Materiales y métodos
Obtuvimos la aprobación de la junta de revisión institucional de protección de sujetos humanos del Laboratorio de Investigación de la Fuerza Aérea, número de protocolo FWR20180101H. Los sujetos fueron informados individualmente y firmaron documentos de consentimiento presenciados por un tercero. Se recogieron muestras de cinco sujetos utilizando el hisopo de recogida de muestras Epicentre Catch-All™ (Epicentre, Madison, WI) y el kit de recogida de ADN de saliva Isohelix GeneFiX™ (Isohelix, Kent, UK). Todas las muestras recogidas se tomaron el mismo día, con un intervalo de al menos 30 minutos entre cada recogida, o en el transcurso de 3 días, debido a las limitaciones de tiempo de los participantes. Se recogieron dos hisopos por sujeto; cada hisopo se frotó contra el interior de cada mejilla durante 10-15 s. Se recogieron seis muestras de saliva: según las instrucciones del fabricante, inmediatamente después de beber agua, almorzar, beber un refresco carbonatado, beber una bebida deportiva o beber café.
Los hisopos se extrajeron utilizando la solución de extracción de ADN Epicentre QuickExtract™ 1.0 (Epicentre). El primer hisopo se procesó tal cual y el segundo se purificó utilizando el sistema de purificación de ADN genómico Wizard™ SV (Promega, Madison, WI) utilizando el protocolo de microcentrífuga para la purificación de ADN genómico a partir de lisados de células de cultivo de tejidos. No hubo ningún paso de lavado celular porque las muestras ya estaban en solución. Las muestras de saliva se extrajeron utilizando el QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) con el protocolo de extracción de saliva modificado por el fabricante.
Las muestras se cuantificaron utilizando el NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y el Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific) con el Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit. También se utilizó el NanoDrop para evaluar la pureza de las muestras comparando los valores de absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280). Ambos se utilizaron según los protocolos del fabricante. Las muestras extraídas, normalizadas a 10 ng/μL según las concentraciones Qubit, se analizaron utilizando un gel de agarosa prefabricado E-Gel® al 2% (Thermo Fisher Scientific). Se utilizó el bioanalizador Agilent (Agilent, Santa Clara, CA) junto con el chip de ADN de alta sensibilidad para determinar la calidad del ADN extraído.
Las muestras se analizaron entonces en el sistema de PCR rápida en tiempo real Applied Biosystems™ 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) para analizar dos marcadores genéticos vinculados a las alergias al cacahuete: rs7192 y rs9275596 . La genotipificación se llevó a cabo con un ajuste de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de rampa rápida de 60 °C durante 1 minuto, un ciclo de mantenimiento de 95 °C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y luego 60 °C durante 1 minuto, y una post-PCR a 60 °C durante 1 minuto. Se utilizó la mezcla maestra TaqPath ProAmp (Thermo Fisher Scientific). Los ensayos de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) se utilizaron a la mitad de la concentración recomendada por el fabricante. El volumen final fue de 10 µL.
Resultados
El método de extracción con hisopo utilizando la solución QuickExtract dio como resultado una gran cantidad de ADN. Los valores de ADN obtenidos del hisopo sin ningún otro procesamiento oscilaron entre 1,38 y 54,2 pg/µL, según lo determinado por el Bioanalizador (archivo adicional 1: Tabla S1). Sin embargo, resultados anteriores no comunicados de nuestro laboratorio demostraron que los experimentos de secuenciación se inhibían cuando las bibliotecas se preparaban directamente a partir de las extracciones de la solución QuickExtract. Por lo tanto, purificamos estas muestras utilizando un protocolo de purificación en columna Wizard, disminuyendo la concentración, como se esperaba (que oscilaba entre 2,59 y 38,2 pg/µL), y mejorando las relaciones A260/A280 hasta acercarse al rango generalmente aceptado (1,8-2,1).
Las muestras de saliva recogidas según el protocolo del fabricante y extraídas utilizando el QIAamp Blood DNA Kit tenían un rango de 1,01 ng/μL a 8,20 ng/μL. La pureza indicada por la medición A260/A280 estaba típicamente en el rango para el ADN (véase el archivo adicional 1: Tabla S1). Ninguna de las muestras de saliva recogidas después de que los sujetos hubieran bebido varias bebidas o hubieran almorzado mostró concentraciones de ADN y lecturas de pureza significativamente diferentes de las recogidas utilizando el protocolo del fabricante (30 min de ayuno) (Fig. 1).
Concentraciones de las muestras por tres métodos diferentes de cuantificación (Nanodrop, Qubit y Bioanalyzer) y una evaluación de la pureza por la relación de absorbancia a 260 y 280 nm. Las condiciones «CatchAll» son las dos colecciones de hisopos y «Genefix» son las seis colecciones de escupitajos. Las concentraciones de las muestras de los hisopos se representan en el eje y de la izquierda, mientras que las concentraciones de las muestras de los escupitajos se representan en el eje y de la derecha. Se utilizaron dos ejes ya que la muestra de hisopo sin purificación secundaria (CatchAll + QuickExtract) contiene contaminantes que absorben a 260 nm en el Nanodrop. *p < 0,05, ***p < 0,001
Las muestras extraídas normalizadas a 10 ng/μL según las lecturas de Qubit 4.0 se ejecutaron en un E-Gel al 2% utilizando una escalera de 1 kb (archivo adicional 1: Figura S1). Esperábamos ver una banda hacia la parte superior del gel que representara una extracción de ADN de alto peso molecular. Como se esperaba, el ADN extraído de los distintos métodos de recogida de saliva era de alto peso molecular. A pesar de estar normalizado a una entrada de 10 ng/µL, la mayoría de las muestras de hisopo no dieron lugar a una banda clara, lo que sugiere la presencia de interferencias de carga o algún otro problema sistemático.
Un análisis más detallado del tamaño y la pureza en un Bioanalizador mostró que todas las muestras y todas las condiciones tenían predominantemente ADN de alto peso molecular y concentraciones similares (Fig. 2). Aparte de la ya mencionada baja concentración tras la purificación de la extracción del hisopo, no hay tendencias relacionadas con la condición de recogida (comer o beber) en la calidad, el tamaño o la concentración del ADN que se hagan evidentes al analizar las señales del electroferograma. Sí parece haber un cambio dependiente del sujeto, aunque este fenómeno no se investigó más.
Trazas del electroferograma del bioanalizador de las muestras de saliva. Cada sujeto se muestra individualmente con colores que representan las condiciones de recogida: siguiendo las instrucciones del fabricante (rojo), después de consumir agua (azul), después de comer (verde), después de consumir una bebida carbonatada (cian), después de consumir una bebida deportiva (magenta) y después de consumir café (naranja)
Por último, utilizamos el genotipado de SNP para comprobar la idoneidad del ADN extraído para los procesos moleculares posteriores (Fig. 3). Todas las muestras extraídas de todos los sujetos pudieron producir con éxito resultados utilizables para la genotipificación de dos SNP asociados con las alergias a los cacahuetes, con la excepción de una de las muestras de hisopo purificadas (sujeto 5B).
Parcelas de discriminación alélica para rs7192 y rs9275596. La «X» indica una muestra que no se amplificó (sujeto 5B). Las muestras rojas/inferiores son homocigotas para el alelo 1 (eje X), las muestras verdes/centrales son heterocigotas y las muestras azules/izquierdas son homocigotas para el alelo 2 (eje Y)
Discusión
Cuando se diseña un estudio de investigación genética, un producto comercial o una intervención sanitaria, la facilidad de uso y la conformidad del usuario final son dos consideraciones críticas. Los dispositivos de extracción de sangre que requieren pinchazos en la piel pueden tener un menor cumplimiento debido a la aversión al dolor. A partir de las observaciones en nuestro laboratorio, hemos notado anecdóticamente una menor tasa de inscripción en los estudios cuando la diferencia principal es la venopunción frente a la toma de muestras de saliva. No hemos llevado a cabo un estudio controlado para investigar este fenómeno, sino que hemos optado por proceder a la toma de muestras de saliva basándonos en la facilidad de uso, el aparente aumento de las inscripciones y el tipo de estudios de investigación que se realizan predominantemente en nuestro laboratorio. Como nuestros estudios implican la autoadministración de la muestra de saliva, buscamos determinar si hay una cantidad y calidad suficiente de ADN presente para su uso en aplicaciones moleculares posteriores tras varias condiciones probables de recogida en el campo, principalmente diferentes ingestas de alimentos y bebidas. El diseño del estudio no tenía como objetivo la comparación cruzada entre individuos, sino más bien comparar la variabilidad intra-sujeto de la recogida de muestras. Con este objetivo en mente, no observamos ninguna disminución significativa en las cantidades de ADN causada por la variación de las instrucciones del fabricante de ayunar durante 30 minutos antes de la recogida.
Aunque la cantidad de ADN es importante, lo más crítico para las técnicas avanzadas de biología molecular es la calidad del ADN obtenido. En nuestro estudio, descubrimos que la recogida de muestras de saliva después de comer y beber no afectaba al rendimiento del ADN de alto peso molecular. Este tipo de ADN es fundamental para la secuenciación de nueva generación, la exploración de matrices y el genotipado por PCR. Además, una prueba experimental en la que se utilizaron dos objetivos genéticos independientes en el genotipado por PCR demostró que estas muestras eran aptas para los análisis moleculares.
Nuestro objetivo previsto con este estudio era ver si la calidad y la cantidad del ADN de la recogida de saliva mediante un kit de recogida de ADN de saliva se vería afectada por no seguir las instrucciones del fabricante, es decir, por beber o comer justo antes de la recogida. En consonancia con nuestra hipótesis, no observamos ninguna diferencia en la cantidad o la calidad del ADN aislado.
Conclusión
Los estudios genéticos se han extendido más allá del ámbito de un esfuerzo puramente científico y ahora son comunes entre el público consumidor. Para optimizar las muestras humanas para estos estudios, los fabricantes se esfuerzan por desarrollar métodos de recogida sencillos y robustos. La toma de muestras de saliva es el menos invasivo de estos métodos, produce un ADN de alta calidad y proporciona una excelente estabilidad del producto. Nuestro estudio del ADN obtenido de la saliva tras el consumo de varias bebidas y/o aperitivos ha demostrado que no hay una diferencia significativa en la cantidad y calidad del ADN recogido utilizando el kit de recogida de ADN de saliva Isohelix GeneFiX (Isohelix) cuando las muestras no se recogen según el protocolo del fabricante. Aunque el tamaño de la muestra de este estudio es pequeño, las observaciones de otros estudios realizados en nuestro laboratorio coinciden con los resultados de nuestra comparación sistemática aquí presentada. Por lo tanto, concluimos que la recogida de saliva es una forma sólida y no invasiva de recoger muestras tanto en el laboratorio como en el campo, y que el requisito de 30 minutos de abstención de alimentos y bebidas es un ideal y no un absoluto.