Virulenzabschwächung
Es ist auch wichtig, Bakterien so zu entwickeln, dass ihre Virulenz gegenüber dem Immunsystem des Wirts minimiert wird46,47. Es sollte beachtet werden, dass einige bakterielle Virulenzfaktoren für ihre intrinsische Antitumoraktivität verantwortlich sein können. Daher muss eine Abschwächung erreicht werden, ohne ihre Antitumoraktivität zu beeinträchtigen. So wurden beispielsweise bei humanen Krankheitserregern tödlich toxische Stämme durch Deletion der wichtigsten Virulenzgene in weitgehend sichere Stämme umgewandelt2,10,21. VNP20009, ein abgeschwächter S. Typhimurium-Stamm, wurde durch Deletion der msbB- und purI-Gene erzeugt; dieser Stamm wurde ausgiebig an tumortragenden Mäusen untersucht und zeigt eine vielversprechende Tumorspezifität und tumorhemmende Wirkung28,48,49,50. Die Deletion von msbB in der Gattung Salmonella führt zu einer Myristoylierung der Lipid-A-Komponente von LPS, was zu einer deutlichen Verringerung der LPS-bedingten Induktion von TNF führt und das Risiko eines septischen Schocks verringern kann51. VNP20009 wurde anschließend in Phase-I-Studien bei Krebspatienten getestet51,52,53,54. Enttäuschend ist, dass VNP20009 keine Tumorspezifität aufwies und keinen eindeutigen Nutzen für die Tumorbehandlung bei den Patienten hatte52,54,55. Dieser Misserfolg könnte auf das von VNP20009 produzierte penta-acylierte Lipid A zurückzuführen sein, das ein TLR4-Antagonist ist56. Um die LPS-Struktur zu verändern und die Antitumoraktivität aufrechtzuerhalten, wurden mutierte Salmonella-Stämme erzeugt, die durch Deletion der Gene pagP, pagL und lpxR ein homologes hexa-acyliertes Lipid A produzieren, das eine hohe Affinität zu TLR4 aufweist47,57,58. Diese Mutationen hatten keinen Einfluss auf die Virulenz im msbB-Mutantenhintergrund59. Mutationen in rfaG und rfaD führen zur Produktion von verkürztem LPS, was zu einer abgeschwächten Toxizität und Tumorspezifität führt; die Antitumorwirkung dieser Bakterien war jedoch ebenfalls vermindert. Durch chromosomale Integration der LPS-Biosynthesegene in den araBAD-Locus wurden diese Einschränkungen überwunden, und der mutierte Stamm zeigte eine abgeschwächte Virulenz und therapeutische Wirkung60.
Ein weiterer ungiftiger Salmonella-Stamm wurde durch Herunterregulieren der Expression von Endotoxin-assoziierten Genen oder durch Hemmung ihrer funktionellen Aktivität erzeugt. Salmonella relA- und spoT-mutierte Stämme, die in der Synthese von ppGpp, einem Signalmolekül, das an der Expression von Toxin-Genen beteiligt ist, defekt sind, wiesen eine vernachlässigbare Toxizität auf. Der LD50-Wert des ΔppGpp-Stammes war im Vergleich zu Wildtyp-Stämmen um das 105-106-Fache erhöht61. Der ΔppGpp-Stamm hatte eine ausgezeichnete Antitumoraktivität, da er in der Lage war, das Inflammasom (NLRP3, IPAF) zu aktivieren und die Expression mehrerer proinflammatorischer Zytokine (IL-1β, IL-18 und TNF-α) zu induzieren21. Die Deletion der phoP- und phoQ-Gene hatte keinen Einfluss auf die Antitumoraktivität von Salmonella, während die Deletionen ihre Virulenz in normalem Gewebe verringerten62. Stämme, die diese Mutationen tragen, wurden zur Herstellung eines ausgezeichneten Impfstoffs verwendet und werden seit kurzem als Trägersystem für Tumortherapeutika eingesetzt63,64,65,66,67. Die orale Verabreichung eines mutierten S. Typhimurium-Stammes, dem es an der Synthese des ZnuABC-Zink-Transportsystems mangelt, kann eine wirksame Immunantwort auslösen, die Mäuse vor Darminfektionen schützt68. Mutationen in den Genen, die für DNA-Adeninmethylase, Adenylatzyklase und zyklisches Adenosinmonophosphat-Rezeptorprotein kodieren, die an verschiedenen pathogenen Genregulationswegen beteiligt sind, könnten die bakterielle Toxizität in vivo verringern69. Die Deletion des gmd-Gens in Salmonella hemmte die Biofilmbildung und löste in einem frühen Stadium der Infektion eine Immunreaktion aus28,57. Außerdem verringerte die Deletion von htrA, STM3120 und slyA das bakterielle Überleben in Makrophagen sowie die krebshemmende Wirkung der Bakterien erheblich70. Die Deletion von Genen, die an der Zellinvasion beteiligt sind, kann die Zytotoxizität von Listeria monocytogenes abschwächen. Die Deletion von Hly verursacht Defekte bei der Freisetzung von Phagolysosomen52,71,72. Mutierten Stämmen von L. monocytogenes, denen actA oder ActA PEST-ähnliche Sequenzen fehlen, mangelt es auch an der Fähigkeit zur interzellulären Diffusion73,74, und mutierte Stämme, denen inlA und inlB fehlen, weisen einen Invasionsdefekt auf75,76.
Die Einführung spezifischer nährstoffabhängiger Mutationen in Bakterien ist ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der tumorspezifischen Proliferation bei gleichzeitiger Abschwächung der Virulenz. Der A1-R Salmonella-Stamm, der auxotroph für Leucin und Arginin ist, kolonisiert bevorzugt Tumore, zeigt Antitumoreffekte und erhöht die Empfindlichkeit von Tumoren gegenüber Chemotherapie22,77,78,79. Ein L. monocytogenes-Stamm wurde durch Inaktivierung des dal/dat-Locus so verändert, dass er auxotroph für den Zellwandbestandteil d-Alanin ist. Dieser mutierte Stamm war stark attenuiert und konnte zytotoxische T-Lymphozyten induzieren22,80. Die Salmonella-Stämme SL3261 und SL7207, die eine aroA-Deletion tragen, und BRD509, ein aroA/aroD-Doppelmutantenstamm, der auxotroph für aromatische Aminosäuren ist, sind stark attenuiert und verbreiten sich nicht frei im Wirt29,57,81,82,83,84,85. Ein anderer S. Typhimurium-Stamm, YB1, der von SL7207 abgeleitet wurde, indem das essenzielle Gen asd unter die Kontrolle eines Hypoxie-induzierten Promotors gestellt wurde, konnte in normalem Gewebe ohne exogene Zufuhr von Diaminopimelinsäure nicht überleben, obwohl er immer noch hypoxische Tumore kolonisieren konnte; daher verursacht dieser Stamm geringere Schäden an normalem Gewebe, während er seine Fähigkeit zur Tumorbekämpfung behält21,47,86,87. Darüber hinaus führte die Deletion der purI- und purD-Gene zu einem Bedarf an exogenem Adenin, was die Fähigkeit der Bakterien zur effizienten Vermehrung in purinreichen Regionen, wie z. B. Tumorgewebe, erhöhte2,88. Die für die Krebstherapie verwendeten abgeschwächten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Verbesserung des Tumor-Targetings
Die zur Verbesserung des bakteriellen Tumor-Targetings verwendeten technischen Ansätze können sowohl die Sicherheit als auch die Antitumorwirksamkeit erhöhen. Bei einem Ansatz zur Erreichung dieser Ziele wurde der ppGpp-defiziente Stamm SHJ2037 gentechnisch so verändert, dass er tumorspezifische Liganden auf der Zelloberfläche aufweist. Ein Arg-Gly-Asp-Peptid, das an αvβ3-Integrin bindet, wurde an das Außenmembranprotein A fusioniert, um seine Expression auf der Bakterienoberfläche zu steuern89. Der resultierende Stamm zeigte eine verbesserte Tumorspezifität und eine deutlich erhöhte Antitumoraktivität in MDA-MB-231 Brustkrebszellen und MDA-MB-435 Melanom-Xenografts, die αvβ3-Integrin überexprimieren. Die Bakterien wurden auch so manipuliert, dass sie gegen tumorassoziierte Antigene wie das karzinoembryonale Antigen oder das lymphomassoziierte Antigen CD20 gerichtet sind. Diese Stämme hatten eine wirksame krebshemmende Wirkung und verringerten die unspezifische bakterielle Anreicherung in Leber und Milz90,91. Unter Ausnutzung der Biotin-Streptavidin-Bindung wurde ein L. monocytogenes-Stamm konstruiert, bei dem die Zellen mit plasmidbeladenen Nanopartikeln beschichtet waren, die ein Biolumineszenz-Gen exprimierten. Dieser als Mikroroboter bezeichnete Stamm lieferte funktionelle Nukleinsäuremoleküle an solide Tumore und konnte mittels Biolumineszenz-Bildgebung aufgespürt werden60,92,93. Eine interessante Alternative, die die Tumorselektivität erhöhen kann, ist die Darstellung synthetischer Adhäsine (SAs) auf der Oberfläche von E. coli. SAs haben eine modulare Struktur, die aus einer stabilen β-Domäne, die für die Verankerung in der äußeren Membran erforderlich ist, und oberflächenexponierten Immunglobulin-Domänen mit hoher Affinität und Spezifität besteht, die aus großen Bibliotheken ausgewählt werden können94. Probiotische Stämme zeigten eine verbesserte Tumorspezifität, indem sie die Injektionskapazität der Bakterien erhöhten, ohne ihre intrinsischen Eigenschaften abzuschwächen95,96,97,98,99. Probiotische E. coli Symbioflor-2-Zellen wurden sehr schnell aus Milz und Leber entfernt und überlebten nur in einem Tumor, was auf ein effizientes Tumortargeting hinweist. Mäuse, die mit einem probiotischen Salmonella-Stamm infiziert wurden, tolerierten eine hohe Bakterienlast ohne pathologische Symptome; allerdings sind Verbesserungen des Systems zur Verabreichung der Nutzlast erforderlich, da der Stamm trotz seiner ausgezeichneten Sicherheit in vivo nur eine geringe therapeutische Wirksamkeit aufweist57.
Strategien zur Expression von Arzneimitteln
Die meisten Nutzlasten, die von auf Tumore abzielenden Bakterien abgegeben werden, sind sowohl für Tumorzellen als auch für normale Zellen toxisch; daher wird eine strenge Kontrolle ihrer Produktion einer konstitutiven Expression vorgezogen. Die präzise Auslösung der Expression von Nutzlasten kann deren therapeutische Wirkung maximieren und gleichzeitig die systemische Toxizität minimieren. Ein kontrollierbares Genexpressionssystem kann theoretisch durch Einfügen einer spezifischen Promotorsequenz stromaufwärts eines arzneimittelkodierenden Gens konstruiert werden, wodurch die Transkriptionskontrolle durch externe Signale ermöglicht wird. Ein solches System ermöglicht es, den Zeitpunkt und den Ort der Arzneimittelproduktion in vivo zu steuern. Die Strategien für diese Art der Genregulierung, oder Triggerung, gehören meist zu den folgenden drei Kategorien: interne Triggerung, Selbsttriggerung (Quorum Sensing-QS) und externe Triggerung100.
Im Gegensatz zu normalem Gewebe haben TMEs besondere Eigenschaften, einschließlich Hypoxie, Azidose und Nekrose, die Bakterien wahrnehmen und nutzen können, um die Tumorspezifität zu verbessern101. So werden beispielsweise Hypoxie-induzierbare Promotoren wie die von HIP-1 und pepT durch Fumarat- und Nitratreduktion in der hypoxischen Umgebung im Tumorgewebe aktiviert102,103,104. Dieses Hypoxie-induzierbare Expressionssystem wurde so konzipiert, dass es nur unter anaeroben Bedingungen für die Expression essenzieller Gene wie z. B. sd funktioniert105. Flentie et al. identifizierten fünf Promotorsequenzen, die spezifisch durch die sauren Mikroumgebungen aktiviert werden, die mit Krebszellen in vitro und mit Tumoren in vivo verbunden sind. Acidose-spezifische Promotoren wurden mit Hilfe eines speziell entwickelten promotorlosen Transposon-Reporters, der für bakterielle Luziferase kodiert, identifiziert, um eine Bibliothek von 7400 unabhängigen Salmonella-Transposon-Insertionsmutanten in Kokultur mit Melanom- oder Kolonkarzinomzellen zu untersuchen. Ein abgeschwächter Salmonella-Stamm, der Shiga-Toxin unter der Kontrolle eines durch einen niedrigen pH-Wert induzierten Promotors exprimiert, zeigte eine starke Tumorselektivität und Antitumoraktivität106. Ein Glukosesensor wurde in E. coli durch synthetische Fusion des Trg-Chemorezeptors mit dem EnvZ-Osmosensor konstruiert. In diesem Konstrukt steuert Trg die periplasmatische und transmembrane Domäne sowie ein kurzes zytoplasmatisches Segment bei, und EnvZ steuert die zytoplasmatische Kinase/Phosphatase-Domäne bei. Das gentechnisch veränderte Bakterium misst den Glukosespiegel in Tumorzellen und reagiert auf die Stoffwechselaktivität des Tumors, was möglicherweise zu seiner therapeutischen Wirkung führt. Diese Eigenschaften sind wahrscheinlich auch bei anderen Mitgliedern dieser Sensorfamilie erhalten107.
Bakterien können sich in TMEs in einem Verhältnis von mehr als 10.000 zwischen Tumor und normalem Gewebe ansiedeln und vermehren; daher kann QS als Schalter für die Genexpression verwendet werden108,109. Ein nützliches QS-System wird durch einen Autoinduktor, das synthetische LuxI-Protein, und das Transkriptionsregulationsprotein LuxR reguliert. Das von LuxI produzierte Acylhomoserinlacton (AHL), das von der Bakteriendichte abhängt, aktiviert LuxR und fördert die Transkription seiner Zielgene. Von der AHL-Konzentration abhängige QS-Systeme wurden erfolgreich eingesetzt, um heterologe Proteine in bakterienkolonisierenden Tumoren hoch zu exprimieren90,109,110,111. Der QS-Ansatz wurde zur Einführung einer Vielzahl von Genschaltungen verwendet. Die Einführung eines synchronisierten Lyseschaltkreises in Bakterien verbesserte beispielsweise die Wirksamkeit gegen Krebs, indem sie die Freisetzung von Medikamenten durch die periodische Einführung des Autoinduktors (positive Rückkopplung) und die daraus resultierende Aktivierung eines Bakteriophagen-Lysegens (negative Rückkopplung) ermöglichte108.
Neben der internen und der Selbstauslösung kann die Expression von Genschaltkreisen auch durch externe Auslöser gesteuert werden, darunter Chemikalien wie l-Arabinose, Salicylsäure (ASA) und Tetracyclin. Die Transkription vom PBAD-Promotor kann über eine Wechselwirkung zwischen dem AraC-Repressor und l-Arabinose gesteuert werden5,112. In einem abgeschwächten Salmonella-Stamm konnte die pBAD-gesteuerte Expression von therapeutischen Nutzlasten aus einem Plasmid durch intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung von L-Arabinose gesteuert werden20,21,113. Ein Salmonella-Stamm mit einer Mutation im Ara-Operon, die zu einer Beeinträchtigung des L-Arabinose-Stoffwechsels führt, zeigt eine starke Aktivierung des PBAD-Promotors114. Im ASA-Expressionssystem wird die Genregulation durch den XylS2-abhängigen Pm-Promotor gesteuert115,116,117. Ein abgeschwächter Salmonella-Stamm, der ein ASA-Expressionssystem auf einem Plasmid oder auf dem Chromosom beherbergt, ermöglichte eine effiziente Regulierung von Genen, die Prodrug-Converting-Enzyme kodieren (siehe unten), und führte zu einer deutlichen Verringerung des Tumorwachstums115. Das pTet-Expressionssystem wird gleichzeitig durch die bidirektionalen Promotoren PtetA und PtetR reguliert, die durch Tetracyclin oder Doxycyclin induziert werden118. In einer präklinischen Studie wurden unter diesen bidirektionalen Promotoren ein Reportergen und ein therapeutisches Gen eingefügt, um den Targeting-Prozess sichtbar zu machen bzw. therapeutische Medikamente zu verabreichen7. Dieses chemisch induzierbare System wird dosis- und zeitabhängig reguliert119; daher können Ungenauigkeiten beim Zeitpunkt der Induktorverabreichung oder bei der Induktordosis zu einer unspezifischen oder suboptimalen Expression der Zielmoleküle in TMEs führen. Ein alternatives induzierbares System verwendet den durch Strahlung induzierbaren recA-Promotor48. Strahlung verursacht DNA-Schäden, die die Transkription der Gene unter der Kontrolle des recA-Promotors aktivieren. Diese Methode kombiniert die therapeutische Wirkung der Strahlentherapie mit der strahlenabhängigen Induktion der Expression von Krebsgenen120. Die Induktion der Expression des TNF-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL) durch eine 2-Gy-Dosis von γ-Bestrahlung 48 Stunden nach Verabreichung des manipulierten Salmonellenstamms verzögerte das Wachstum von 4T1-Brustkrebszellen signifikant48. Strahlung ist vorteilhaft, weil sie in das Tumorgewebe eindringen und zur lokalen Behandlung eingesetzt werden kann. Strahlung kann jedoch auch toxisch wirken, indem sie DNA-Schäden in den gesunden Zellen um den Tumor herum hervorruft und wahrscheinlich tödliche Mutationen in den therapeutischen Bakterien verursacht, die deren therapeutische Wirkung abschwächen könnten101.
Wirkstoffabgabe
Trotz der Studien über die Antitumorwirkung von Bakterien reichen Bakterien allein oft nicht aus, um Tumore vollständig zu unterdrücken. Um die positiven Ergebnisse der bakteriellen Krebstherapie zu verbessern, wurde die Nützlichkeit von eukaryotischen und prokaryotischen Expressionssystemen für die Verabreichung von therapeutischen Nutzlasten, einschließlich zytotoxischer Wirkstoffe, Prodrug-Converting-Enzyme, Immunregulatoren, Moleküle, die auf das Tumorstroma abzielen, und siRNAs, erforscht (siehe Tabelle 2). Die oben erörterten prokaryotischen Expressionssysteme sind der am häufigsten verwendete Ansatz, und diese Systeme beruhen auf der Transformation von Bakterien mit prokaryotischen Plasmiden, die für Zielgene kodieren70,121,122; im Gegensatz dazu beinhalten eukaryotische Expressionssysteme die Transduktion von Wirtszellen, wie Immunzellen oder Tumorzellen, mit eukaryotischen Plasmiden, die für die cDNAs der Zielgene kodieren123.
Zytotoxische Wirkstoffe
Zytotoxische Wirkstoffe, die von auf Tumore abzielenden Bakterien getragen werden, können eine intrinsische Antitumorwirkung haben. In Verbindung mit der Verwendung induzierbarer Promotoren kann die Expression zytotoxischer Wirkstoffe streng kontrolliert werden, um ihre toxischen Auswirkungen auf normales Gewebe zu verringern. Cytolysin A (ClyA), ein 34 kDa großes, porenbildendes hämolytisches Protein, das von E. coli, S. Typhimurium und Paratyphi A produziert wird, kann ohne posttranslationale Modifikation an die bakterielle Oberfläche transportiert und sezerniert werden. Mehrere Bakterienstämme, wie E. coli und abgeschwächtes S. Typhimurium, wurden so manipuliert, dass sie ClyA von einem konstitutiven Promotor5 oder von induzierbaren Promotoren, die durch Arabinose5 oder Doxycyclin7 aktiviert werden, exprimieren, und diese Stämme haben ausgezeichnete tumorhemmende Wirkungen gezeigt.
Die Induktion der Apoptose in Tumorzellen ist eine vielversprechende Krebstherapie-Strategie. Apoptin, ein vom Hühneranämie-Virus abgeleitetes Protein, induziert selektiv die Apoptose in einer großen Anzahl menschlicher Krebszelltypen über einen p53-unabhängigen, Bcl-2-unempfindlichen Weg, ohne Auswirkungen auf normales Gewebe124. Durch die Transformation eines Apoptin kodierenden eukaryotischen Expressionsplasmids (pCDNA3.1) in einen abgeschwächten S. Typhimurium-Stamm beobachteten Wen et al. bei Mäusen, die an menschlichem Kehlkopfkrebs erkrankt waren, eine signifikante Tumorregression bei minimaler systemischer Toxizität65. Zu den anderen zytotoxischen Wirkstoffen, die in ähnlicher Weise zur Auslösung der Apoptose eingesetzt werden können, gehören drei Mitglieder der TNF-α-Familie (TNF-α, TRAIL und der Fas-Ligand); aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit und Hepatotoxizität ist der Nutzen dieser zytotoxischen Liganden jedoch durch ihre unzureichende Tumorexposition und ihre schädlichen Auswirkungen auf die Leberfunktion begrenzt125. Um die Bioverfügbarkeit und Nachhaltigkeit dieser Proteine zu verbessern, wurden Bakterien eingesetzt, um sie direkt in die Tumorregion zu bringen48,78,126,127. Forbes et al. entwickelten einen nicht-pathogenen S. Typhimurium-Stamm, der murines TRAIL unter der Kontrolle des durch Strahlung induzierbaren recA-Promotors exprimiert. Nach der Bestrahlung wurde TRAIL sezerniert, woraufhin es das Wachstum von Mammatumoren signifikant verzögerte und das Sterberisiko verringerte48.
Invasin, ein Yersinia-Oberflächenprotein, kann selektiv an β1-Integrin binden, um das Eindringen der Bakterien in die Wirtszellen auszulösen. Unter Verwendung eines nicht-pathogenen, rekombinanten invasiven E. coli-Stammes, der Invasin und das Modellantigen Ovalbumin sowie LLO koexprimiert, zeigten Critchley-Thorne et al., dass der manipulierte Stamm in β1-Integrin-exprimierende Zellen eindringen und Proteine an Tumore abgeben kann, um therapeutische Wirkungen bei Mäusen zu erzielen128. Azurin, ein Redox-Protein mit niedrigem Molekulargewicht, kann effizient internalisiert werden, um die Apoptose von Krebszellen einzuleiten, indem es den intrazellulären p53- und Bax-Spiegel erhöht und so die Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom c in das Zytosol induziert. Die Wirksamkeit von Azurin auf der Basis von E. coli bei der Unterdrückung des Wachstums von B16-Mausmelanomen und 4T1-Mausbrustkrebs wurde von Nissle 1917 nachgewiesen; darüber hinaus verhinderte dieser Ansatz auch die Lungenmetastasierung und stimulierte Entzündungsreaktionen29.
Prodrug-converting enzymes
Die Expression von Prodrug-converting enzymes kann Prodrugs spezifisch in der Tumorregion in zytotoxische Wirkstoffe umwandeln. Der Nutzen dieser Strategie zur Verbesserung der Wirksamkeit der Krebsbehandlung und zur Verringerung der mit der systemischen Verabreichung verbundenen Nebenwirkungen wurde untersucht. Mehrere Enzyme, die Prodrugs umwandeln, wurden von Bakterien übertragen96,129,130,131. Cytosindesaminase (CD) wandelt das ungiftige 5-Fluorcytosin (5-FC) in das Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) um. 5-FU ist hochgiftig, da es zu einem Produkt weiterverstoffwechselt wird, das die DNA- und RNA-Synthese beeinträchtigt132,133,134,135. Bei gleichzeitiger Verabreichung eines abgeschwächten S. Typhimurium-Stammes (VNP20009), der E. coli CD exprimiert, und 5-FC an Patienten wurde eine Umwandlung von 5-FC in 5-FU beobachtet, was auf eine bakterielle Produktion von funktionellem CD im Tumor hinweist54.
Das Herpes Simplex Virus Typ I Thymidinkinase/Ganciclovir (HSV1-TK/GCV) System ist eine weitere Prodrug-Converting-Enzym/Prodrug-Kombination, die für den Einsatz in der Tumortherapie umfassend untersucht wurde. Die Tumorgewebe-spezifische HSV1-TK-Expression kann den ungiftigen Vorläufer Ganciclovir in Ganciclovir-3-Phosphat umwandeln, eine toxische Substanz, die Tumorzellen abtötet. Liu et al. testeten die In-vivo-Wirksamkeit eines Bifidobacterium infantis-Stammes, der HSV1-TK und GCV für die Prodrug-Therapie in einem Rattenblasentumormodell exprimiert. Die Ergebnisse zeigten, dass dieser gezielte Ansatz das Wachstum von Rattenblasentumoren wirksam hemmen konnte, indem er die Expression von Caspase 3 erhöhte und Apoptose auslöste131. Ein anderer Stamm von E. coli DH5α, der β-Glucuronidase exprimiert, die das Glucuronid-Prodrug 9ACG in den Topoisomerase-I-Inhibitor 9-Aminocamptothecin (9AC) umwandelt, zeigte eine effiziente Tumorhemmung129. Die Verwendung von abgeschwächtem S. Typhimurium VNP20009 als Vektor zur Verabreichung von Carboxypeptidase G2 zeigte in Verbindung mit der Verabreichung von Prodrugs eine verstärkte Antitumor-Wirksamkeit130.
Immunmodulatoren
Zytokine können Antitumor-Effekte erzielen, indem sie die Proliferation, Aktivierung und Differenzierung von Immunzellen fördern, Apoptose in Tumorzellen induzieren und durch Antiangiogenese-Effekte auf das Tumorgefäßsystem wirken. Mehrere Zytokine, darunter GM-CSF, IL-12 und IL-18, werden bereits in klinischen Versuchen zur Krebstherapie eingesetzt136. Zytokine, die von auf den Tumor ausgerichteten Bakterien exprimiert werden, wurden gezielt in die Tumorregion gebracht, wo sie die antitumorale Immunantwort im TME verstärkten20,29,49,62,137,138,139,140. Die intravenöse Verabreichung eines IL-18-exprimierenden abgeschwächten S. Typhimurium-Stammes hemmte das Primärtumorwachstum bei Mäusen, induzierte eine massive Leukozyteninfiltration (hauptsächlich Granulozyten) und erhöhte die Rekrutierung von NK- und CD4+ T-Zellen, nicht aber von CD8+ T-Zellen. Darüber hinaus steigerte dieser Ansatz auch die Zytokinproduktion in der Tumorregion, einschließlich der von IL-1β, TNF-α, IFN-γ und GM-CSF49. IL-2 ist das am meisten untersuchte Zytokin im Zusammenhang mit bakteriellen Verabreichungssystemen. Die orale Verabreichung eines S. Typhimurium Ty21a-Stammes, der IL-2 exprimiert, hemmte das hepatozelluläre Karzinom (HCC) in Mausmodellen23,29. Flagellin, das das angeborene Immunsystem über TLR5 aktiviert, hat sich als hervorragendes Adjuvans für die Immuntherapie erwiesen141. Unsere Gruppe behandelte Mäuse, die Darmkrebs trugen, mit einem abgeschwächten ΔppGpp-S. Typhimurium-Stamm, der heterologes Flagellin exprimiert, und zeigte, dass es die Antitumor-Immunität durch Zusammenarbeit mit den TLR4- und TLR5-Signalwegen verstärkt. Dieser Ansatz fördert auch eine M2-zu-M1-Verschiebung in Makrophagen und erhöht die Stickoxidkonzentration in Tumoren20.
Engineerte Bakterien, die tumorassoziierte Antigene exprimieren, können TMEs sensibilisieren und die von regulatorischen T-Zellen hervorgerufene Selbsttoleranz überwinden, wodurch sie Effektor- und Gedächtnis-T-Zell-Reaktionen auf Antigen-produzierende Tumorzellen auslösen142,143. Es wurde über eine Reihe von Prostatakrebs-assoziierten Antigenen berichtet. Impfstoffe auf Bakterienbasis gegen prostataspezifisches Antigen (PSA) wurden in mehreren Mausmodellen getestet139,144. Die Verabreichung eines endogenen PSA-Gens unter Verwendung des abgeschwächten S. Typhimurium SL7207 hat die Immuntoleranz gegenüber Prostatastammzellantigenen bei Mäusen aufgehoben und das Tumorwachstum deutlich verzögert84. Gentherapieansätze, bei denen Antigene gegen HER-2/neu143, NY-ESO-183, Survivin88 und Mage-b145 verwendet werden, haben ebenfalls vielversprechende tumorhemmende Wirkungen gezeigt.
Großes Interesse hat sich auf dem Gebiet der Krebstherapie mit Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) entwickelt. Trotz des Erfolgs der ICB-Therapie in klinischen Studien profitieren nur einige Patienten von dieser Behandlung. Für die diesem Effekt zugrunde liegende Wirtsresistenz gibt es mehrere Gründe, von denen die immunsuppressive TME der wichtigste ist146,147. Studien zeigen, dass die Tumorkolonisierung durch Bakterien proinflammatorische Reaktionen auslösen kann, die eine erhöhte Expression von IL-1β, TNF-α und IFN-γ sowie eine Aktivierung von NK- und T-Zellen zur Folge haben; daher kann eine Kombination aus ICB- und Bakterientherapien die Wirtsresistenz überwinden131.
Targeting the tumor stroma
Die Angiogenese spielt eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum und bei der Metastasierung. Die gezielte Beeinflussung der Neovaskularisierung von Tumoren ist ein vielversprechender Ansatz für die Krebstherapie. Endostatin ist ein 20 kDa C-terminales Fragment von Typ XVIII Kollagen, das die Bildung von Tumorgefäßen dosisabhängig und ohne offensichtliche Nebenwirkungen oder Arzneimittelresistenz hemmen kann148,149. Xu et al. klonierten Endostatin und eine siRNA gegen Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (Stat3) in einen abgeschwächten S. Typhimurium-Stamm. Sie testeten dann die therapeutische Wirksamkeit des Stammes bei orthotropem HCC und zeigten, dass er die Tumorproliferation und -metastasierung hemmen, die Menge der Tumormikrovaskulatur reduzieren, die CD4+/CD8+ T-Zell-Populationen und die Expressionsniveaus verschiedener entzündlicher Zytokine (einschließlich IFN-γ und TNF-α) erhöhen und die Expression von TGF-β, regulatorischen T-Zellen und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) herunterregulieren konnte149. VEGF und sein Rezeptor (VEGFR) regulieren die Tumorangiogenese121,145. Die orale Verabreichung von abgeschwächtem S. Typhimurium SL3261, das die extrazelluläre VEGFR2-Domäne exprimiert, hemmte das Tumorwachstum, die Neovaskularisierung und die Lungenmetastasierung. Außerdem stieg der Anteil der CD4+ und CD8+ T-Zellen in der Tumorregion deutlich an121. Endoglin (CD105) ist ein Mitglied der TGF-β-Rezeptorfamilie. TGF-β1 und Hypoxie können den Endoglin-Genpromotor hochregulieren, und dieser Promotor ist in tumoralen Endothelzellen hochaktiv. Daher wurde Endoglin als ein Ziel für die Krebstherapie angesehen150. Paterson et al. verwendeten Listerien-basierte Impfstoffe gegen CD105, Lm-LLO-CD105A und Lm-LLO-CD105B zur Behandlung von Brustkrebs in einem Mausmodell. Die Impfstoffe stimulierten eine robuste Anti-Angiogenese-Wirkung und eine Antitumor-Immunantwort, die primäre und metastatische Tumore hemmte151.
Gen-Silencing
siRNAs, eine Klasse von 20-25 Basenpaar langen doppelsträngigen RNAs, die das Silencing spezifischer Zielgene vermitteln, haben einen vielversprechenden Ansatz für die Krebstherapie geliefert. Das größte Hindernis für die RNA-Interferenztherapie ist jedoch die Notwendigkeit, die siRNAs gezielt in die Tumorregion zu bringen. Auf Bakterien basierende Verabreichungssysteme für siRNAs gegen Stat363,122,149,152, IDO153,154, Survivin155, Sox230 und die mit dem Zellzyklus assoziierte Polo-like Kinase 1 (PLK1)57 wurden in Mäusetumormodellen getestet. Die orale Verabreichung eines abgeschwächten S. Typhimurium-Stamms mit einem eukaryotischen Expressionsplasmid, das für siRNA-Stat3 kodiert, steigerte die NK-Zellaktivität und die Funktion der T-Lymphozyten und erhöhte den Prozentsatz der CD8+ T-Zellen, während es die Anzahl der CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen im Tumor verringerte; diese Wirkungen führten zu einer Hemmung des Tumorwachstums und einer verlängerten Überlebenszeit der tumortragenden Mäuse122. Die Unterdrückung der Wirts-IDO-Expression mit einem S. Typhimurium VNP20009-Stamm, der shIDO exprimiert, löste eine signifikante Tumorinfiltration durch ROS-erzeugende polymorphkernige Neutrophile aus, die den intratumoralen Zelltod und eine wesentliche Kontrolle von B16F10-Melanomen153 und CT26- oder MC38-Kolorektalkarzinomen156 förderte.