos de L. pneumophila serogrupo 1. Se han desarrollado ensayos de amplio espectro que detectan antígenos solubles de una amplia variedad de especies de Legionella, pero no están disponibles en el mercado. El Biotest Legionella Urine Antigen EIA (Biotest) está pensado para detectar legionelas distintas de L. pneumophila serogrupo 1, pero lo hace de forma menos fiable que la detección de L. pneumophila serogrupo 1 . Se han producido falsos resultados positivos de antígenos urinarios en pacientes con enfermedad del suero.

La antigenuria por Legionella puede detectarse tan pronto como un día después del inicio de los síntomas y persiste durante días o semanas. En un caso, se documentó la excreción de antígeno durante >300 días . También se han detectado antígenos solubles de Legionella en muestras distintas de la orina, incluidas muestras de esputo, tejido pulmonar, suero y líquido pleural, aunque el uso de estas muestras no se ha evaluado completamente.

Las pruebas de antígenos urinarios son ahora una herramienta establecida y valiosa para el diagnóstico de la enfermedad del legionario, especialmente en las regiones donde el serogrupo 1 de L. pneumophila es la causa más común de la enfermedad. En lugares donde sólo una minoría de las infecciones son causadas por el serogrupo 1 de L. pneumophila, las pruebas de antígeno urinario actualmente disponibles contribuyen menos a las pruebas de laboratorio existentes.

Pruebas serológicas

Las pruebas serológicas para la infección por Legionella son una valiosa herramienta epidemiológica, pero tienen poco impacto en la toma de decisiones clínicas debido al tiempo que transcurre antes de que el resultado esté disponible. Los anticuerpos producidos en respuesta a la infección son generalmente una mezcla de IgA, IgM e IgG, y las pruebas deben detectar todos los tipos para una sensibilidad óptima. La medición de la IgM específica es un marcador poco fiable de la infección aguda, porque los anticuerpos IgM pueden persistir durante largos períodos de tiempo. La seroconversión puede tardar varias semanas, lo que constituye una importante limitación de las pruebas serológicas. En la mayoría de los casos, se detecta un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos en un plazo de 3-4 semanas, pero en algunos casos, esto puede tardar >10 semanas. La obtención de muestras de suero en fase de convalecencia demasiado pronto da lugar, sin duda, a muchos resultados falsos negativos y probablemente explica en parte el 20%-30% de pacientes con legionelosis que supuestamente no desarrollan una respuesta de anticuerpos detectable . Sin embargo, está claro que una proporción de personas con infección probada por Legionella no tienen una seroconversión detectable . En la práctica, se debería animar a los clínicos a obtener muestras de suero en la fase de convalecencia 3 semanas después del inicio de la enfermedad para analizarlas en paralelo con el suero obtenido durante la fase aguda. Si no hay seroconversión después de este periodo de tiempo y se sigue sospechando una infección por Legionella, debe obtenerse una muestra adicional en la fase de convalecencia.

De los diversos métodos de detección de anticuerpos disponibles, la inmunofluorescencia indirecta es la prueba de referencia estándar. Un aumento de 4 veces o más en el título de anticuerpos recíprocos a ⩾128 se considera diagnóstico. Los títulos de anticuerpos recíprocos en fase aguda de ⩾256 en presencia de neumonía se consideraron en su día suficientes para un diagnóstico presuntivo, pero se ha demostrado que esto no es fiable, especialmente dada la alta prevalencia de positividad de anticuerpos contra Legionella entre algunas personas sin evidencia clínica de legionelosis. Prácticamente no tiene sentido analizar muestras de suero individuales.

Otro inconveniente de las pruebas serológicas es la incapacidad de detectar con precisión todas las especies y serogrupos de Legionella. Aunque la seroconversión al serogrupo 1 de L. pneumophila se considera generalmente como altamente predictiva de la enfermedad, la sensibilidad y especificidad de la seroconversión a otras especies y serogrupos no se ha confirmado rigurosamente. Además, la formación de anticuerpos de reacción cruzada entre los miembros de la familia Legionellaceae puede dificultar la determinación de la especie o el serogrupo infectante. Algunos pacientes con una infección no relacionada con el serogrupo 1 de L. pneumophila tendrán una seroconversión al serogrupo 1 de L. pneumophila. Por el contrario, la identificación basada en la secuencia de los productos de PCR de Legionella de pacientes que han tenido seroconversión a especies de Legionella distintas de L. pneumophila indican que es probable que algunos hayan estado infectados por L. pneumophila (observaciones no publicadas). Los anticuerpos de reacción cruzada también se encuentran ocasionalmente en pacientes con infecciones causadas por bacterias que no son de L. pneumophila, incluyendo pseudomonas, micobacterias, especies de Bacteroides y especies de Campylobacter. Se produce una interesante reacción cruzada entre L. bozemanii y Rickettsia typhi como resultado de un antígeno compartido.

Amplificación del ácido nucleico

Recientemente, las técnicas de detección del ADN se han mostrado prometedoras para el diagnóstico rápido de la infección por Legionella. La PCR permite la amplificación específica de cantidades mínimas de ADN de Legionella, proporciona resultados en un plazo breve y tiene el potencial de detectar infecciones causadas por cualquier especie y serogrupo de Legionella. Actualmente, la PCR de Legionella sólo está disponible en un número limitado de laboratorios que utilizan una variedad de ensayos internos.

La PCR se ha utilizado con éxito para detectar el ADN de Legionella en una serie de muestras ambientales y clínicas. Cuando se analizan muestras del tracto respiratorio inferior, la PCR ha demostrado repetidamente tener una sensibilidad igual o mayor que el cultivo. De hecho, la PCR podría considerarse la prueba de elección para los pacientes que producen esputo. El papel de la PCR para analizar otros tipos de muestras está menos claro. El ADN de Legionella puede detectarse en muestras de orina, suero y leucocitos obtenidas de pacientes con legionelosis con sensibilidades del 30% al 86% . Es probable que la sensibilidad de la PCR aumente cuando se analizan muestras obtenidas al principio de la enfermedad y cuando se analiza >1 tipo de muestra de cada paciente . Los hisopos de garganta también pueden ser una muestra adecuada para las pruebas de PCR, pero esta aplicación sólo se ha evaluado en un único estudio.

Se necesita más trabajo para establecer un método de PCR estándar que sea lo suficientemente robusto para ser utilizado fuera del entorno de un laboratorio de investigación. Su aplicación a muestras no respiratorias es especialmente atractiva, ya que así se evitará el problema de los pacientes que no producen muestras de esputo. El desarrollo de un ensayo de PCR óptimo se ha visto complicado por la contaminación intermitente de algunos kits comerciales de extracción de ADN con ADN de Legionella. El uso de estos kits para procesar las muestras puede dar lugar a resultados falsos positivos y pone de manifiesto la importancia de incluir controles adecuados en cada ensayo.

Estrategia de análisis

Debido a que la legionelosis no puede distinguirse clínica o radiográficamente de otras causas de neumonía, la decisión de analizar la infección por Legionella puede ser difícil y a menudo se toma de forma errática. Es importante conocer la epidemiología local. Algunos laboratorios de zonas en las que las especies de Legionella son una causa común de neumonía han optado por cultivar rutinariamente todas las muestras de esputo obtenidas de pacientes con neumonía en medios de Legionella. Sin embargo, pocos laboratorios podrían justificar el coste adicional asociado al cultivo rutinario de Legionella. En la mayoría de los lugares, la incidencia de la infección por Legionella es desconocida, y la decisión de solicitar pruebas diagnósticas para la infección por Legionella suele limitarse a los pacientes de riesgo, a los pacientes con neumonía grave y a los escenarios de brotes. Ciertamente, es posible seleccionar un subconjunto de pacientes para los que el rendimiento de las pruebas de diagnóstico de Legionella es probablemente relativamente alto. Este grupo incluye a las personas mayores, los fumadores, los individuos inmunodeprimidos, los que padecen enfermedades pulmonares crónicas, los pacientes que residen en hospitales con suministros de agua colonizados por Legionella y los individuos expuestos a la mezcla de macetas. La incidencia de la legionelosis es mayor entre los pacientes con neumonía grave, y todos los pacientes con neumonía que ingresan en una unidad de cuidados intensivos deben someterse a pruebas para detectar esta infección.

En lugares donde L. pneumophila serogrupo 1 es la causa predominante de la infección por Legionella, o durante un brote de infección por L. pneumophila serogrupo 1, la prueba del antígeno urinario es una herramienta de diagnóstico especialmente valiosa. El desarrollo de una prueba comercial de antígeno urinario que también detecte de forma fiable otros patógenos humanos de Legionella sería un gran avance y probablemente la convertiría en la prueba diagnóstica de elección en casi todos los entornos. En lugares geográficos en los que las legionelas distintas de L. pneumophila serogrupo 1 son patógenos numéricamente importantes, las actuales pruebas de antígenos urinarios siguen siendo útiles, pero no deben utilizarse como única herramienta de diagnóstico. Si está disponible, la PCR de Legionella combinada con la prueba de antígeno urinario es probablemente la mejor estrategia de prueba inicial que detectará todas las especies de Legionella y proporcionará resultados dentro de un marco de tiempo que afectará al manejo clínico.

Cuando la PCR no está disponible, la prueba de antígeno urinario combinada con el cultivo de muestras del tracto respiratorio inferior es la mejor combinación de pruebas. El cultivo sigue siendo una herramienta diagnóstica importante, pero su sensibilidad relativamente baja y la dependencia de la disponibilidad de una muestra del tracto respiratorio inferior la hacen inadecuada como única prueba diagnóstica. Aunque las pruebas serológicas no tienen ningún impacto en el manejo inicial, pueden ser útiles si no se hace un diagnóstico específico durante la fase aguda de la infección, pero tanto las muestras de la fase aguda como las de la fase de convalecencia deben ser analizadas en paralelo. Durante un brote sospechoso de legionelosis, se justifica un enfoque agresivo del diagnóstico, que implicaría el uso de una combinación de métodos de prueba.

Las especies de Legionella pueden causar ocasionalmente la fiebre de Pontiac, una enfermedad aguda, febril y no neumónica que se caracteriza por una alta tasa de ataques, un corto período de incubación y una rápida recuperación. El diagnóstico de la fiebre de Pontiac suele basarse en el reconocimiento de las características clínicas típicas durante una situación de brote, y el diagnóstico se confirma mediante pruebas serológicas de las personas afectadas. El uso del cultivo se limita en gran medida al análisis de muestras ambientales para determinar el origen del brote, aunque se ha aislado el serogrupo 1 de L. pneumophila de un aspirado traqueal de un niño con fiebre de Pontiac.

Conclusiones

La infección por Legionella está sin duda poco reconocida. El diagnóstico se basa en el uso de pruebas especializadas, a menudo combinadas. Las pruebas de antígeno urinario, el cultivo de esputo y las pruebas de PCR de muestras del tracto respiratorio inferior son las herramientas de diagnóstico más importantes para la detección de la infección por Legionella en las primeras fases de la enfermedad. El desarrollo de pruebas de antígenos urinarios que detecten una gama más amplia de legionelas patógenas y el desarrollo de ensayos de PCR estandarizados serán avances importantes en el diagnóstico de la Legionella. El aumento de la disponibilidad y el uso de pruebas de diagnóstico mejoradas ayudará a caracterizar mejor la epidemiología de la legionelosis, incluyendo la verdadera incidencia y la variación geográfica.

Agradecimientos

Agradezco a Steve Chambers sus útiles comentarios sobre el artículo en manuscrito.

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