Entremos primero en los fundamentos de la citometría de flujo
¿Qué es la citometría de flujo?
La citometría de flujo es una técnica utilizada para detectar y medir las características físicas y químicas de una población de células o partículas. En este proceso, una muestra que contiene células o partículas se suspende en un fluido y se inyecta en el instrumento del citómetro de flujo.
¿Cuál es el objetivo de la citometría de flujo?
La citometría de flujo proporciona un método bien establecido para identificar células en solución y se utiliza más comúnmente para evaluar la sangre periférica, la médula ósea y otros fluidos corporales. Los estudios de citometría de flujo se utilizan para identificar y cuantificar las células inmunitarias y caracterizar las neoplasias hematológicas.1 Pueden medir:
- tamaño celular
- granularidad celular
- ADN total
- nuevo sintetizado
- expresión génica del ADN
- receptores de superficie
- intracelular proteínas
- señal transitoria
La capacidad de realizar estas mediciones en un lapso de tiempo muy rápido es una de las ventajas clave del proceso de citometría de flujo. Pueden cuantificar hasta tres o seis propiedades o componentes se cuantifican en una sola muestra, célula por célula, para unas 10.000 células, en menos de un minuto.
Instrumentación y Metodología de la Citometría de Flujo
Los citómetros de flujo toman una suspensión de células individuales monodispersas y no agrupadas y las hacen pasar de una en una (en fila india) frente a un rayo láser donde cada célula pasa a través del rayo láser, la luz dispersa y fluorescente y luego son contadas y clasificadas o caracterizadas adicionalmente.
Los tres componentes principales de un citómetro de flujo son la fluídica, la óptica y la electrónica.
- El sistema de fluídica de un citómetro de flujo se encarga de transportar las muestras desde el tubo de muestra hasta la celda de flujo, pasando por el láser, clasificadas y/o descartadas.
- Los componentes del sistema óptico incluyen las fuentes de luz de excitación, las lentes y los filtros ópticos utilizados para recoger y mover las longitudes de onda de la luz por el instrumento y el sistema de detección que genera la fotocorriente. La diferencia de respuesta de la longitud de onda en los datos ayuda a analizar el tipo de célula.
- La electrónica o la instrumentación del citómetro de flujo.
Uno de los principios principales del uso de la citometría de flujo es la capacidad de analizar el ciclo celular completo y analizar el contenido de ADN en diferentes fases. La monitorización de los eventos naturales del ciclo celular puede proporcionar información para el diagnóstico de enfermedades y el pronóstico terapéutico. Las diferentes fases del ciclo celular pueden revelar un contenido de ADN alterado y otras anomalías que indican la presencia de un tumor o signos de muerte celular avanzada. Las expresiones de datos se almacenan en un ordenador a través de un software de citometría de flujo especializado asociado al uso del instrumento elegido durante el tiempo de análisis. Los datos de citometría de flujo se reportan típicamente en dos formas distintas: un histograma y/o un gráfico de puntos2.
| Fase G1: | Se sintetizan ARN, ribosomas y proteínas |
| Fase S: | Se replica el ADN |
| Fase G2: | Representa la fase entre la síntesis del ADN y la mitosis |
| Fase M: | las células se dividen en dos células hijas |
FACS
La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es un tipo especializado de citometría de flujo. Proporciona un método para clasificar una mezcla heterogénea de células biológicas en dos o más contenedores, una célula cada vez, basándose en las características específicas de dispersión de luz y fluorescencia de cada célula. Se diferencia de la citometría de flujo en que proporciona una caracterización única frente al mero recuento y clasificación de células. Es habitual que los dos principios funcionen en un proceso de tipo co-caracterización para ofrecer un enfoque cualitativo y cuantitativo completo al análisis de citometría de flujo.
El proceso de citometría de flujo:
La suspensión de células es arrastrada en el centro de una corriente estrecha de líquido que fluye rápidamente. El flujo está dispuesto de manera que haya una gran separación entre las células en relación con su diámetro. Un mecanismo vibratorio obliga a la corriente de células a romperse en gotas individuales. El sistema se ajusta para que haya una baja probabilidad de que haya más de una célula por gota. Justo antes de que el flujo se rompa en gotas, el flujo pasa por una estación de medición de fluorescencia donde se mide el carácter fluorescente de interés de cada célula.
Se coloca un anillo de carga eléctrica justo en el punto donde el flujo se rompe en gotas. Se coloca una carga en el anillo basada en la medición de la intensidad de fluorescencia inmediatamente anterior, y la carga opuesta queda atrapada en la gota al romperse del chorro. Las gotas cargadas caen entonces a través de un sistema de desviación electrostática que desvía las gotas a los contenedores en función de su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente al chorro, y la gota que se desprende retiene la carga del mismo signo que el chorro. La corriente vuelve a ser neutra después de que la gota se desprenda.
Un anticuerpo específico para una proteína particular de la superficie celular se asocia con una molécula fluorescente y luego se añade a una mezcla de células. El siguiente paso es el proceso de fluorescencia, mientras que, las células específicas pasan a través de un rayo láser son monitoreadas. A las gotas que contienen una sola célula se les asigna una carga positiva o negativa, en función de si la célula tiene un anticuerpo marcado con fluorescencia. Las gotas que contienen una sola célula se detectan entonces mediante un campo eléctrico y se desvían a tubos de recogida separados según su carga, lo que permite una fácil separación de las células marcadas con el anticuerpo fluorescente.
Citometría de flujo multicolor
La citometría de flujo multicolor es una técnica útil cuando se examinan poblaciones mixtas de células, como las células sanguíneas y tisulares en muestras humanas y animales. Generalmente, un tipo específico de célula se marca con un tinte fluorescente (marcadores) como el fluoróforo o el yoduro de propidio. La capacidad de utilizar múltiples marcadores fluorescentes simultáneamente permite la identificación de múltiples tipos de células, así como de marcadores funcionales que caracterizan aún más cada muestra. Existen instrumentos especializados capaces de medir más de 12 colores 3,4 . Estos tintes y marcadores fluorescentes se miden mediante diferentes longitudes de onda de la luz emitida por el láser para clasificar por tipo de célula individual. Cada marcador se excita a una longitud de onda de luz específica para diferenciarlos cuando se utilizan múltiples marcadores.
Adaptar un panel de tinción típico de 4 a 6 colores a más de 12 colores no es simplemente una cuestión de «plug and play», sino que debe abordarse de manera sistemática para lograr parámetros exitosos en un panel de tinción. Los principios básicos del diseño de un panel funcionan mejor si se basan en una investigación previa al uso. En otras palabras, la preparación es clave incluso desde el proceso inicial de referirse al índice de tinción en lo que respecta a la coincidencia efectiva de los fluorocromos por el brillo5.
Consejo de citometría de flujo:
Dedique algún tiempo a comprender los matices sutiles de su citómetro de flujo antes de diseñar su panel de anticuerpos primarios. Concéntrese en los puntos en los que se pueden realizar las mediciones más sensibles en el sistema. Hay algo más que la mera intensidad fluorescente.
Considere la posibilidad de sustituir por un fluorocromo menos brillante para evitar errores de canal.
Aplicaciones comunes de la metodología de citometría de flujo
La citometría de flujo es un componente integral en varias áreas clínicas, incluyendo el diagnóstico, los planes de tratamiento y la enfermedad sistémica ya sea estática o progresiva. A medida que aprendemos más sobre las aplicaciones prácticas para el uso de la citometría de flujo, la base de conocimientos se amplía aún más. Ahora, más que nunca, los investigadores están muy entusiasmados por poder aprender más sobre las complejidades de ciertas enfermedades y condiciones. Esto ha conducido a un rápido cambio en el diagnóstico de patrones y ha alterado drásticamente los enfoques médicos para el tratamiento de enfermedades como el cáncer6.
La metodología de la citometría de flujo a menudo está involucrada con otros patrones de pruebas integrales como el examen morfológico. En muchos casos, las neoplasias hematológicas presentan cambios morfológicos específicos, y la citometría de flujo proporciona una mayor especificidad y ayuda a los patólogos a ampliar las anomalías del tejido u otras enfermedades avanzadas. La citometría de flujo, en algunos casos, puede predeterminar la recurrencia del cáncer antes de que se detecten los cambios morfológicos7.
Algunas de las principales aplicaciones utilizadas en el ámbito de los entornos clínicos modernos tanto terapéuticos como orientados a la investigación incluyen:
- Expresión de proteínas-en toda la célula, incluso en el núcleo
- Modificaciones postraduccionales de proteínas-incluye proteínas escindidas y fosforiladas
- RNA-incluyendo tanto miRNA, y transcripciones de ARNm
- Estado de salud de las células-detección de células apoptóticas o muerte celular
- Estado del ciclo celular-proporcionando una poderosa herramienta para evaluar las células en fase G0/G1 frente a la fase S, G2, o poliploidía, incluyendo el análisis de la proliferación y la activación celular
- Identificación y caracterización de distintos subconjuntos de células dentro de una muestra heterogénea-incluyendo la distinción de las células de memoria efectoras centrales de las células T agotadas o de las células T reguladoras
Resumiendo
Los principios básicos de la citometría de flujo han cambiado poco en la última década, pero las aplicaciones de esta tecnología han evolucionado mucho. Los fundamentos de la citometría de flujo han sido coherentes con su función principal, que consiste en interrogar con un láser a células o partículas individuales en un flujo a medida que las células pasan por delante de un conjunto de detectores estacionarios. Cada vez se detectan más colores de fluorescencia en los citómetros, junto con la clasificación de alta velocidad y la función analítica8.
La citometría de flujo desempeña un papel integral en la investigación de las ciencias moleculares y continúa evolucionando a un ritmo rápido. Existen varios citómetros de flujo comerciales en el mercado. Suelen funcionar según el mismo principio básico, pero existen importantes diferencias en su diseño y en los conceptos sobre la alineación y la integración de otros componentes.
Pronto, en el horizonte, se introducirá una instrumentación 3D que se incorporará a un instrumento híbrido propio producido por NanoCellect Biomedical, el WOLF Cell Sorter. También podemos esperar el desarrollo de sondas fluorescentes de espectro estrecho, la integración de técnicas de biología molecular con la citometría de flujo y la evaluación de marcadores libres de células, como las citoquinas, serán componentes clave en la evolución continua del análisis de citometría de flujo y la tecnología de ensayo celular.
Fuentes:
1 http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221
2 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/
3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959
4 https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26
5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250
6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/
7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/
8 https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543