Los componentes de un sistema básico de cromatografía líquida de alto rendimiento se muestran en el sencillo diagrama de la figura E.
Un depósito contiene el disolvente . Una bomba de alta presión se utiliza para generar y medir un caudal específico de fase móvil, normalmente mililitros por minuto. Un inyector es capaz de introducir la muestra en la corriente de fase móvil de flujo continuo que lleva la muestra a la columna de HPLC. La columna contiene el material de relleno cromatográfico necesario para efectuar la separación. Este material de empaquetamiento se denomina fase estacionaria porque se mantiene en su lugar por el hardware de la columna. Se necesita un detector para ver las bandas de compuestos separadas a medida que eluyen de la columna de HPLC. La fase móvil sale del detector y puede enviarse a los residuos, o recogerse, según se desee. Cuando la fase móvil contiene una banda de compuesto separada, la HPLC ofrece la posibilidad de recoger esta fracción del eluido que contiene ese compuesto purificado para su estudio posterior. Esto se denomina cromatografía preparativa.
Nótese que se utilizan tubos y accesorios de alta presión para interconectar la bomba, el inyector, la columna y los componentes del detector para formar el conducto para la fase móvil, la muestra y las bandas de compuestos separadas.
Figura E: Sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento
El detector está conectado a la estación de datos del ordenador, el componente del sistema HPLC que registra la señal eléctrica necesaria para generar el cromatograma en su pantalla y para identificar y cuantificar la concentración de los componentes de la muestra (véase la figura F). Dado que las características de los compuestos de la muestra pueden ser muy diferentes, se han desarrollado varios tipos de detectores. Por ejemplo, si un compuesto puede absorber la luz ultravioleta, se utiliza un detector de absorción UV. Si el compuesto es fluorescente, se utiliza un detector de fluorescencia. Si el compuesto no tiene ninguna de estas características, se utiliza un tipo de detector más universal, como un detector de dispersión de luz por evaporación. El enfoque más potente es el uso de múltiples detectores en serie. Por ejemplo, se puede utilizar un detector UV y/o ELSD en combinación con un espectrómetro de masas para analizar los resultados de la separación cromatográfica. Esto proporciona, a partir de una sola inyección, una información más completa sobre un analito. La práctica de acoplar un espectrómetro de masas a un sistema de HPLC se denomina LC/MS.
Figura F: Un sistema típico de HPLC
Funcionamiento de la HPLC
Una forma sencilla de entender cómo se consigue la separación de los compuestos contenidos en una muestra es ver el diagrama de la Figura G.
La fase móvil entra en la columna por la izquierda, pasa por el lecho de partículas y sale por la derecha. La dirección del flujo se representa con flechas verdes. En primer lugar, considere la imagen superior; representa la columna en el momento cero , cuando la muestra entra en la columna y comienza a formar una banda. La muestra mostrada aquí, una mezcla de colorantes amarillos, rojos y azules, aparece en la entrada de la columna como una única banda negra.
Después de unos minutos , durante los cuales la fase móvil fluye de forma continua y constante a través de las partículas del material de relleno, podemos ver que los colorantes individuales se han movido en bandas separadas a diferentes velocidades. Esto se debe a que existe una competencia entre la fase móvil y la fase estacionaria para atraer a cada uno de los colorantes o analitos. Observe que la banda del colorante amarillo es la que se mueve más rápido y está a punto de salir de la columna. Al colorante amarillo le gusta más la fase móvil que a los otros colorantes. Por lo tanto, se mueve a una velocidad más rápida, más cercana a la de la fase móvil. A la banda de colorante azul le gusta más el material de relleno que la fase móvil. Su mayor atracción por las partículas hace que se mueva mucho más lentamente. En otras palabras, es el compuesto más retenido en esta mezcla de muestras. La banda de colorante rojo tiene una atracción intermedia por la fase móvil y, por tanto, se mueve a una velocidad intermedia a través de la columna. Dado que cada banda de colorante se mueve a diferente velocidad, podemos separarla cromatográficamente.
Figura G: Comprender el funcionamiento de una columna cromatográfica – Bandas
¿Qué es un detector?
Cuando las bandas de colorante separadas salen de la columna, pasan inmediatamente al detector. El detector contiene una celda de flujo que ve cada banda de compuesto separada contra un fondo de fase móvil . Un detector adecuado tiene la capacidad de detectar la presencia de un compuesto y enviar su correspondiente señal eléctrica a una estación de datos informática. Se puede elegir entre muchos tipos diferentes de detectores, dependiendo de las características y concentraciones de los compuestos que deben separarse y analizarse, como se ha comentado anteriormente.
¿Qué es un cromatograma?
Un cromatograma es una representación de la separación que se ha producido químicamente en el sistema HPLC. Una serie de picos que se elevan desde una línea de base se dibuja en un eje de tiempo. Cada pico representa la respuesta del detector para un compuesto diferente. El cromatograma es trazado por la estación de datos del ordenador.
Figura H: Cómo se crean los picos
En la Figura H, la banda amarilla ha atravesado completamente la célula de flujo del detector; la señal eléctrica generada ha sido enviada a la estación de datos del ordenador. El cromatograma resultante ha comenzado a aparecer en la pantalla. Observe que el cromatograma comienza cuando la muestra fue inyectada por primera vez y comienza como una línea recta establecida cerca de la parte inferior de la pantalla. Esto se denomina línea de base; representa la fase móvil pura que pasa por la celda de flujo a lo largo del tiempo. A medida que la banda amarilla del analito pasa por la celda de flujo, se envía una señal más fuerte al ordenador. La línea se curva, primero hacia arriba y luego hacia abajo, en proporción a la concentración del colorante amarillo en la banda de la muestra. Esto crea un pico en el cromatograma. Una vez que la banda amarilla sale completamente de la célula detectora, el nivel de la señal vuelve a la línea de base; la célula de flujo tiene ahora, de nuevo, sólo fase móvil pura. Dado que la banda amarilla es la que más rápido se desplaza, eluyendo primero de la columna, es el primer pico dibujado.
Un poco más tarde, la banda roja llega a la celda de flujo. La señal se eleva desde la línea de base cuando la banda roja entra por primera vez en la celda, y el pico que representa la banda roja comienza a dibujarse. En este diagrama, la banda roja no ha atravesado completamente la celda de flujo. El diagrama muestra el aspecto que tendrían la banda roja y el pico rojo si detuviéramos el proceso en este momento. Como la mayor parte de la banda roja ha pasado por la celda, la mayor parte del pico se ha dibujado, como muestra la línea sólida. Si pudiéramos reiniciar el proceso, la banda roja pasaría completamente a través de la celda de flujo y el pico rojo se completaría. La banda azul, la más retenida, viaja a la velocidad más lenta y eluye después de la banda roja. La línea punteada muestra cómo sería el cromatograma completo si hubiéramos dejado que el recorrido continuara hasta su conclusión. Es interesante observar que la anchura del pico azul será la más amplia porque la anchura de la banda azul del analito, aunque es la más estrecha en la columna, se convierte en la más amplia al eluir de la columna. Esto se debe a que se mueve más lentamente a través del lecho de material de empaque cromatográfico y requiere más tiempo para ser eluido completamente. Como la fase móvil fluye continuamente a una velocidad fija, esto significa que la banda azul se ensancha y se diluye más. Como el detector responde en proporción a la concentración de la banda, el pico azul es menor en altura, pero mayor en anchura.